针对表皮生长因子受体变体III和CD3的单特异性和双特异性抗体及其用途的制作方法

本发明涉及特异性结合表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)的抗体(例如全长抗体或其抗原结合片段)。本发明进一步涉及异多聚体抗体(heteromultimericantibody)(例如双特异性抗体)和抗体缀合物(例如抗体-药物缀合物)。还提供包含egfrviii抗体的组合物、用于产生和纯化这样的抗体的方法，以及其在诊断和治疗中的用途。

发明背景

egfr变体iii(egfrviii)为egfr的肿瘤特异性突变体，其是基因组重排的产物，其通常与野生型egfr基因扩增相关。egfrviii通过外显子2至7的框内删除(in-framedeletion)产生267个氨基酸的删除并在连结处有甘氨酸取代而形成。该经截断的受体失去其结合配体的能力但获取持续激酶活性。有趣的是，egfrviii常与全长野生型egfr在相同肿瘤细胞中共同表达。此外，表达egfrviii的细胞展现增加的增殖、侵入、血管新生和对细胞凋亡抗性。

egfrviii最常见于多形性胶质母细胞瘤(gbm)中。估计25至35％的gbm携有此经截断的受体。此外，其表达常反映更具侵犯性的表型和不良预后。除了gbm，还报导在其他实体瘤，诸如非小细胞肺癌、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中有egfrviii的表达。相反地，egfrviii在健康组织中不表达。在正常组织中缺少表达使egfrviii成为发展肿瘤特异性靶向疗法的理想靶。迄今，尚未有任何经fda核准的抗egfrviii单克隆抗体(例如单特异性或双特异性)确认在治疗诸如gbm的癌症中具有高亲和力、高特异性和高效价。因此，针对以经改善的疗效和安全性特征谱治疗诸如gbm的癌症并且适合用于人患者的抗体(例如单特异性或双特异性)仍有需求。

发明概述

在本文中所公开的发明涉及特异性结合表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)的抗体(例如单特异性或双特异性抗体)和抗体缀合物。在一个方面中，本发明提供分离的抗体，其特异性结合egfrviii，其中该抗体包含(a)重链可变(vh)区，其包含(i)vh互补决定区1(cdr1)，其包含显示于seqidno：62、63、64、74、75、76、80、81、82、88、89、90、93、94、95、99、100、101、109、110、111、115、116、117、121、122、123、132、133、134、137、138、139、143、144或145中的序列；(ii)vhcdr2，其包含显示于seqidno：65、66、68、69、70、71、77、78、83、84、86、87、91、92、96、97、98、102、103、105、106、112、113、118、119、124、125、127、128、130、131、135、136、140、141、146、147、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235或237中的序列；和iii)vhcdr3，其包含显示于seqidno：67、72、73、79、85、104、107、108、114、120、126、129、142、148、219、220、221、222、223或236中的序列；和/或轻链可变(vl)区，其包含(i)vlcdr1，其包含显示于seqidno：149、154、156、159、162、165、166、168、169、170、171、173、174、176、178、181、182、185、187、190、192、195、198、238或239中的序列；(ii)vlcdr2，其包含显示于seqidno：150、152、155、157、160、163、172、175、179、183、186、188、191、193、196或199中的序列；和(iii)vlcdr3，其包含显示于seqidno：151、153、158、161、164、167、177、180、184、189、194、197或200中的序列。

在另一方面中，所提供的是分离的抗体，其特异性结合egfrviii，其中该抗体包含：vh区，其包含显示于seqidno：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、30、32、34、35、37、39、41、43、44、46、48、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、202、203、204、205、206、207、208、209、210、214、216、217或218中的vh序列的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3；和/或vl区，其包含显示于seqidno：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、29、31、33、36、38、40、42、45、47、49、51、211、212、213或215中的vl序列的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。在一些实施方案中，如本文中所述的vh区包含在不在cdr内的残基中具有一个或几个保守性氨基酸取代的变体，和/或如本文中所述的vl区包含在不在cdr内的氨基酸中具有一个或几个氨基酸取代的变体。例如，在一些实施方案中，该vh或vl区可包含上述的氨基酸序列或其在不在cdr内的残基中具有不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个保守性取代的变体。

在一些实施方案中，所提供的是分离的抗体，其特异性结合egfrviii，其中该抗体包含：vh区，其包含显示于seqidno：5、9、11、15、30、37或41中的序列；和/或vl区，其包含显示于seqidno：6、10、12、16、31、38或42中的序列。在一些实施方案中，该vh区包含显示于seqidno：5中的序列并且该vl区包含显示于seqidno：6中的序列。在一些实施方案中，该vh区包含显示于seqidno：9中的序列并且该vl区包含显示于seqidno：10中的序列。在一些实施方案中，该vh区包含显示于seqidno：11中的序列并且该vl区包含显示于seqidno：12中的序列。在一些实施方案中，该vh区包含显示于seqidno：15中的序列并且该vl区包含显示于seqidno：16中的序列。在一些实施方案中，该vh区包含显示于seqidno：30中的序列并且该vl区包含显示于seqidno：31中的序列。在一些实施方案中，该vh区包含显示于seqidno：37中的序列并且该vl区包含显示于seqidno：38中的序列。在一些实施方案中，该vh区包含显示于seqidno：41中的序列并且该vl区包含显示于seqidno：42中的序列。

在另一方面中，所提供的是双特异性抗体，其中该双特异性抗体是全长的人抗体，其包含特异性结合靶抗原(例如egfrviii)的该双特异性抗体的第一抗体可变结构域，和包含能够通过特异性结合位于人免疫效应细胞上的效应抗原(例如分化簇3(cd3))而召募人免疫效应细胞活性的该双特异性抗体的第二抗体可变结构域。在一些实施方案中，该第一抗体可变结构域包含重链可变(vh)区，其包含显示于seqidno：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、30、32、34、35、37、39、41、43、44、46、48、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、202、203、204、205、206、207、208、209、210、214、216、217或218中的vh序列的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3；和/或轻链可变(vl)区，其包含显示于seqidno：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、29、31、33、36、38、40、42、45、47、49、51、211、212、213或215中的vl序列的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。在一些实施方案中，该第一抗体可变结构域包含(a)重链可变(vh)区，其包含(i)vh互补决定区1(cdr1)，其包含显示于seqidno：62、63、64、74、75、76、80、81、82、88、89、90、93、94、95、99、100、101、109、110、111、115、116、117、121、122、123、132、133、134、137、138、139、143、144或145中的序列；(ii)vhcdr2，其包含显示于seqidno：65、66、68、69、70、71、77、78、83、84、86、87、91、92、96、97、98、102、103、105、106、112、113、118、119、124、125、127、128、130、131、135、136、140、141、146、147、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235或237中的序列；和iii)vhcdr3，其包含显示于seqidno：67、72、73、79、85、104、107、108、114、120、126、129、142、148、219、220、221、222、223或236中的序列；和/或(b)轻链可变(vl)区，其包含(i)vlcdr1，其包含显示于seqidno：149、154、156、159、162、165、166、168、169、170、171、173、174、176、178、181、182、185、187、190、192、195、198、238或239中的序列；(ii)vlcdr2，其包含显示于seqidno：150、152、155、157、160、163、172、175、179、183、186、188、191、193、196或199中的序列；和(iii)vlcdr3，其包含显示于seqidno：151、153、158、161、164、167、177、180、184、189、194、197或200中的序列。

