本发明涉及靶标分析方法和用于该方法的靶标分析试剂盒。
背景技术：
在临床医疗、食品、环境等各种各样的领域中，进行着靶标分析。作为上述靶标的分析方法，例如已知使用免疫层析法的分析方法。但是，利用免疫层析法的分析时间需要约15分钟～约20分钟，因此要求更加迅速化。
技术实现要素：
发明所要解决的问题
因此，本发明的目的在于提供能够迅速地对靶标进行分析的新的靶标分析方法和用于该方法的靶标分析试剂盒。
用于解决问题的方法
本发明的靶标分析方法(以下也称为“分析方法”)的特征在于，包括：
使试样、与靶标结合的标记化结合核酸分子(以下也称为“结合核酸分子”)和固定化了与上述标记化结合核酸分子结合的封闭核酸分子的载体进行反应的步骤；
对上述载体的级分和上述载体以外的级分进行分离的步骤；以及
通过检测上述载体的级分和上述载体以外的级分中的至少一者中的上述标记化结合核酸分子的标记而对上述试样中的靶标进行分析的步骤。
本发明的靶标分析试剂盒(以下也称为“分析试剂盒”)的特征在于，
包含与靶标结合的标记化结合核酸分子和固定化了与上述标记化结合核酸分子结合的封闭核酸分子的载体，
该试剂盒用于上述本发明的靶标分析方法。
发明效果
根据本发明的靶标分析方法和用于该方法的分析试剂盒，能够迅速地对靶标进行分析。
附图说明
图1是示出实施例1中的发光量的图。
图2是示出实施例2中的发光量的图。
图3是示出实施例3中的发光量的图。
图4是示出实施例4中的发光量的图。
图5是示出实施例5中的发光量的图。
图6是示出实施例6中的发光量的图。
图7是示出实施例7中的发光量的图。
具体实施方式
本发明的分析方法例如包括：使上述试样与上述标记化结合核酸分子进行反应的步骤；以及使上述试样和上述标记化结合核酸分子的混合物与上述载体进行反应的步骤。
本发明的分析方法和分析试剂盒中，上述封闭核酸分子例如为包含与上述标记化结合核酸分子互补的碱基序列的核酸分子。
本发明的分析方法和分析试剂盒中，上述封闭核酸分子例如为包含与上述标记化结合核酸分子中的与上述靶标结合的碱基序列互补的碱基序列的核酸分子。
本发明的分析方法和分析试剂盒中，上述封闭核酸分子的碱基长度例如为相对于上述标记化结合核酸分子的碱基长度为1/1～1/20的范围的碱基长度。
本发明的分析方法和分析试剂盒中，上述封闭核酸分子例如为包含由相对于上述标记化结合核酸分子的碱基序列具有5～100％的范围的互补性的碱基序列构成的多核苷酸的核酸分子。
本发明的分析方法和分析试剂盒中，上述标记化结合核酸分子例如包含下述(a)的多核苷酸。
(a)下述(a1)的多核苷酸
(a1)由序列号1或2的碱基序列构成的多核苷酸
本发明的分析方法和分析试剂盒中，上述封闭核酸分子例如包含下述(b)的多核苷酸。
(b)下述(b1)的多核苷酸
(b1)由序列号3或4的碱基序列构成的多核苷酸
本发明的分析方法和分析试剂盒中，上述载体例如为珠，优选为聚苯乙烯制珠。上述珠例如为磁性珠。
本发明的分析方法中，例如，通过利用磁性体分离上述磁性珠而将上述磁性珠的级分与上述磁性珠以外的级分分离。
本发明的分析方法中，上述标记例如为酶，对上述载体的级分和上述载体以外的级分中的至少一者中的上述标记化结合核酸分子的酶反应进行检测，优选在上述酶的底物的存在下对上述酶反应进行检测。
本发明的分析方法中，上述酶例如为荧光素酶。
本发明的分析方法中，上述试样例如为食品来源试样。
本发明的分析方法和分析试剂盒中，上述靶标例如为花生变应原。上述花生变应原例如为伴花生球蛋白(conarachin)或其亚基。上述亚基例如为arah1。
本发明的分析方法和分析试剂盒中，上述花生变应原例如为未变性变应原或加热变性变应原。
本发明的分析试剂盒中，上述标记例如为酶，优选为荧光素酶。
本发明的分析试剂盒中，例如进一步包含上述酶的底物。
<靶标分析方法>
如上所述，本发明的靶标分析方法的特征在于，包括：使试样、与靶标结合的标记化结合核酸分子和固定化了与上述标记化结合核酸分子结合的封闭核酸分子的载体进行反应的步骤(反应步骤)；对上述载体的级分和上述载体以外的级分进行分离的步骤(分离步骤)；以及通过检测上述载体的级分和上述载体以外的级分中的至少一者中的上述标记化结合核酸分子的标记而对上述试样中的靶标进行分析的步骤(分析步骤)。
本发明的分析方法的特征在于，使用上述标记化结合核酸分子和固定化了上述封闭核酸分子的载体，进行上述反应步骤、上述分离步骤以及上述分析步骤，其他的步骤和条件没有特别限制。根据本发明的分析方法，例如能够以约3分钟这样极短的时间且以优良的分析灵敏度对靶标进行分析。另外，根据本发明的分析方法，虽然机制尚不明确，但例如能够抑制上述结合核酸分子的非特异性结合，因此，例如能够以优良的分析精度(特异性)对靶标进行分析。
本发明的分析方法例如可以为对上述试样中的靶标的有无进行分析的定性分析，也可以为对上述试样中的靶标的程度(例如量)进行分析的定量分析。
本发明的分析方法中，供于分析的试样没有特别限制，可以列举例如食品来源试样等。上述食品来源试样可以列举例如食品、食品原料、食品添加物、在食品加工场所或烹调场所等的附着物、清洗后的清洗液等。上述试样的形态没有特别限制，例如可以为液体试样，也可以为固体试样。在上述固体试样的情况下，例如，可以使用溶剂，制备混合液、提取液、溶解液等，将其作为上述试样来使用。上述溶剂没有特别限制，可以列举例如水、生理盐水、缓冲液等。上述试样例如可以为包含上述靶标的试样，也可以为不含上述靶标的试样，还可以为不清楚是否包含靶标的试样。
上述靶标没有特别限制，可以为任意的靶标。在上述试样为食品来源试样的情况下，上述靶标可以列举例如食物变应原，作为具体例，可以列举花生变应原、小麦变应原、乳变应原、卵变应原、荞麦变应原、虾变应原、大豆变应原等。上述花生变应原可以列举例如作为花生的主要变应原的伴花生球蛋白(conarachin)或其亚基、或者其结构域。伴花生球蛋白例如为伴花生球蛋白i和伴花生球蛋白ii(α-伴花生球蛋白)。上述伴花生球蛋白的亚基可以列举例如arah1、arah2、arah6。上述小麦变应原可以列举例如麦谷蛋白、谷蛋白、麦醇溶蛋白、麦醇溶蛋白ω5、它们的亚基、或它们的结构域。上述乳变应原可以列举例如酪蛋白、α-酪蛋白、s1-酪蛋白、β-乳球蛋白、它们的亚基、或它们的结构域。上述卵变应原可以列举例如作为卵的主要变应原的卵类粘蛋白、卵转铁蛋白(ovotransferrin)、它们的亚基、或它们的结构域。上述荞麦变应原可以列举例如fage2、其亚基、或其结构域。上述虾变应原可以列举例如作为虾的主要变应原的原肌球蛋白、其亚基、或其结构域。作为具体例，上述原肌球蛋白可以列举例如pena1、peni1、mete1等。上述大豆变应原可以列举例如作为大豆的主要变应原的β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)、其亚基、或其结构域。上述变应原例如可以为未变性变应原，也可以为加热变性变应原。
上述标记化结合核酸分子是与靶标结合且进行了标记的核酸分子。上述结合核酸分子没有特别限制，可以列举例如与上述靶标结合的适配体等。上述结合核酸分子与上述靶标的结合例如可以通过表面等离子共振分子相互作用(spr；surfaceplasmonresonance)解析等来确认。上述解析例如可以使用proteon(商品名、biorad公司制造)。
在上述靶标为花生变应原的情况下，上述结合核酸分子优选为例如与大豆蛋白质相比对于上述花生变应原更加显著地特异性结合的核酸分子。
作为具体例，与上述花生变应原结合的结合核酸分子可以列举例如包含下述(a)的多核苷酸的核酸分子。
(a)选自由下述(a1)～(a3)和(a4)组成的组中的至少一种多核苷酸
(a1)由序列号1或2的碱基序列构成的多核苷酸
(a2)由在上述(a1)中的任一碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1个或几个碱基而得到的碱基序列构成、与花生变应原结合的多核苷酸(a3)由相对于上述(a1)中的任一碱基序列具有80％以上的一致性的碱基序列构成、与花生变应原结合的多核苷酸
(a4)由与在严格条件下与由上述(a1)中的任一碱基序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸互补的碱基序列构成、与花生变应原结合的多核苷酸
上述(a1)的多核苷酸为由上述序列号1或2的碱基序列构成的多核苷酸。
花生结合核酸分子1(序列号1)
5’-ggatattgcctcgccacagttaagtcaggtggttggttatggttgggactgactctctacagggaacgctcggattatc-3’
花生结合核酸分子2(序列号2)
5’-ggtaaggtcctcagtcctcgattagctatcctcccgtttcctctactttctgcgtgatcacggcggctctcattac-3’
上述(a2)中，“1个或几个”只要为例如上述(a2)的多核苷酸与花生变应原结合的范围即可。上述“1个或几个”在上述(a1)中的任一碱基序列中例如为1～10个、1～7个、1～5个、1～3个、1或2个。本发明中，碱基数和序列数等的个数的数值范围例如是指公开了全部属于该范围的正整数。即，例如，“1～5个碱基”这样的记载是指公开了全部“1、2、3、4、5个碱基”(以下同样)。
上述(a3)中，“一致性”只要为例如上述(a3)的多核苷酸与花生变应原结合的范围即可。上述一致性例如为80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。上述一致性例如可以使用blast、fasta等解析软件，利用默认的参数计算(以下同样)。
上述(a4)中，“能够杂交的多核苷酸”例如为与上述(a1)的多核苷酸完全或部分互补的多核苷酸。上述杂交例如可以通过各种杂交分析来检测。上述杂交分析没有特别限制，例如也可以采用sambrook等编著的“分子克隆实验指南第二版(molecularcloning:alaboratorymanual2nded.)”[冷泉港实验室出版社(1989)]等中记载的方法。
上述(a4)中，“严格条件”例如可以为低严格条件、中严格条件、高严格条件中的任意一种。“低严格条件”例如为5×ssc、5×邓哈特溶液、0.5％sds、50％甲酰胺、32℃的条件。“中严格条件”例如为5×ssc、5×邓哈特溶液、0.5％sds、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严格条件”例如为5×ssc、5×邓哈特溶液、0.5％sds、50％甲酰胺、50℃的条件。严格的程度可以由本领域技术人员通过适当选择例如温度、盐浓度、探针的浓度和长度、离子强度、时间等条件来进行设定。“严格条件”例如也可以采用上述sambrook等编著的“分子克隆实验指南第二版(molecularcloning:alaboratorymanual2nded.)”[冷泉港实验室出版社(1989)]等中记载的条件。
本发明中，其他序列与某一序列互补是指例如在两者之间能够发生退火的序列。上述(a4)中，互补是指例如将两种序列进行比对时的互补性例如为90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上，优选为100％、即完全互补。另外，其他序列与某一序列互补是指，在将一个从5’侧朝向3’侧的序列与另一个从3’侧朝向5’侧的序列进行对比时，彼此的碱基是互补的。
上述结合核酸分子例如可以包含1个上述(a1)～(a4)中的任一多核苷酸的碱基序列，也可以包含多个上述多核苷酸的碱基序列。在后者的情况下，优选多个多核苷酸连结而形成单链的多核苷酸。上述多个多核苷酸例如可以分别直接连结，也可以借助接头分别间接地连结。关于上述接头，在下文中记述。上述多核苷酸优选在各自的末端直接地或间接地进行连结。上述多个多核苷酸例如可以相同，也可以不同。上述多个多核苷酸例如优选相同。在包含多个上述多核苷酸的情况下，上述多核苷酸的数量没有特别限制，例如为2以上，具体而言，例如为2～20、2～10、2或3。
上述标记化结合核酸分子例如利用标记物质进行了标记。上述标记物质没有特别限制，可以列举例如酶、荧光物质、色素、同位素等。上述酶没有特别限制，可以列举例如荧光素酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸苷酶等，从分析灵敏度提高的方面考虑，优选为荧光素酶。上述荧光物质可以列举例如芘、tamra、荧光素、cy(注册商标)3色素、cy(注册商标)5色素、fam色素、罗丹明色素、德克萨斯红(texasred)色素、joe、max、hex、tye等荧光团，上述色素可以列举例如alexa(注册商标)488、alexa(注册商标)647等alexa色素等。
上述标记物质例如优选与上述结合核酸分子的5’末端和3’末端中的至少一者进行结合，更优选为5’末端。上述标记物质例如可以直接与上述结合核酸分子连结，也可以借助接头间接地连结。