在一些实施方案中，该第二抗体可变结构域包含特异性抗cd3的vh和/或vl区。例如，该第二抗体可变结构域包含重链可变(vh)区，其包含显示于seqidno：240中的vh序列的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3；和/或轻链可变(vl)区，其包含显示于seqidno：241中的vl序列的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。在一些实施方案中，该第二抗体可变结构域包含(a)vh区，其包含(i)vhcdr1，其包含显示于seqidno：244、110或245中的序列；(ii)vhcdr2，其包含显示于seqidno：246或247中的序列；和iii)vhcdr3，其包含显示于seqidno：248中的序列；和/或vl区，其包含(i)vlcdr1，其包含显示于seqidno：249中的序列；(ii)vlcdr2，其包含显示于seqidno：250中的序列；和(iii)vlcdr3，其包含显示于seqidno：251中的序列。

在一些实施方案中，如本文中所述的抗体包含恒定区。在一些实施方案中，如本文中所述的抗体是人igg1、igg2或igg2△a、igg3或igg4亚型。在一些实施方案中，如本文中所述的抗体包含经糖基化的恒定区。在一些实施方案中，如本文中所述的抗体包含具有对一个或多个人fcγ受体的结合亲和力降低的恒定区。

在一些实施方案中，该双特异性抗体的该第一和第二抗体可变结构域两者包含人igg2(seqidno：290)的铰链区中位置223、225和228(例如(c223e或c223r)、(e225r)和(p228e或p228r))以及在ch3区中的位置409或368(例如k409r或l368e(eu编码方案))的氨基酸修饰。

在一些实施方案中，该双特异性抗体的该第一和第二抗体可变结构域两者包含人igg2的位置265(例如d265a)的氨基酸修饰。

在一些实施方案中，该双特异性抗体的该第一和第二抗体可变结构域两者包含人igg2的位置265(例如d265a)、330(例如a330s)和331(例如p331s)中的一个或多个位置处的氨基酸修饰。在一些实施方案中，该双特异性抗体的该第一和第二抗体可变结构域两者包含人igg2的位置265(例如d265a)、330(例如a330s)和331(例如p331s)中的每个位置处的氨基酸修饰。

在另一方面中，本发明提供分离的抗体，其包含在本发明的egfrviii抗体的特定位点经工程化的含有谷氨酰胺的酰基供体标签。

在一个变体中，本发明提供分离的抗体，其包含在本发明的egfrviii抗体的位置222、340或370处的含有谷氨酰胺的酰基供体标签和氨基酸修饰。在一些实施方案中，该氨基酸修饰是自赖氨酸至精氨酸的取代。

在一些实施方案中，本发明的egfrviii抗体进一步包含接头。

在另一方面中，本发明提供如本文中所述的egfrviii抗体的缀合物，其中该抗体缀合至药剂，其中该药剂选自由下列所组成的组：细胞毒性剂、免疫调节剂、成像剂、治疗性蛋白质、生物聚合物和寡核苷酸。在一些实施方案中，该药剂是细胞毒性剂，其包括但不限于蒽环素(anthracycline)、耳抑素(auristatin)、喜树碱(camptothecin)、康柏达司塔汀(combretastatin)、尾海兔素(dolastatin)、倍癌霉素(duocarmycin)、烯双炔(enediyne)、格尔德霉素(geldanamycin)、吲哚啉并-苯并二吖呯二聚物(indolino-benzodiazepinedimer)、美登素(maytansine)、嘌霉素(puromycin)、吡咯并苯并二吖呯二聚物(pyrrolobenzodiazepinedimer)、紫杉烷(taxane)、长春花生物碱(vincaalkaloid)、妥布赖森(tubulysin)、半星芒体(hemiasterlin)、司普力西欧史塔丁(spliceostatin)、普拉地内酯(pladienolide)、及其立体异构物、同电子排列体(isostere)、类似物或衍生物。例如，该细胞毒性剂是mmad(单甲基耳抑素d(monomethylauristatind))、0101(2-甲基丙氨酰基-n-[(3r,4s,5s)-3-甲氧基-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1s)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-n-甲基-l-缬氨酰胺)、3377(n,2-二甲基丙氨酰基-n-{(1s,2r)-4-{(2s)-2-[(1r,2r)-3-{[(1s)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯啶-1-基}-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-n-甲基-l-缬氨酰胺)、0131(2-甲基-l-脯氨酰基-n-[(3r,4s,5s)-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-3-{[(1s)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-n-甲基-l-缬氨酰胺)或0121(2-甲基-l-脯氨酰基-n-[(3r,4s,5s)-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-3-{[(2s)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-n-甲基-l-缬氨酰胺)。

在一些实施方案中，本发明提供缀合物，其包含式：抗体-(含有谷氨酰胺的酰基供体标签)-(接头)-(细胞毒性剂)。

在其他实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含如本文中所述的任何抗体或抗体缀合物。

本发明还提供细胞系，其重组性产生如本文中所述的任何抗体。

本发明还提供核酸，其编码如本文中所述的任何抗体。本发明还提供编码如本文中所述的任何抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核酸。