上述接头没有特别限制，可以列举例如非核酸分子或核酸分子。在前者的情况下，上述非核酸分子可以列举例如亲和素-生物素、具有氨基的分子-具有羧基的分子的组合等。在后者的情况下，上述接头的构成单元例如为核苷酸残基，可以列举脱氧核糖核苷酸残基和核糖核苷酸残基等。上述接头没有特别限制，可以列举例如由脱氧核糖核苷酸残基构成的dna、包含核糖核苷酸残基的dna等多核苷酸。作为上述接头的具体例，可以列举例如多聚脱氧胸腺嘧啶(多聚dt)、多聚脱氧腺嘌呤(多聚da)、作为a和t的重复序列的多聚dadt等，优选为多聚dt、多聚dadt。上述接头的长度没有特别限制，例如为1～200个碱基长度、1～20个碱基长度、3～12个碱基长度、5～9个碱基长度。
上述封闭核酸分子为与上述结合核酸分子结合的核酸分子。上述封闭核酸分子例如为阻碍上述靶标与上述结合核酸分子的结合的核酸分子。上述封闭核酸分子可以列举例如与上述结合核酸分子特异性结合的核酸分子，作为具体例，可以列举包含与上述结合核酸分子互补的碱基序列的核酸分子。上述封闭核酸分子例如与上述结合核酸分子完全或部分互补。具体而言，在后者的情况下，上述封闭核酸分子可以列举例如包含由相对于上述结合核酸分子的碱基序列具有5～100％、5～50％、5～20％的范围的互补性的碱基序列构成的多核苷酸的核酸分子。
上述封闭核酸分子可以列举例如与上述结合核酸分子的3’端侧的碱基序列、5’端侧的碱基序列或除此以外的区域的碱基序列互补的碱基序列。上述3’端侧的碱基序列例如为自上述结合核酸分子的3’端的碱基起连续或不连续的碱基序列。另外，上述5’端侧的碱基序列例如为自上述结合核酸分子的5’端的碱基起连续或不连续的碱基序列。上述封闭核酸分子的固定化方法没有特别限制，可以使用公知的核酸分子的固定化方法。
上述封闭核酸分子例如优选为包含与上述标记化结合核酸分子中的与上述靶标结合的碱基序列(结合序列)互补的碱基序列的核酸分子。上述封闭核酸分子例如可以与上述结合序列完全互补，也可以部分互补。上述标记化结合核酸分子中，上述结合序列没有特别限制，可以根据上述结合核酸分子的碱基序列适当决定。在上述结合核酸分子为由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸的情况下，上述结合序列可以列举例如上述序列号1的碱基序列中的下划线所示的碱基序列。在上述结合核酸分子为由序列号2的碱基序列构成的多核苷酸的情况下，上述结合序列可以列举例如上述序列号2的碱基序列中的下划线所示的碱基序列。
上述结合核酸分子的碱基长度与上述封闭核酸分子的碱基长度之比没有特别限制。相对于上述标记化结合核酸分子的碱基长度，上述封闭核酸分子的碱基长度例如为1/1～1/20的范围的碱基长度。
作为具体例，在上述结合核酸分子为包含上述(a)的多核苷酸的核酸分子的情况下，上述封闭核酸分子可以列举例如包含下述(b)的多核苷酸的核酸分子。下述(b2)～(b4)例如为与选自由上述(a1)～(a3)和(a4)组成的组中的至少一种多核苷酸结合(杂交)的多核苷酸。
(b)选自由下述(b1)～(b3)和(b4)组成的组中的至少一种多核苷酸
(b1)由序列号3或4的碱基序列构成的多核苷酸
(b2)由在上述(b1)中的任一碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1个或几个碱基而得到的碱基序列构成的多核苷酸
(b3)由相对于上述(b1)中的任一碱基序列具有80％以上的一致性的碱基序列构成的多核苷酸
(b4)由与在严格条件下与由上述(b1)中的任一碱基序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸
上述(b1)的多核苷酸为由上述序列号3或4的碱基序列构成的多核苷酸。
互补链1(序列号3)
5’-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaatagagagtcagtcccaacca-3’
互补链2(序列号4)
5’-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagtagaggaaacgggaggat-3’
上述(b2)中，“1个或几个”只要为例如上述(b2)的多核苷酸与选自由上述(a1)～(a3)和(a4)组成的组中的至少一种多核苷酸结合的范围即可。上述“1个或几个”在上述(b1)中的任一碱基序列中例如为1～10个、1～7个、1～5个、1～3个、1或2个。
上述(b3)中，“一致性”只要为例如上述(b3)的多核苷酸与选自由上述(a1)～(a3)和(a4)组成的组中的至少一种多核苷酸结合的范围即可。上述一致性例如为80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述(b4)中，“能够杂交的多核苷酸”例如为与上述(b1)的多核苷酸完全或部分互补的多核苷酸。上述杂交和严格条件例如可以援引上述的说明。
上述封闭核酸分子例如可以包含1个上述(b1)～(b4)中的任一多核苷酸的碱基序列，也可以包含多个上述多核苷酸的碱基序列。在后者的情况下，优选多个多核苷酸连结而形成单链的多核苷酸。上述多个多核苷酸例如可以分别直接连结，也可以借助接头分别间接地连结。关于上述接头，例如可以援引上述的说明。上述多核苷酸优选在各自的末端直接地或间接地进行连结。上述多个多核苷酸例如可以相同，也可以不同。上述多个多核苷酸例如优选相同。在包含多个上述多核苷酸的情况下，上述多核苷酸的数量没有特别限制，例如为2以上，具体而言，例如为2～20、2～10、2或3。在上述结合核酸分子包含多个上述(a)的多核苷酸的情况下，上述封闭核酸分子所包含的(b)的多核苷酸的数量例如可以与上述结合核酸分子所包含的(a)的多核苷酸的数量相同，也可以不同，但优选为前者。
上述(a)的多核苷酸与上述(b)的多核苷酸的组合没有特别限制，可以列举例如下述(a1)和(b1)的多核苷酸为下述组合的情况所对应的(a)的多核苷酸与(b)的多核苷酸的组合。
上述(a1)的由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸与上述(b1)的由序列号3的碱基序列构成的多核苷酸的组合
上述(a1)的由序列号2的碱基序列构成的多核苷酸与上述(b1)的由序列号4的碱基序列构成的多核苷酸的组合