本发明还提供试剂盒，其包含有效量的如本文中所述的任何抗体或抗体缀合物。

本发明还提供治疗有此需要的受试者的方法，其包括提供如本文中所述的分离的抗体、双特异性抗体或抗体缀合物，以及施用所述抗体至该受试者。

还所提供的是治疗受试者中与表达egfrviii的恶性细胞相关的的病况的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含如本文中所述的抗体或抗体缀合物。在一些实施方案中，该病况是癌症。在一些实施方案中，该癌症是egfrviii相关性癌症(例如任何具有egfrviii表达的癌症)，其选自由下列所组成的组：多型性胶质母细胞瘤(glioblastomamultiform)、间变性星细胞瘤(anaplasticastrocytoma)、巨细胞胶质母细胞瘤(giantcellglioblastoma)、神经胶质肉瘤(gliosarcoma)、间变性寡树突神经胶细胞瘤(anaplasticoligodendroglioma)、间变性室管膜瘤(anaplasticependymoma)、间变性寡星细胞瘤(anaplasticoligoastrocytoma)、脉络丛癌(choroidplexuscarcinoma)、间变性神经节性神经胶质瘤(anaplasticganglioglioma)、松果体母细胞瘤(pineoblastoma)、松果体细胞瘤(pineocytoma)、脑膜瘤(meningioma)_、髓质上皮瘤(medulloepithelioma)、室管膜母细胞瘤(ependymoblastoma)、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、小脑幕上原始神经外胚层肿瘤(supraentorialprimitiveneuroectodermaltumor)、非典型畸胎/类横纹肌细胞瘤(atypicalteratoid/rhabdoidtumor)、头颈癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、髓母细胞瘤(medullobastoma)、结直肠癌、肛门癌、胃癌、甲状腺癌、间皮瘤(mesothelioma)、子宫癌和膀胱癌。

在另一方面中，本发明提供抑制具有表达egfrviii的恶性细胞的受试者中的肿瘤生长或进展的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含如本文中所述的分离的抗体、双特异性抗体或抗体缀合物。

在另一方面中，本发明提供抑制抑制受试者中表达egfrviii的恶性细胞的转移(metastasis)的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含如本文中所述的抗体、双特异性抗体或抗体缀合物。

在另一方面中，本发明提供诱发具有表达egfrviii的恶性细胞的受试者中的肿瘤消退的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含如本文中所述的分离的抗体、双特异性抗体或抗体缀合物。

附图说明

图1a、图1b和图1c显示三种egfrviii抗体mab42g9(图1a)、32a10(图1b)和32g8(图1c)对三种f98细胞系f98(egfr阴性)、f98-egfrwt和f98-egfrviii的facs结合的直方图的实例。x轴是荧光强度；y轴是最大/针对模式标准化的百分比。

图2a、2b和2c描绘的直方图显示通过流式细胞测量来测量野生型egfr和egfrviii在gbm细胞系中的表达：ln229-egfrviii(图2a)、ln18-egfrviii(图2b)和dkmg(图2c)。egfrviii用mab42g9来检测并且egfrwt用egfr野生型特异性mab来检测。x轴是荧光强度；y轴是最大/针对模式标准化的百分比。

图3a和3b显示的图证实三种egfrviii-cd3双特异性抗体在经egfrviii转导的ln18-egfrviii(图3a)和亲代ln18(图3b)细胞中的细胞毒性。

图4a和4b显示的图证实三种egfrviii-cd3双特异性抗体在经egfrviii转导的ln229-egfrviii(图4a)和亲代ln229(图4b)细胞中的细胞毒性。

图5显示的图证实三种egfrviii-cd3双特异性抗体在表达内源性egfrviii和egfr野生型蛋白的dkmg细胞中的细胞毒性。

图6显示的图描绘egfrviii-cd3双特异性抗体在ln229-egfrviiigbm细胞系的皮下模型中的体内抗肿瘤活性。

发明详述

在本文中所公开的发明提供特异性结合egfrviii(例如人egfrviii)的抗体(例如单特异性或双特异性抗体)和抗体缀合物。本发明还提供编码这些抗体的多核苷酸、包含这些抗体和抗体缀合物的组合物、以及产生和使用这些抗体和抗体缀合物的方法。本发明还提供用于治疗受试者中与egfrviii介导的病理相关的病况(诸如癌症)的方法。

一般技术

除非特别指出，否则本发明的实施将利用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、免疫学、病毒学、单克隆抗体产生和工程化的常规技术，其是在本领域技术人员的能力范围内的。这样的技术在文献中有充分解释，诸如molecularcloning：alaboratorymanual,secondedition(sambrook等人,1989)coldspringharborpress；oligonucleotidesynthesis(m.j.gait,ed.,1984)；methodsinmolecularbiology,humanapress；cellbiology：alaboratorynotebook(j.e.cellis,ed.,1998)academicpress；animalcellculture(r.i.freshney,ed.,1987)；introductiontocellandtissueculture(j.p.matherandp.e.roberts,1998)plenumpress；cellandtissueculture：laboratoryprocedures(a.doyle,j.b.griffiths,andd.g.newell,eds.,1993-1998)j.wileyandsons；methodsinenzymology(academicpress,inc.)；handbookofexperimentalimmunology(d.m.weirandc.c.blackwell,eds.)；genetransfervectorsformammaliancells(j.m.millerandm.p.calos,eds.,1987)；currentprotocolsinmolecularbiology(f.m.ausubel等人,eds.,1987)；pcr：thepolymerasechainreaction,(mullis等人,eds.,1994)；currentprotocolsinimmunology(j.e.coligan等人,eds.,1991)；shortprotocolsinmolecularbiology(wileyandsons,1999)；immunobiology(c.a.janewayandp.travers,1997)；antibodies(p.finch,1997)；antibodies：apracticalapproach(d.catty.,ed.,irlpress,1988-1989)；monoclonalantibodies：apracticalapproach(p.shepherdandc.dean,eds.,oxforduniversitypress,2000)；usingantibodies：alaboratorymanual(e.harlowandd.lane(coldspringharborlaboratorypress,1999)；theantibodies(m.zanettiandj.d.capra,eds.,harwoodacademicpublishers,1995)。

定义

“抗体”是免疫球蛋白分子，其能通过位于该免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合靶，诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。如本文中所使用，该术语涵盖不仅完整多克隆或单克隆抗体，还有其抗原结合片段(诸如fab、fab’、f(ab’)2、fv)、单链(scfv)和结构域抗体(包括例如鲨鱼和骆驼抗体)、以及包含抗体的融合蛋白和任何其他包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的经修饰的构型。抗体包括任何类型的抗体，诸如igg、iga或igm(或其亚型)，并且该抗体不需要是任何特定类型。取决于其重链恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可被分派到不同类型中。有五种主要的免疫球蛋白类型：iga、igd、ige、igg和igm，并且这些中的数种可进一步分成亚型(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应不同类型免疫球蛋白的所述重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型免疫球蛋白的亚基结构和三维构形是熟知的。

术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”，如本文中所使用，是指完整抗体的一个或多个片段，该片段保留特异性结合给定抗原(例如egfrviii)的能力。抗体的抗原结合功能可通过完整抗体的片段进行。抗体的“抗原结合片段”术语所涵盖的结合片段的实例包括fab；fab’；f(ab’)2；由vh和ch1结构域组成的fd片段；由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段；单结构域抗体(dab)片段(ward等人,nature341：544-546,1989)和分离的互补决定区(cdr)。

“优先结合”或“特异性结合”(在本文中互换使用)靶(例如egfrviii蛋白)的抗体、抗体缀合物或多肽是本领域理解清楚的术语，并且测定所述特异性或优先结合的方法还为本领域所广为周知。若分子与特定细胞或物质的反应或结合相较于与其他细胞或物质的反应或结合更频繁、更快速、更长时间和/或更高亲和力，该分子被称为展现“特异性结合”或“优先结合”。若抗体与靶的结合相较于与其他物质的结合具有更高亲和力、亲合力(avidity)、更快速和/或更长时间，则该抗体“特异性结合”或“优先结合”靶。例如，特异性或优先结合egfrviii表位的抗体是指相较于与其他egfrviii表位或非egfrviii表位结合时，以更高的亲和力、亲合力、更快速和/或更长时间与此表位结合的抗体。通过阅读此定义还可了解，例如，特异性或优先结合第一靶的抗体(或部分(moiety)或表位)可能或不会特异性或优先结合第二靶。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(虽然可包括)排他性结合。一般来说(但不必然)，所谓的结合是指优先结合。

抗体的“可变区”是指(不论单独或经组合的)抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。如本技术领域中已知，重链和轻链的可变区各由三个互补决定区(cdr)所连接的四个构架区(fr)组成，cdr还称为高变区(hypervariableregion)。各链中的cdr通过fr被拉近，并且与另一链的cdr促成抗体的抗原结合位点的形成。至少有两种技术用于测定cdr：(1)基于跨种序列变异性的方法(即kabat等人sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,(5thed.,1991,nationalinstitutesofhealth,bethesdamd))；和(2)基于抗原-抗体复合物的结晶学研究的方法(al-lazikani等人，1997,j.molec.biol.273：927-948)。如本文中所使用，cdr可是指通过任一方法或通过两种方法的组合所界定的cdr。

可变结构域的“cdr”是在可变区内的氨基酸残基，所述氨基酸残基根据kabat定义、chothia定义、kabat和chothia的累积定义、abm定义、接触定义和/或构象定义，或该领域广为周知的任何cdr测定方法来鉴别。抗体cdr可能经鉴别为原先由kabat等人所界定的高变区。参见例如kabat等人，1992,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,publichealthservice,nih,washingtond.c.。cdr的位置还可能经鉴别为原先由chothia等人所描述的结构性环结构。参见例如chothia等人，nature342：877-883,1989。其他cdr鉴别的方法包括“abm定义”，该方法为kabat法和chothia法的折衷，是源自利用oxfordmolecular的abm抗体模型软件(现为)，或如maccallum等人，j.mol.biol.,262：732-745,1996中所述的基于所观察的抗原接触的cdr的“接触定义(contactdefinition)”。在另一方法中，在本文中称为cdr的“构象定义(conformationaldefinition)”，cdr的位置可能经鉴别为对抗原结合造成焓贡献的残基。参见例如makabe等人，journalofbiologicalchemistry,283：1156-1166,2008。其他cdr边界定义可能不严格遵守上述方法中之一，但将与至少部分的kabatcdr重叠，不过它们可能基于特定残基或残基群或甚至整个cdr不显著影响抗原结合的预测或实验结果被缩短或延长。如本文中所使用，cdr可是指由本技术领域中已知的任何方法(包括多种方法的组合)而界定的cdr。用在本文中的方法可利用根据这些方法中任一者所界定的cdr。对于包含超过一种cdr的任何给定实施方案，所述cdr可根据kabat、chothia、延长、abm、接触和/或构象定义中任一加以界定。

如本文中所使用，“单克隆抗体”是指自实质上均质的抗体群所获得的抗体，即除了可能少量存在的可能天然发生的突变以外，组成该群体的个体抗体是相同的。单克隆抗体具高度特异性，其是以单一抗原位点为目标。此外，不同于通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，各单克隆抗体是以抗原上的单一决定簇为目标。修饰语“单克隆”指示出是自实质上均质的抗体群体所获得的抗体的特征，并且不被解读为需要通过任何特定的方法产生该抗体。例如，根据本发明所使用的单克隆抗体可通过首先由kohlerandmilstein,nature256：495,1975所描述的杂交瘤方法来制成，或可通过重组dna方法诸如美国专利号4,816,567中所述的来制成。所述单克隆抗体还可自使用例如mccafferty等人,nature348：552-554,1990中所述的技术而产生的噬菌体库来分离。

如本文中所使用，“人源化”抗体是指非人(例如鼠)抗体的形式，其为包含源自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合性免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如fv、fab、fab’、f(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)。优选地，人源化抗体是其中源自接受者的互补决定区(cdr)的残基被源自具有期望的特异性、亲和力和能力的非人物种(诸如小鼠、大鼠或兔)(捐赠者抗体)的cdr的残基所替代的人免疫球蛋白(接受者抗体)。在一些情况中，人免疫球蛋白的fv构架区(fr)残基被对应的非人残基所替代。另外，该人源化抗体可包含不见于接受者抗体或不见于经导入的cdr或构架序列中的残基，但该些残基被包括以进一步改善和优化抗体的表达。一般而言，人源化抗体将包含实质上所有的至少一个并且通常两个可变结构域，其中所有或实质上所有的cdr区对应非人免疫球蛋白的cdr区并且所有或实质上所有的fr区是人免疫球蛋白共有序列的fr区。该人源化抗体还将理想地包含至少部分的免疫球蛋白恒定区或恒定域(fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区或恒定结构域。优选地具有如wo99/58572中所述的经修饰的fc区的抗体。其他形式的人源化抗体具有一个或多个相对于原始抗体经改变的cdr(cdrl1、cdrl2、cdrl3、cdrh1、cdrh2或cdrh3)，所述cdr还被称为一个或多个“衍生自”原始抗体之一个或多个cdr的cdr。