如上所述，上述载体固定化着上述封闭核酸分子。上述载体没有特别限制，可以列举例如珠、板、容器等。上述载体的材料没有特别限制。上述载体可以列举例如聚苯乙烯制载体、二氧化硅制载体、琼脂糖制载体、玻璃制载体、丙烯酸类树脂制载体、聚乙烯醇树脂制载体、聚碳酸酯制载体等，从分析灵敏度提高的方面考虑，优选为聚苯乙烯制载体。上述载体的尺寸没有特别限制。上述载体的形状没有特别限制，在上述载体为珠的情况下，其形状可以列举例如椭圆、正圆等球状。
上述封闭核酸分子例如可以利用5’末端和3’末端中的任一末端固定化于上述载体上，优选为5’末端。上述封闭核酸分子例如可以直接固定化于上述载体上，也可以间接固定化于上述载体。在后者的情况下，例如优选借助上述接头固定化于上述载体上。上述接头例如可以援引上述的说明。
接着，对各步骤进行说明。以下的各步骤例如可以在包含上述试样、上述结合核酸分子、上述载体等的反应系统中实施。上述反应系统例如优选为在液体中实施反应的液体系统。上述液体没有特别限制，可以列举例如水、生理盐水、缓冲液等。
如上所述，上述反应步骤为使试样、与靶标结合的标记化结合核酸分子和固定化了与上述结合核酸分子结合的封闭核酸分子的载体进行反应的步骤。上述反应步骤中，上述试样、上述标记化结合核酸分子和上述载体的反应顺序没有特别限制，可以列举例如下述(x1)～(x3)。
(x1)使上述试样与上述标记化结合核酸分子反应，进而，使上述试样和上述标记化结合核酸分子的混合物与上述载体反应。
(x2)使上述标记化结合核酸分子与上述载体反应，进而，使上述标记化结合核酸分子和上述载体的混合物与上述试样反应。
(x3)使上述试样、上述结合核酸分子和上述载体一次性进行反应。
上述反应步骤中，反应条件没有特别限制。反应温度例如为4～37℃、18～25℃，反应时间例如为1～30分钟、1～5分钟。在上述反应步骤为上述(x1)或上述(x2)的顺序的情况下，第一次反应的反应时间例如为0～0.5分钟、0～1分钟，第二次反应的反应时间例如为1～30分钟、1～3分钟。
接着，上述分离步骤为将上述载体的级分与上述载体以外的级分进行分离的步骤。上述载体的级分与上述载体以外的级分的分离方法没有特别限制，例如可以利用公知的固液分离方法来实施。作为具体例，上述分离方法可以列举例如过滤处理、膜分离处理、离心分离处理、沉淀处理等。在上述过滤处理和上述膜分离处理的情况下，上述分离方法例如可以通过加压来促进上述过滤处理和上述膜分离处理。在上述载体为磁性载体的情况下，可以通过利用磁性体分离上述磁性载体而将上述磁性载体的级分与上述磁性载体以外的级分分离。上述分离方法可以使用一种，也可以组合使用两种以上。
本发明中，上述分离步骤可以进一步包括对上述载体的级分和上述载体以外的级分中的至少一者的级分进行回收的步骤。回收的级分例如可以根据后述的分析步骤中供于分析的级分来适当决定。
上述分离步骤中，在通过上述过滤处理或上述膜分离处理进行分离的情况下，例如，可以通过从滤材或膜中通过而将上述载体的级分与上述载体以外的级分进行分离，进一步，例如，可以将通过上述滤材或膜后的级分作为上述载体以外的级分进行回收，将未通过滤材或膜的级分作为上述载体的级分进行回收。上述滤材和膜的孔径没有特别限制，例如可以根据上述载体的大小适当设定，具体而言，只要是能够将上述载体的级分与上述载体以外的级分进行分离的孔径即可。另外，在通过上述离心分离处理或沉淀处理进行分离的情况下，例如，可以通过离心处理或沉淀处理将上述载体的级分与上述载体以外的级分进行分离，进一步，例如，可以将所得到的沉淀物作为上述载体的级分进行回收，将上述沉淀物以外的级分作为上述载体以外的级分进行回收。另外，上述分离步骤中，在回收上述载体以外的级分的情况下，例如可以将上述载体以外的级分全部回收，也可以回收其一部分。
然后，上述分析步骤为通过检测上述载体的级分和上述载体以外的级分中的至少一者中的上述标记化结合核酸分子的标记而对上述试样中的靶标进行分析的步骤。上述分析步骤中，供于分析的级分例如可以为上述载体的级分或上述载体以外的级分，也可以为两者，从分析灵敏度提高的方面考虑，优选为上述载体以外的级分。在两者的情况下，优选分别回收上述载体的级分和上述载体以外的级分，并对它们分别进行分析。
上述分析步骤中，上述标记的检测没有特别限制，例如可以根据上述标记的种类适当决定。作为具体例，在上述标记为酶的情况下，上述标记的检测例如为酶反应的检测，更具体而言，为通过上述酶反应产生的光学信号、电信号等的检测。上述光学信号例如可以通过目视观察对发光、荧光、显色等进行检测，也可以将发光强度、荧光强度、吸光度、反射率等作为信号，利用光学方法进行检测。上述电信号可以列举例如电流等。上述电信号例如可以利用电学方法进行检测。上述酶反应没有特别限制，可以列举例如氧化还原反应等。在上述标记为荧光物质的情况下，上述标记的检测例如为来自于上述荧光物质的荧光的检测。在上述标记为同位素的情况下，上述标记的检测例如为来自于上述同位素的放射线信号的检测。上述放射线信号例如可以利用光学或电学方法对α射线、β射线、γ射线、正电子射线、x射线等的荧光作用、电离作用等进行检测。
上述分析步骤中，在对上述酶反应进行检测的情况下，上述分析步骤优选在上述酶的底物的存在下对上述酶反应进行检测。上述底物没有特别限制，例如可以根据上述酶的种类适当决定。作为具体例，在上述酶为荧光素酶的情况下，上述底物可以列举例如荧光素酶、腔肠素等。
本发明的分析方法可以进一步包括由分析步骤中的检测结果计算上述试样中的上述靶标的浓度的计算步骤。上述检测结果可以列举例如光学信号、电信号等。上述计算步骤中，上述靶标的浓度例如可以基于检测结果与检测结果和试样中的上述靶标的浓度的相关关系而进行计算。上述相关关系例如可以通过针对上述靶标的浓度已知的标准试样将利用上述本发明的分析方法得到的检测结果和上述标准试样的上述靶标的浓度进行作图而求出。上述标准试样优选为上述靶标的稀释系列。通过如此进行计算，能够进行可靠性高的定量。
本发明的分析方法中，上述结合核酸分子和上述封闭核酸分子的构成单元例如为核苷酸残基，可以列举脱氧核糖核苷酸残基和核糖核苷酸残基。上述多核苷酸例如为由脱氧核糖核苷酸残基构成的dna、包含脱氧核糖核苷酸残基和核糖核苷酸残基的dna，也可以进一步包含非核苷酸残基。在后者的情况下，“1个或几个”没有特别限制，例如，在上述多核苷酸中，例如为1～91个、1～30个、1～15个、1～7个、1～3个、1或2个。