如本文中所使用，“人抗体”是指具有对应由人所产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体，和/或利用任何本领域技术人员所知或本文所公开的制备人抗体的技术所制备的抗体。此定义的人抗体包括含有至少一个人重链多肽或至少一个人轻链多肽的抗体。一个所述实例是包含小鼠轻链和人重链多肽的抗体。人抗体可利用该领域已知的多种技术制备。在一个实施方案中，该人抗体选自噬菌体库，其中该噬菌体库表达人抗体(vaughan等人,naturebiotechnology,14：309-314,1996；sheets等人,proc.natl.acad.sci.(usa)95：6157-6162,1998；hoogenboomandwinter,j.mol.biol.,227：381,1991；marks等人,j.mol.biol.,222：581,1991)。人抗体还可通过免疫接种动物加以制备，该动物体内的内源性基因座已被转基因导入的人免疫球蛋白基因座所取代，例如其中内源性免疫球蛋白基因已被部分或完全失活的小鼠。此方法描述于美国专利第5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016号。或者，该人抗体可通过使产生针对靶抗原的抗体的人b淋巴细胞永生化加以制备(所述b淋巴细胞可自受试者收集或自该cdna的单细胞克隆收集或可能在试管内经免疫)。见例如cole等人monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,p.77,1985；boerner等人,j.immunol.,147(1)：86-95,1991和美国专利第5,750,373号。

术语“嵌合抗体”用来指其中的可变区序列源自一个物种并且恒定区序列源自另一物种的抗体，诸如其中该可变区序列源自小鼠抗体并且该恒定区序列源自人抗体的抗体。

术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换使用以指称任何长度的氨基酸链。例如，该链可以是相对短(例如10至100个氨基酸)或更长的。该链可为线性或分支的，其可能包含经修饰的氨基酸和/或可能被非氨基酸中断。所述术语还包含经天然或人为干预修饰的氨基酸链；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标记成分缀合。该定义还包括例如包含一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及该领域熟知的其他修饰的多肽。应了解的是该多肽可以以单链或相连的链存在。

“单价抗体”每分子包含一个抗原结合位点(例如igg或fab)。在一些情况中，单价抗体可具有超过一个抗原结合位点，但所述结合位点源自不同抗原。

“单特异性抗体”每分子包含两个相同抗原结合位点(例如igg)而使所述两个结合位点结合抗原上的相同表位。由此，它们互相竞争结合至一个抗原分子。大部分自然界中所见的抗体是单特异性。在一些情况中，单特异性抗体还可以是单价抗体(例如fab)。

“双价抗体”每分子包含两个抗原结合位点(例如igg)。在一些情况中，该两个结合位点具有相同的抗原特异性。然而，双价抗体可为双特异性。

“双特异性”或“双重特异性”抗体是具有两个不同的抗原结合位点的杂交抗体。双特异性抗体的两个抗原结合位点结合至两个不同表位，所述表位可位于相同或不同的蛋白质靶上。

“双功能性”是在两个臂中具有相同抗原结合位点(即相同氨基酸序列)但各结合位点可识别两个不同抗原的抗体。

“异多聚体”、“异多聚体复合物”或“异多聚体多肽”是包含至少第一多肽和第二多肽的分子，其中该第二多肽与第一多肽的氨基酸序列至少一个氨基酸残基不同。异多聚体可包含由该第一多肽和第二多肽所形成的“异二聚体”，或者可形成更高级的三级结构，其中存在除了第一多肽和第二多肽以外的多肽。

“异二聚体”、“异二聚体蛋白”、“异二聚体复合物”或“异多聚体多肽”是包含第一多肽和第二多肽的分子，其中该第二多肽与第一多肽的氨基酸序列至少一个氨基酸残基不同。

如本文所用的“铰链区”、“铰链序列”、及其变化形式包括此项技术中已知的含义，其于例如janeway等人,immunobiology：theimmunesysteminhealthanddisease,(elsevierscienceltd.,ny)(4thed.,1999)；bloom等人,proteinscience(1997),6：407-415；humphreys等人,j.immunol.methods(1997),209：193-202中说明。

如本文中所使用，“免疫球蛋白样铰链区”、“免疫球蛋白样铰链序列”、及其变体是指免疫球蛋白样或抗体样分子(例如免疫粘附素)的铰链区和铰链序列。在一些实施例中，免疫球蛋白样铰链区可来自或来源于任何igg1、igg2、igg3或igg4亚型或来自iga、ige、igd或igm，包括其嵌合形式，例如嵌合igg1/2铰链区。

术语“免疫效应细胞”或“效应细胞”如本文中所使用是指人类免疫系统中天然细胞库之内的细胞，其可经活化而影响靶细胞的活力。靶细胞的活力可包括细胞存活、增殖和/或与其他细胞相互作用的能力。

本发明的抗体可使用本技术领域中熟知的技术(例如重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或这样的技术的组合或其他本技术领域中已知的技术)来产生(参见例如jayasena,s.d.,clin.chem.,45：1628-50,1999和fellouse,f.a.,etal,j.moi.biol.,373(4)：924-40,2007)。

如本技术领域中已知，“多核苷酸”或“核酸”在本文中互换使用，是指任何长度的核苷酸链，并且包括dna和rna。该核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或任何可通过dna或rna聚合酶被并入链中的基质。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。若存在的话，对核苷酸结构的修饰可在该链组合之前或之后进行。核苷酸的序列可被非核苷酸成分中断。多核苷酸在聚合之后可进一步被修饰，诸如与标记组分缀合。其他类型的修饰包括例如“盖帽(cap)”、以类似物取代一个或多个天然发生的核苷酸、核苷酸间修饰诸如具有不带电键联(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸酯等)和带电键联(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些、含有侧基团的那些，诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚l-赖氨酸等)、具有嵌入剂(intercalator)的那些(例如吖啶、补骨脂素等)、含有螯合剂的那些(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)、含有烷化剂的那些、具有经修饰的键联的那些(例如α异位性核酸等)以及未经修饰的多核苷酸形式。另外，任何通常存在于糖类中的羟基可能被例如膦酸基、磷酸基取代、被标准保护基保护或被活化以制备与其他核苷酸的额外键联，或可能与固体支持物缀合。该5’和3’端oh可被磷酸化或被胺类或1至20个碳原子的有机盖帽基团取代。其他羟基还可被衍生成为标准保护基。多核苷酸还可包含该领域通常已知的核糖或脱氧核糖糖类的类似形式，包括例如2’-o-甲基-核糖、2’-o-烯丙基核糖、2’-氟-核糖、2’-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α或β异位性糖类、差向异构体糖类诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖糖类、呋喃糖糖类、景天酮庚糖、非环类似物和无碱基核苷类似物诸如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键联可被替代性连接基团取代。替代性连接基团包括但不限于其中磷酸盐被p(o)s(“硫代盐(thioate)”)、p(s)s(“二硫代盐(dithioate)”)、(o)nr2(“酰胺化物(amidate)”)、p(o)r、p(o)or’、co或ch2(“甲缩醛(formacetal)”)取代的实施方案，其中各r或r’是独立地h或经取代或未经取代的烷基(1至20个c)，该烷基可选择地含有醚(-o-)键联、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。并非多核苷酸中的所有键联需要完全相同。前面的叙述适用于在本文中提及的所有多核苷酸，包括rna和dna。