上述多核苷酸可以包含修饰碱基。上述修饰碱基没有特别限制，可以列举例如天然碱基(非人工碱基)经修饰而得到的碱基，优选具有与上述天然碱基同样的功能。上述天然碱基没有特别限制，可以列举例如具有嘌呤骨架的嘌呤碱基、具有嘧啶骨架的嘧啶碱基等。上述嘌呤碱基没有特别限制，可以列举例如腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)。上述嘧啶碱基没有特别限制，可以列举例如胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)、尿嘧啶(u)等。上述碱基的修饰部位没有特别限制。在上述碱基为嘌呤碱基的情况下，上述嘌呤碱基的修饰部位可以列举例如上述嘌呤骨架的7位和8位。在上述碱基为嘧啶碱基的情况下，上述嘧啶碱基的修饰部位可以列举例如上述嘧啶骨架的5位和6位。上述嘧啶骨架中，在4位的碳上键合有“＝o”、5位的碳上键合有“-ch3”或“-h”以外的基团的情况下，可以称为修饰尿嘧啶或修饰胸腺嘧啶。
上述修饰碱基的修饰基团没有特别限制，可以列举例如甲基、氟代基、氨基、硫代基、下述式(1)的苄基氨基羰基(benzylaminocarbonyl)、下述式(2)的色氨基羰基(tryptaminocarbonyl)和异丁基氨基羰基(isobutylaminocarbonyl)等。
上述修饰碱基没有特别限制，可以列举例如腺嘌呤经修饰而得到的修饰腺嘌呤、胸腺嘧啶经修饰而得到的修饰胸腺嘧啶、鸟嘌呤经修饰而得到的修饰鸟嘌呤、胞嘧啶经修饰而得到的修饰胞嘧啶和尿嘧啶经修饰而得到的修饰尿嘧啶等，优选上述修饰胸腺嘧啶、上述修饰尿嘧啶和上述修饰胞嘧啶。
作为上述修饰腺嘌呤的具体例，可以列举例如7’-脱氮腺嘌呤等。
作为上述修饰鸟嘌呤的具体例，可以列举例如7’-脱氮鸟嘌呤等。
作为上述修饰胸腺嘧啶的具体例，可以列举例如5’-苄基氨基羰基胸腺嘧啶、5’-色氨基羰基胸腺嘧啶、5’-异丁基氨基羰基胸腺嘧啶等。
作为上述修饰尿嘧啶的具体例，可以列举例如5’-苄基氨基羰基尿嘧啶(bndu)、5’-色氨基羰基尿嘧啶(trpdu)和5’-异丁基氨基羰基尿嘧啶等。
上述多核苷酸例如可以仅包含任意一种上述修饰碱基，也可以包含两种以上的上述修饰碱基。
上述修饰碱基的个数没有特别限制。上述多核苷酸中，上述修饰碱基的个数没有特别限制。上述修饰碱基在上述多核苷酸中例如为1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～40个、1～20个、1～10个、1～5个，另外也可以全部碱基均为上述修饰碱基。上述修饰碱基的个数例如可以为任意一种上述修饰碱基的个数，也可以为两种以上的上述修饰碱基的总个数。
在上述多核苷酸包含上述修饰碱基的情况下，上述修饰碱基的比例没有特别限制。上述多核苷酸的全部碱基数中，上述修饰碱基的比例例如为1/100以上、1/40以上、1/20以上、1/10以上、1/4以上、1/3以上。用分数来表示上述修饰碱基的比例，但满足该比例的全部碱基数和修饰碱基数分别为正整数。
上述结合核酸分子和上述封闭核酸分子例如可以包含修饰核苷酸。上述修饰核苷酸可以为上述的具有上述修饰碱基的核苷酸，也可以为具有糖残基经修饰而得到的修饰糖的核苷酸，还可以为具有上述修饰碱基和上述修饰糖的核苷酸。
上述糖残基没有特别限制，可以列举例如脱氧核糖残基或核糖残基。上述糖残基中的修饰部位没有特别限制，可以列举例如上述糖残基的2’位或4’位，可以在两个部位中的任一部位或两个部位进行了修饰。上述修饰糖的修饰基团可以列举例如甲基、氟代基、氨基、硫代基等。
上述修饰核苷酸残基中，在碱基为嘧啶碱基的情况下，优选例如上述糖残基的2’位和/或4’位进行了修饰。上述修饰核苷酸残基的具体例可以列举例如脱氧核糖残基或核糖残基的2’位经修饰而得到的、2’-甲基化尿嘧啶核苷酸残基、2’-甲基化胞嘧啶核苷酸残基、2’-氟化尿嘧啶核苷酸残基、2’-氟化胞嘧啶核苷酸残基、2’-氨基化尿嘧啶核苷酸残基、2’-氨基化胞嘧啶核苷酸残基、2’-硫化尿嘧啶核苷酸残基、2’-硫化胞嘧啶核苷酸残基等。
上述修饰核苷酸的个数没有特别限制，例如，在上述多核苷酸中例如为1～100个、1～90个、1～80个、1～70个。另外，包含上述多核苷酸的上述结合核酸分子和上述封闭核酸分子的全长中的上述修饰核苷酸也没有特别限制，具体而言，例如与上述的范围同样。
上述结合核酸分子和上述封闭核酸分子例如可以包含1个或几个人工核酸单体残基。上述“1个或几个”没有特别限制，例如，在上述多核苷酸中，例如为1～100个、1～50个、1～30个、1～10个。上述人工核酸单体残基可以列举例如pna(肽核酸)、lna(锁核酸，lockednucleicacid)、ena(2’-o,4’-c-亚乙基桥联核酸，2’-o,4’-c-ethylenebridgednucleicacids)等。上述单体残基中的核酸例如与上述相同。
上述结合核酸分子和上述封闭核酸分子例如可以进一步具有附加序列。上述附加序列例如结合在上述结合核酸分子的未被标记化的末端和上述封闭核酸分子未被固定化的末端中的至少一者上。上述附加序列没有特别限制。上述附加序列的长度没有特别限制，例如为1～200个碱基长度、1～50个碱基长度、1～25个碱基长度、18～24个碱基长度。上述附加序列的构成单元例如为核苷酸残基，可以列举脱氧核糖核苷酸残基和核糖核苷酸残基等。上述附加序列没有特别限制，可以列举例如由脱氧核糖核苷酸残基构成的dna、包含核糖核苷酸残基的dna等多核苷酸。作为上述附加序列的具体例，可以列举例如多聚dt、多聚da等。
本发明的分析方法中，上述结合核酸分子和上述封闭核酸分子的制造方法没有特别限制，例如可以通过利用化学合成的核酸合成方法等、基因工程方法、公知的方法来合成。另外，上述结合核酸分子例如也可以使用靶标，通过所谓的selex法而得到。
<靶标分析试剂盒>
如上所述，本发明的靶标分析试剂盒的特征在于，包含与靶标结合的标记化结合核酸分子和固定化了与上述标记化结合核酸分子结合的封闭核酸分子的载体，该试剂盒用于上述本发明的靶标分析方法。本发明的分析试剂盒的特征在于，包含上述标记化结合核酸分子和上述载体，其用于上述本发明的分析方法，其他构成和条件没有特别限制。本发明的分析试剂盒例如可以援引上述本发明的分析方法的说明。根据本发明的靶标分析试剂盒，例如能够简便地实施上述本发明的分析方法。另外，根据本发明的分析试剂盒，例如能够以约3分钟这样极短的时间且以优良的分析灵敏度对靶标进行分析。根据本发明的分析试剂盒，例如能够抑制上述结合核酸分子的非特异性的结合，因此，例如能够以优良的分析精度对靶标进行分析。
本发明的分析试剂盒中，上述结合核酸分子和上述载体例如可以分别收纳在分开的容器中，也可以混合或未混合地收纳在同一容器中。在后者的情况下，本发明的分析试剂盒例如也可以称为分析试剂。
上述本发明的分析试剂盒例如可以进一步包含其他构成要素。上述构成要素可以列举例如上述底物、缓冲液等试剂、使用说明书等。上述试剂例如可以与上述结合核酸分子和上述载体收纳在分开的容器中，也可以与任一者混合或未混合地收纳在同一容器中。上述底物例如可以与上述结合核酸分子和上述载体收纳在分开的容器中。
<花生结合核酸分子>
本发明的花生结合核酸分子的特征在于，包含选自由下述(c1)～(c3)和(c4)组成的组中的至少一种多核苷酸(以下也称为“(c)的多核苷酸”)。
(c1)由序列号1、2、5和6中的任一碱基序列构成的多核苷酸
(c2)由在上述(c1)中的任一碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1个或几个碱基而得到的碱基序列构成、与花生变应原结合的多核苷酸(c3)由相对于上述(c1)中的任一碱基序列具有80％以上的一致性的碱基序列构成、与花生变应原结合的多核苷酸
(c4)由与在严格条件下与由上述(c1)中的任一碱基序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸互补的碱基序列构成、与花生变应原结合的多核苷酸
本发明的花生结合核酸分子例如可以援引上述本发明的靶标的分析方法的说明。根据本发明的花生结合核酸分子，例如能够对花生变应原进行分析。
上述(c1)的多核苷酸为由上述序列号1、2、5和6中的任一碱基序列构成的多核苷酸。
花生结合核酸分子3(序列号5)
5’-agttaagtcaggtggttgg-3’
花生结合核酸分子4(序列号6)
5’-atcctcccgtttcctctac-3’
关于上述(c1)～(c4)，例如可以在上述(a1)～(a4)的说明中将“(a1)”替换为“(c1)”、将“(a2)”替换为“(c2)”、将“(a3)”替换为“(c3)”、将“(a4)”替换为“(c4)”，并援引其说明。
本发明的花生结合核酸分子例如可以为双链。在双链的情况下，例如，一个单链多核苷酸包含选自由上述(c1)～(c3)和(c4)组成的组中的至少一种多核苷酸，另一个单链多核苷酸没有限制。上述另一个单链多核苷酸可以列举例如包含与选自由上述(c1)～(c3)和(c4)组成的组中的至少一种多核苷酸互补的碱基序列的多核苷酸。
上述互补的碱基序列可以列举例如下述(b)的多核苷酸。下述(b2)～(b4)例如为与选自由上述(c1)～(c3)和(c4)组成的组中的至少一种多核苷酸结合(互补)的多核苷酸。
(b)选自由下述(b1)～(b3)和(b4)组成的组中的至少一种多核苷酸
(b1)由序列号3或4的碱基序列构成的多核苷酸
(b2)由在上述(b1)中的任一碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1个或几个碱基而得到的碱基序列构成的多核苷酸
(b3)由相对于上述(b1)中的任一碱基序列具有80％以上的一致性的碱基序列构成的多核苷酸
(b4)由与在严格条件下与由上述(b1)中的任一碱基序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸
上述(c)的多核苷酸与上述(b)的多核苷酸的组合没有特别限制，可以列举例如下述(c1)和(b1)的多核苷酸为下述组合的情况所对应的(c)的多核苷酸与(b)的多核苷酸的组合。
上述(c1)的由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸与上述(b1)的由序列号3的碱基序列构成的多核苷酸的组合
上述(c1)的由序列号2的碱基序列构成的多核苷酸与上述(b1)的由序列号4的碱基序列构成的多核苷酸的组合
上述(c1)的由序列号5的碱基序列构成的多核苷酸与上述(b1)的由序列号3的碱基序列构成的多核苷酸的组合
上述(c1)的由序列号6的碱基序列构成的多核苷酸与上述(b1)的由序列号4的碱基序列构成的多核苷酸的组合
实施例
接着，对本发明的实施例进行说明。但是，本发明不受下述实施例的限制。只要没有特殊说明，市售的试剂基于它们的操作规程来使用。
[实施例1]
对于利用本发明的分析方法和分析试剂盒能够迅速地对花生等靶标进行分析这一点进行确认。
(1)试样
对于市售的花生(种子)，利用磨机进行粉碎。将所得到的粉末5g与20ml的sb1t缓冲液混合后，使用振荡机，在室温(约25℃、以下同样)、90-110rpm的条件下振荡过夜(约16小时、以下同样)。上述sb1t缓冲液的组成为40mmol/lhepes(ph7.5)、125mmol/lnacl、25mmol/lkcl、1mmol/lmgcl2、0.05(v/v)％tween(注册商标)20。
对于上述振荡后的混合液，在10000g、室温的条件下离心过夜。接着，回收上清后，使用过滤器(孔径0.8μm)对上述上清进行过滤，制备花生提取液1。然后，对于上述花生提取液1，使用蛋白质浓度测定试剂盒(proteinassayreagent(蛋白检测试剂)、bio-rad公司制造)对花生蛋白质浓度进行定量。
(2)分析
包含与花生变应原结合的标记化结合核酸分子的结合核酸分子液通过将包含5’末端被生物素化的由上述序列号1的碱基序列构成的多核苷酸(花生适配体)的溶液与包含链亲和素标记的荧光素酶(streptavidin-lucia、invivogen公司制造)的溶液混合来制备。上述标记化结合核酸分子在每100pmol的上述链亲和素上固定化了400pmol的上述结合核酸分子。上述结合核酸分子液中的上述结合核酸分子的浓度为1pmol/l。另外，固定化了封闭核酸分子的载体通过将5’末端被生物素化的由上述序列号3构成的多核苷酸与链亲和素标记珠(invitrogen公司制造)混合、在室温下振荡30分钟后利用上述sb1t缓冲液进行清洗来制备。上述固定化了封闭核酸分子的载体(固定化封闭核酸分子)中，在每1mg上述珠上固定化了500pmol的上述封闭核酸分子。上述清洗后，将上述珠以达到40mg/ml的方式悬浮于上述sb1t缓冲液中，制备珠液。需要说明的是，上述珠为磁性珠。
接着，将上述花生提取液1用上述sb1t缓冲液进行稀释，以使与上述结合核酸分子和上述珠混合后的反应液中的花生蛋白质浓度为规定浓度(0.0004、0.002、0.01、0.05、0.25、1.25或6.25ppm)，制备花生稀释液。接着，在u型底板的各孔中添加4μl的上述珠液和16μl的上述sb1t缓冲液，制备稀释珠液。另外，在另一u型底板的各孔中添加25μl的上述结合核酸分子液，进一步在各孔中添加25μl的上述花生稀释液。上述添加后，在室温下温育1分钟。进一步，在上述温育后的各孔中添加20μl的上述稀释珠液，使用上述振荡机在室温、1000rpm的条件下振荡2分钟。