本技术领域中已知，抗体的“恒定区”是指(不论单独或经组合的)抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。

如本文中所使用，“实质上纯的”是指其为至少50％纯的(也就是不含污染物)，更优选地至少90％纯的，更优选地至少95％纯的，甚至更优选地至少98％纯的，并且最优选至少99％纯的物质。

“宿主细胞”包括可以或已经接受载体以导入多核苷酸插入物的个体细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代，并且该后代可能因为天然、意外或蓄意突变而不一定与原始亲代细胞完全相同(在形态学或基因学dna互补性上)。宿主细胞包括经本发明的多核苷酸在体内转染的细胞。

如本领域所知，术语“fc区”用于定义免疫球蛋白重链的c端区域。该“fc区”可为天然序列fc区或变体fc区。虽然免疫球蛋白重链的fc区的边界可能不同，人igg重链fc区通常被定义为从cys226处的氨基酸残基或从pro230延伸至其羧基端。fc区中的残基编号是如kabat所述的eu指数。kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,1991。免疫球蛋白的fc区大致上包含ch2和ch3两个恒定区。

如本技术领域中所使用，“fc受体”或“fcr”描述结合至抗体的fc区的受体。较佳的fcr是天然序列人fcr。另外，较佳的fcr是与igg抗体结合的受体(γ受体)并且包括fcγri、fcγrii和fcγriii亚型的受体，包括等位基因变体和所述受体的选择式剪接形式。fcγrii受体包括fcγriia(“活化受体”)和fcγriib(“抑制受体”)，其具有类似的氨基酸序列但主要差异在于其胞质结构域。fcr是于ravetchandkinet,ann.rev.immunol.,9：457-92,1991；capel等人，immunomethods,4：25-34,1994；和dehaas等人，j.lab.clin.med.,126：330-41,1995中综述。“fcr”还包括新生儿受体fcrn，该受体负责转运母体igg至胎儿(guyer等人，j.immunol.,117：587,1976；和kim等人，j.immunol.,24：249,1994)。

术语“竞争”如本文中所使用，就抗体而言，是指第一抗体或其抗原结合片段(或部分)与表位结合的方式充分类似于第二抗体或其抗原结合部分的结合，使得第一抗体与其同源表位于第二抗体存在时的结合结果呈可检测地降低，相较于第二抗体不存在时该第一抗体与其同源表位的结合。或者，该情况可为但不一定是该第二抗体与其表位的结合还因第一抗体的存在而可检测地降低。也就是说，第一抗体可抑制第二抗体与其表位的结合，但第二抗体不抑制该第一抗体与其个体表位的结合。然而，当各种抗体不论以相同、较高或较低程度可检测地抑制另一抗体与其同源表位或配体结合时，所述抗体被称为彼此“交叉竞争”与其个体表位的结合。本发明包含竞争抗体和交叉竞争抗体。不论该竞争或交叉竞争所藉以发生的机制为何(例如空间位阻、构象变化或与共同表位或其部分结合)，本领域技术人员将了解根据本文所提供的公开内容，本发明包含竞争和/或交叉竞争抗体并且其可被用于本文所公开的方法。

“功能性fc区”具有天然序列fc区的至少一种效应功能。示例性“效应功能”包括c1q结合、补体依赖性细胞毒性、fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、吞噬作用、下调细胞表面受体(例如b细胞受体)等。所述效应功能通常需要fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)结合并且可利用本领域已知的各种用于评估所述抗体效应功能的测定检测。

“天然序列fc区”包含与在天然中发现的fc区的氨基酸序列完全相同的氨基酸序列。“变体fc区”包含与天然序列fc区有至少一个氨基酸修饰的差异的氨基酸序列，但仍保留该天然序列fc区的至少一种效应功能。在一些实施方案中，该变体fc区相较于天然序列fc区或亲代多肽的fc区具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列fc区或亲代多肽的fc区中自约1至约10个氨基酸取代，并且优选地自约1至约5个氨基酸取代。在本文中，变体fc区将优选地具有与天然序列fc区和/或与亲代多肽的fc区至少约80％的序列同一性，最优选具有至少约90％的序列同一性，更优选地具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的序列同一性。

术语“效应功能”是指可归因于抗体的fc区的生物活性。抗体效应功能的实例包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、fc受体结合、补体依赖性细胞毒性(cdc)、吞噬作用、c1q结合和细胞表面受体(例如b细胞受体(bcr))的下调。参见例如u.s.patno.6,737,056。所述效应功能通常需要fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)结合并且可利用本领域已知的各种用于评估所述抗体效应功能的测定检测。示例性效应功能检测是经由fcγ3和/或c1q结合。

如本文中所使用，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“adcc”是指经细胞介导的反应，其中表达fc受体(fcr)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的经结合的抗体，并且随后造成该靶细胞裂解。所关注的分子的adcc活性可使用体外adcc测定来评估，诸如美国专利第5,500,362或5,821,337号中所述的。可用于该试验的效应细胞包括外周血液单核细胞(pbmc)和nk细胞。或者或此外，所关注的分子的adcc活性可于体内(例如动物模型中)评估，诸如clynes等人,1998,pnas(usa),95：652-656中所公开的。

“补体依赖性细胞毒性”或“cdc”是指在补体存在下裂解靶。该补体活化途径是由补体系统的第一补体(c1q)与和同源抗原(cognateantigen)复合的分子(例如抗体)结合所启动。为了评估补体活化，可进行例如gazzano-santoro等人,j.immunol.methods,202：163(1996)所述的cdc测定。