接着，将上述板设置在磁性珠分离板上，分离成上述磁性珠的级分与上述磁性珠以外的级分。上述分离后，从各孔中回收上清30μl，分别添加至测定用板(whitehalfplate、葛莱娜公司制造)的各孔中。进一步添加30μl的底物液后进行吹打，利用酶标仪(infinitem1000pro、tecan公司制造)测定各孔的发光量。在上述酶为荧光素酶的情况下，上述底物液使用quanti-luc(商品名、invivogen公司制造)。另外，代替由上述序列号1的碱基序列构成的多核苷酸，使用由上述序列号2的碱基序列构成的多核苷酸，代替链亲和素标记的荧光素酶，使用链亲和素标记的碱性磷酸酶(gehealthcarebioscience公司制造)，代替由上述序列号3构成的多核苷酸，使用由上述序列号4的碱基序列构成的多核苷酸，将上述规定浓度设定为0、0.25、1、4、16或64ppm，作为上述底物液，使用cdp-star(emeraldii)(商品名、roche公司制造)，除此以外，同样地测定发光量。
将这些结果示于图1。图1是示出发光量的图。图1中，(a)示出上述酶为荧光素酶的情况下的结果，(b)示出上述酶为碱性磷酸酶的情况下的结果。另外，图1中，横轴为花生蛋白质浓度，纵轴表示发光量。如图1所示，在使用碱性磷酸酶和荧光素酶中的任一者作为上述标记的情况下，发光量均以依赖于花生蛋白质浓度的方式增加。另外可知，在使用荧光素酶作为上述标记的情况下，花生蛋白质浓度即使为约0.001ppm也能够进行分析，分析灵敏度极高。另外，上述分析中能够以总计3分钟的温育时间进行分析，由此可知，本发明的分析方法和分析试剂盒能够迅速地对花生变应原等靶标进行分析。
[实施例2]
对于利用本发明的分析方法和分析试剂盒能够对食品中的花生进行分析这一点进行确认。
(1)试样
代替上述花生，使用市售的曲奇(迷你黄油曲奇、itobicuitsco.,ltd.公司制造)、巧克力(dars牛奶巧克力、森永制果公司制造)、饼干(夹心饼干、eastpigeonco,.ltd.公司制造)，与上述sb1t缓冲液混合后，振荡1分钟，除此以外，与上述实施例1(1)同样地制备曲奇提取液、巧克力提取液和饼干提取液。然后，对于各提取液，与上述实施例1(1)同样地对蛋白质浓度进行定量。
(2)分析
代替上述花生提取液1，分别使用上述曲奇提取液、上述巧克力提取液和上述饼干提取液，按照与上述结合核酸分子和上述珠混合后的反应液中的各提取液来源的蛋白质浓度为10ppm的方式进行添加，进一步添加上述花生提取液1，以使上述反应液中的花生蛋白质的浓度为规定浓度(0.01、0.05、0.25、1.25或6.25ppm)，除此以外，与上述实施例1(2)同样地测定发光量。
将这些结果示于图2。图2是示出发光量的图。图2中，(a)为上述曲奇提取液的情况下的结果，(b)为上述巧克力提取液的情况下的结果，(c)为上述饼干提取液的情况下的结果。图2中，横轴表示花生蛋白质浓度，纵轴表示发光量。如图2所示，在使用任一种食品的情况下，发光量均以依赖于花生蛋白质浓度的方式增加。由这些结果可知，根据本发明的分析方法和分析试剂盒，即使在夹杂物等多的食品中，也能够对食品中的花生进行分析。
[实施例3]
使用不同的载体，对于利用本发明的分析方法和分析试剂盒能够对花生进行分析这一点进行确认。
(1)试样
与上述实施例1(1)同样地制备花生提取液1。
(2)分析
代替上述链亲和素标记珠，使用链亲和素标记琼脂糖珠(invitrogen公司制造)或链亲和素标记树脂(聚苯乙烯)珠(sa树脂珠、bio-rad公司制造)，使用上述荧光素酶作为上述酶，除此以外，与上述实施例1(2)同样地测定发光量。
将这些结果示于图3。图3是示出发光量的图。图3中，(a)为琼脂糖珠的情况下的结果，(b)为树脂珠的情况下的结果。图3中，横轴表示花生蛋白质浓度，纵轴表示发光量。如图3所示，在使用任一种珠的情况下，发光量均以依赖于花生蛋白质浓度的方式增加。另外可知，在使用树脂珠的情况下，能够以更宽的浓度对蛋白质进行检测。由这些结果可知，根据本发明的分析方法和分析试剂盒，使用任一种载体，均能够对花生进行分析。
[实施例4]
对于利用本发明的分析方法和分析试剂盒能够对花生进行分析并且减少非特异性的结合这一点进行确认。
(1)试样
与上述实施例1(1)同样地制备花生提取液1，对蛋白质浓度进行定量。另外，代替上述花生，使用市售的大豆(种子)，除此以外，制备大豆提取液，对蛋白质浓度进行定量。需要说明的是，已知大豆包含与花生变应原的同源性高的蛋白质。
(2)分析
上述结合核酸分子液与上述实施例1(2)同样地进行制备。另外，作为上述链亲和素标记珠，使用上述链亲和素标记树脂珠，作为上述酶，使用上述荧光素酶，除此以外，与上述实施例1(2)同样地制备珠液。接着，将上述花生提取液1用上述sb1t缓冲液进行稀释，以使与上述结合核酸分子和上述珠混合后的反应液中的蛋白质浓度为规定浓度(0、1.25、5、20或80ppm)，制备花生稀释液。接着，在管中添加40μl的上述珠液和160μl的上述sb1t缓冲液，制备稀释珠液。另外，在另一管中添加250μl的上述结合核酸分子液，进一步在管中添加250μl的上述花生稀释液。上述添加后，进行搅拌。进一步在上述管中添加200μl的上述稀释珠液后，进行搅拌，在室温下温育1分钟。
对于上述温育后的反应液，使用5ml的注射器和过滤器(孔径0.45μm)进行过滤，将滤液回收至预先添加有800μl的上述底物液的测定容器中。上述回收后，对上述测定容器进行搅拌，温育30秒～1分钟。然后，使用光度计(clean-trace(商标)、3m公司制造)，测定上述测定容器中的测定样品的发光量。另外，代替上述花生稀释液，使用通过将上述大豆提取液用上述sb1t缓冲液进行稀释以使与上述结合核酸分子和上述珠混合后的反应液中的蛋白质浓度为80ppm而制备的大豆稀释液，除此以外，同样地测定发光量。
将这些结果示于图4。图4是示出发光量的图。图4中，横轴表示花生或大豆蛋白质浓度，纵轴表示发光量。如图4所示，在使用上述花生适配体作为上述结合核酸分子的情况下，发光量以依赖于上述花生提取液1来源的花生蛋白质浓度的方式增加。另一方面，在使用上述大豆提取液的情况下，发光量与背景为同等程度，可知其不与大豆蛋白质结合。由上可知，利用本发明的分析方法和分析试剂盒，能够对花生等靶标进行分析，并且减少了非特异性的结合。
[实施例5]
对于利用本发明的分析方法和分析试剂盒能够对花生进行分析这一点进行确认。
(1)试样
将上述花生的粉末与上述sb1t缓冲液混合后，振荡1分钟，除此以外，与上述实施例1(1)同样地制备振荡后的混合液。对于上述振荡后的混合液，在10000g、室温的条件下离心30分钟。接着，将上清回收后，对于上述上清，使用过滤器(孔径0.8μm)进行过滤，制备花生提取液2。然后，对于上述花生提取液2，与上述实施例1(1)同样地对花生蛋白质浓度进行定量。
将上述花生提取液2用上述sb1t缓冲液进行稀释，以使花生蛋白质浓度为规定浓度(0、1、10、100、1000或7700ppm)，制备样品。将上述样品100μl涂布于铝箔上后，用棉棒擦拭铝箔。使上述棉棒与上述sb1t缓冲液400μl接触，在室温下温育1分钟，由此提取保持于上述棉棒上的靶标，得到提取液。在上述提取液25μl中添加上述结合核酸分子液25μl，以使上述标记化结合核酸分子来源的结合核酸分子的量为1pmol，将它们在室温下混合1分钟。由此，使上述标记化结合核酸分子与作为靶标的花生变应原结合。在该混合液中进一步添加上述珠液4μl(上述封闭核酸分子40pmol)，以达到与上述标记化结合核酸分子来源的结合核酸分子的量等量的封闭核酸分子的量(10μmol/l)，在室温下混合4分钟。由此，使上述固定化封闭核酸分子结合在未与上述靶标结合的上述标记化结合核酸分子的结合核酸分子上。
接着，将所得到的混合液设置在磁性支架上，分离成上述磁性珠的级分和上述磁性珠以外的级分，回收后者。然后，在上述上清30μl中添加底物液30μl(quanti-luc(商标)、invivogen公司制造)后进行吹打，利用酶标仪(infinitem1000pro、tecan公司制造)测定各样品的发光量。
将该结果示于图5。图5是示出发光量的图。图5中，横轴表示将上述提取液与上述结合核酸分子液混合后的混合液中的花生蛋白质浓度，纵轴表示发光量。如图5所示，发光量以依赖于花生蛋白质的浓度的方式增加。由这些结果可知，利用本发明的分析方法和分析试剂盒，能够对花生等靶标进行分析。
[实施例6]
对于利用本发明的分析方法和分析试剂盒能够对花生进行分析这一点进行确认。
首先，代替上述磁性珠，使用链亲和素标记树脂珠(pierce(商标)streptavidinplusultralink(商标)树脂、pierce公司制造)，除此以外，与上述实施例1或3同样地制备花生提取液2、结合核酸分子液和珠液。
将上述花生提取液2用上述sb1t缓冲液进行稀释，以使花生蛋白质浓度为规定浓度(0、0.002、0.01、0.05、0.25、1.25或6.25ppm)，制备样品。在上述样品25μl中添加上述结合核酸分子液25μl，以使上述标记化结合核酸分子来源的结合核酸分子的量为1pmol，将它们在室温下混合1分钟。由此，使上述标记化结合核酸分子与靶标的花生变应原结合。在该混合液中进一步添加上述珠液10μl(上述封闭核酸分子40pmol)，以达到与上述标记化结合核酸分子来源的结合核酸分子的量等量的封闭核酸分子的量(4μmol/l)，在室温下混合4分钟。由此，使上述固定化封闭核酸分子结合在未与上述靶标蛋白质结合的上述标记化结合核酸分子的结合核酸分子上。对于所得到的混合液，使用过滤板(孔径0.22μm、multiscreen(注册商标)、密理博公司制造)进行离心过滤。在所得到的滤液30μl中添加上述底物液30μl后进行吹打，利用上述酶标仪测定各样品的发光量。
将该结果示于图6。图6是示出发光量的图。图6中，横轴表示花生蛋白质浓度，纵轴表示发光量。如图6所示，发光量以依赖于花生蛋白质的浓度的方式增加。由这些结果可知，利用本发明的分析方法和分析试剂盒，能够对花生等靶标进行分析。
[实施例7]
对于利用本发明的分析方法和分析试剂盒能够对花生进行分析这一点进行确认。
首先，与上述实施例1或3同样地制备花生提取液2、结合核酸分子液和珠液。
将上述花生提取液2用上述sb1t缓冲液进行稀释，以使花生蛋白质浓度为规定浓度(0、0.002、0.01、0.05、0.25、1.25、6.25)，制备样品。在上述样品25μl中添加上述珠液25μl，以使上述固定化封闭核酸分子来源的封闭核酸分子的量为1pmol，将它们在室温下混合1分钟。在该混合液中进一步添加上述结合核酸分子液4μl(上述结合核酸分子40pmol)，以达到与上述固定化封闭核酸分子来源的封闭核酸分子的量等量的结合核酸分子的量(10μmol/l)，在室温下混合4分钟。由此，使上述标记化结合核酸分子与靶标的花生变应原结合，并且，使上述固定化封闭核酸分子结合在未与上述靶标结合的上述标记化结合核酸分子的结合核酸分子上。
接着，将所得到的混合液设置在磁性支架上，分离成上述磁性珠的级分和上述磁性珠以外的级分，回收后者。然后，在上述上清3μl中添加上述底物液30μl后进行吹打，利用上述酶标仪测定各样品的发光量。
将该结果示于图7。图7是示出发光量的图。图7中，横轴表示花生蛋白质浓度，纵轴表示发光量。如图7所示，发光量以依赖于花生蛋白质的浓度的方式增加。由这些结果可知，利用本发明的分析方法和分析试剂盒，能够对花生等靶标进行分析。
以上，参照实施方式和实施例对本发明进行了说明，但本发明并不限定于上述实施方式和实施例。可以在本发明的范围内对本发明的构成和详细内容进行本领域技术人员能够理解的各种变更。
本申请要求以2016年1月22日提交的日本申请特愿2016-011024为基础的优先权,将其公开的全部内容并入本说明书中。
产业上的可利用性
根据本发明的分析方法，例如能够以约3分钟这样极短的时间且以优良的分析灵敏度对靶标进行分析。另外，根据本发明的分析方法，虽然机制尚不明确，但例如能够抑制上述结合核酸分子的非特异性结合，因此，例如能够以优良的分析精度(特异性)对靶标进行分析。因此，本发明可以称为对于例如临床医疗、食品、环境等各种领域中的研究和检查极为有用的技术。
序列表
<110>日本电气方案创新株式会社（necsolutioninnovators,ltd.）
<120>靶标分析方法和用于该方法的靶标分析试剂盒（methodofanalyzingtargetandkitofanalyzingtargetforuseinthesamemethod）
<130>1010100048
<150>jp2016-011024
<151>2016-01-22
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