如本文中所使用，“治疗”是指得到有益或期望临床结果的方法。以本发明的目的而言，有益或期望的临床结果包括但不限于下列一或多项：减少(或摧毁)赘生(neoplastic)或癌性细胞的增殖、抑制赘生细胞转移、缩小或减少表达egfrviii的肿瘤的尺寸、缓解egfrviii相关性疾病(例如癌)、减少egfrviii相关性疾病(例如癌)所导致的症状、提高罹患egfrviii相关性疾病(例如癌)者的生活质量、减少治疗egfrviii相关性疾病(例如癌)所需的其他药物的剂量、推迟egfrviii相关性疾病(例如癌)的进展、治愈egfrviii相关性疾病(例如癌)和/或延长有egfrviii相关性疾病(例如癌)的患者的存活。

“减缓”意指相较于未施用egfrviii抗体(单特异性或双特异性)，减轻或改善一种或多种症状。“减缓”还包括缩短或减少症状的持续时间。

如本文中所使用，药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以产生任一种或多种有益或期望结果的量。就预防性用途而言，有益或期望结果包括消除或减少风险、减轻严重性或延迟疾病的开始，包括疾病的生化学、组织学和/或行为学的症状、其并发症和在疾病发展期间所表达的中间病理学表型。就治疗性用途而言，有益或期望结果包括下列临床结果：诸如一种或多种egfrviii相关性疾病或病况(诸如多发性骨髓瘤)的发生率减少或缓解、降低治疗该疾病所需的其他药物的剂量、提高其他药物的效果和/或推迟患者的egfrviii相关性疾病进展。有效剂量可分一次或多次施用来施用。就本发明的目的而言，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。如在临床上所了解的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可能与或可能不与另一药物、化合物或药物组合物组合达到。因此，“有效剂量”可在施用一种或多种治疗剂的情况中被考虑，并且可考虑给予有效量的单一药剂，若与一种或多种其他药剂组合时可能或会实现期望的结果。

“个体”或“受试者”是哺乳动物，更优选者是人。哺乳动物还包括但不限于灵长动物、马、犬、猫、小鼠和大鼠。

如本文中所使用，“载体”意指构建体，其能在宿主细胞中递送和优选地表达一种或多种所关注的基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒性载体、裸dna或rna表达载体、质粒载体、粘质粒载体或噬菌体载体、与阳离子缩合剂有关的dna或rna表达载体、包封于脂质体中的dna或rna表达载体和某些真核细胞诸如生产细胞。

如本文中所使用，“表达控制序列”意指引导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可为启动子，诸如组成型或诱导性启动子或增强子。表达控制序列可操作地与期望转录的核酸序列连接。

如本文中所使用，“药学上可接受的载体”或"药学上可接受的赋形剂”包括当与活性成分组合时能使该成分保留生物活性并且不与受试者的免疫系统反应的任何物质。实例包括但不限于任何标准医药载剂诸如磷酸盐缓冲液溶液、水、乳液诸如油/水乳液和各种类型的润湿剂。优选的用于气溶胶或肠胃外施用的稀释剂是磷酸盐缓冲液(pbs)或生理(0.9％)盐水。包含所述载体的组合物由众所周知的熟知方法调制(见例如remington'spharmaceuticalsciences,18thedition,a.gennaro,ed.,mackpublishingco.,easton,pa,1990；和remington,thescienceandpracticeofpharmacy21sted.mackpublishing,2005)。

术语“含有谷氨酰胺的酰基供体标签(acyldonorglutamine-containingtag)”或“谷氨酰胺标签”如本文中所使用是指含有一个或多个gln残基的多肽或蛋白质，其作为转谷氨酰胺酶胺受体。参见例如wo2012059882和wo2015015448。

术语“kon”或“ka”如本文中所使用是指抗体与抗原结合的速率常数。特别地，所述速率常数(kon/ka和koff/kd)和平衡解离常数使用整个抗体(即双价)和单体egfrviii蛋白(例如经组氨酸标记的egfrviii融合蛋白)来测量。

术语“koff”或“kd”如本文中所使用是指抗体自抗体/抗原复合物解离的速率常数。

术语“kd”如本文中所使用是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。

在本文中提及“约”某数值或参数时，包括(并且描述)与该数值或参数本身相关的实施方案。举例来说，提及“约x”的术语包括“x”的描述。数值范围包含界定该范围的数值。大致上来说，术语“约”是指变量的指示数值和是指在指示数值的实验误差内变量的所有数值(例如针对平均值的95％置信区间内)或指示数值的10百分比内，无论哪个较大。若术语“约”用于时间区段(年、月、周、天等)上下文内，术语“约”意指时间段加上或减少下一级时间段的一个量(例如约1年意指11至13个月；约6个月意指6个月加上或减少1周；约1周意指6至8天等)或所指示数值10百分比，无论哪个较大。

应了解的是，只要本文的实施方案是以术语“包含”描述，其还提供其他以“由...组成”和/或“实质上由...组成”的术语所描述的类似实施方案。

本发明的方面或实施方案以马库什组或其他选择性形式的组描述，本发明不仅包含被标示为整体的整个组，但还包含该组的个体成员和该主要组中所有可能的亚群，并且还包含不含其中一个或多个组成员的主要组。本发明还设想明确排除本发明中任何组成员中的一个或多个。

除非另有界定，否则用于本文中的所有技术和科学术语具有如本发明所属的技术领域中的普通技术人员一般所了解的相同意义。若有相冲突的情况，以本说明书、包括定义为主。在本说明书和申请专利范围中，术语“包含”或其变型诸如“包括”或“含有”将被理解为意指包括被叙述的整体或整体的群，但不排除任何其他整体或整体的群。除非上下文另外要求，单数术语应包括复数意义并且复数术语应包括单数意义。

示例性方法和材料于本文叙述，不过与本文所述的方法和材料类似或相等者也可被用于实施或检测本发明。材料、方法和实例是仅供说明并且不意欲为限制。

egfrviii抗体和其制备方法

本发明提供结合egfrviii的抗体[例如人egfrviii(例如登录号：p00533featureidentifiervar_066493，或genbank登录号ajn69267；mrpsgtagaallallaalcpasraleekkgnyvvtdhgscvracgadsyemeedgvrkckkcegpcrkvcngigigefkdslsinatnikhfknctsisgdlhilpvafrgdsfthtppldpqeldilktvkeitgflliqawpenrtdlhafenleiirgrtkqhgqfslavvslnitslglrslkeisdgdviisgnknlcyantinwkklfgtsgqktkiisnrgensckatgqvchalcspegcwgpeprdcvscrnvsrgrecvdkcnllegeprefvenseciqchpeclpqamnitctgrgpdnciqcahyidgphcvktcpagvmgenntlvwkyadaghvchlchpnctygctgpglegcptngpkipsiatgmvgalllllvvalgiglfmrrrhivrkrtlrrllqerelvepltpsgeapnqallrilketefkkikvlgsgafgtvykglwipegekvkipvaikelreatspkankeildeayvmasvdnphvcrllgicltstvqlitqlmpfgclldyvrehkdnigsqyllnwcvqiakgmnyledrrlvhrdlaarnvlvktpqhvkitdfglakllgaeekeyhaeggkvpikwmalesilhriythqsdvwsygvtvwelmtfgskpydgipaseissilekgerlpqppictidvymimvkcwmidadsrpkfreliiefskmardpqrylviqgdermhlpsptdsnfyralmdeedmddvvdadeylipqqgffsspstsrtpllsslsatsnnstvacidrnglqscpikedsflqryssdptgaltedsiddtflpvpeyinqsvpkrpagsvqnpvyhnqplnpapsrdphyqdphstavgnpeylntvqptcvnstfdspahwaqkgshqisldnpdyqqdffpkeakpngifkgstaenaeylrvapqssefiga(seqidno：201))]并且特征在于下列特征中的一个或多个：(a)降低或下调egfrviii的蛋白质表达；(b)治疗、预防、减缓受试者中与表达egfrviii的恶性细胞相关的的病况的一种或多种症状(例如癌症，诸如多型性胶质母细胞瘤)；(c)抑制受试者中肿瘤生长或进展(其具有表达egfrviii的恶性肿瘤)；(d)抑制受试者(其具有一个或多个表达egfrviii的恶性细胞)中表达egfrviii的癌(恶性)细胞的转移；(e)诱发表达egfrviii的肿瘤消退(例如长期消退)；(f)在表达egfrviii的恶性细胞中发挥细胞毒性活性；(g)阻断egfrviii与其他尚未经鉴定的因子的相互作用；和/或(h)诱发杀除或抑制邻近非表达egfrviii的恶性细胞生长的旁观者效果。

在一个方面中，所提供的是分离的抗体，其特异性结合egfrviii，其中该抗体包含(a)重链可变(vh)区，其包含(i)vh互补决定区1(cdr1)，其包含显示于seqidno：62、63、64、74、75、76、80、81、82、88、89、90、93、94、95、99、100、101、109、110、111、115、116、117、121、122、123、132、133、134、137、138、139、143、144或145中的序列；(ii)vhcdr2，其包含显示于seqidno：65、66、68、69、70、71、77、78、83、84、86、87、91、92、96、97、98、102、103、105、106、112、113、118、119、124、125、127、128、130、131、135、136、140、141、146、147、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235或237中的序列；和iii)vhcdr3，其包含显示于seqidno：67、72、73、79、85、104、107、108、114、120、126、129、142、148、219、220、221、222、223或236中的序列；和/或(b)轻链可变(vl)区，其包含(i)vlcdr1，其包含显示于seqidno：149、154、156、159、162、165、166、168、169、170、171、173、174、176、178、181、182、185、187、190、192、195、198、238或239中的序列；(ii)vlcdr2，其包含显示于seqidno：150、152、155、157、160、163、172、175、179、183、186、188、191、193、196或199中的序列；和(iii)vlcdr3，其包含显示于seqidno：151、153、158、161、164、167、177、180、184、189、194、197或200中的序列。

在另一方面中，所提供的是分离的抗体，其特异性结合egfrviii，其中该抗体包含：vh区，其包含显示于seqidno：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、30、32、34、35、37、39、41、43、44、46、48、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、202、203、204、205、206、207、208、209、210、214、216、217或218中的vh序列的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3；和/或vl区，其包含显示于seqidno：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、29、31、33、36、38、40、42、45、47、49、51、211、212、213或215中的vl序列的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。

在一些实施方案中，所提供的是具有如表1中所列的部分轻链序列的任一者和/或如表1中所列的部分重链序列的任一者。在表1中，画底线序列是根据kabat的cdr序列，粗体是根据chothia的cdr序列。

表1

在本文中，还所提供的是针对egfrviii的抗体的抗原结合结构域的cdr部分(包括chothia、kabatcdr和cdr接触区)。cdr区的测定是在本领域技术人员能力范围内的。应了解的是，在一些实施方案中，cdr可以是kabat和chothiacdr的组合(还称为“结合型cr(combinedcr)”或“延长型的cdr(extendedcdr)”)。在一些实施方案中，所述cdr是kabatcdr。在其他实施方案中，所述cdr是chothiacdr。换言之，在具有多于一个cdr的实施方案中，所述cdr可以是kabat、chothia、组合的cdr的任一者或其组合。表2提供在本文中所提供的cdr序列实例。

表2

在一些实施方案中，本发明提供与本文中所述的抗体结合并且竞争的抗体，本文中所述的抗体包括m62g7、h62g7、h62g7-h14/l1-dv、h62g7-eq/l6、42g9、32a10、20b9、14c11、21e11、49b11、46e10、12h6、19a9、21e7、11b11、12b2、11f10、17g11、29d5、30d8、20e12、26b9、32g8、34e7、20g5、c6、b5、42g9-1、32a10-1、20b9-1、14c11-1、21e11-1、49b11-1、46e10-1、12h6-1、19a9-1、21e7-1、11b11-1、12b2-1、11f10-1、17g11-1、29d5-1、30d8-1、20e12-1、26b9-1、32g8-1、34e7-1、20g5-1、c6-1和b5-1。

在一些实施方案中，本发明还提供基于cdr接触区的针对egfrviii抗体的抗体cdr部分。cdr接触区是使抗体对抗原具有特异性的抗体区域。一般而言，cdr接触区包括cdr和vernier区(vernierzone)中的残基位置，其受拘束以维持抗体结合特定抗原的适当环结构。参见例如makabe等人,j.biol.chem.,283：1156-1166,2007。cdr接触区的测定是在本领域技术人员的能力范围内的。

如本文中所述的egfrviii抗体对egfrviii(诸如人egfrviii(例如(seqidno：201))的结合亲和力(kd)可以是约0.001至约5000nm。在一些实施方案中，该结合亲和力是约5000nm、4500nm、4000nm、3500nm、3000nm、2500nm、2000nm、1789nm、1583nm、1540nm、1500nm、1490nm、1064nm、1000nm、933nm、894nm、750nm、705nm、678nm、532nm、500nm、494nm、400nm、349nm、340nm、353nm、300nm、250nm、244nm、231nm、225nm、207nm、200nm、186nm、172nm、136nm、113nm、104nm、101nm、100nm、90nm、83nm、79nm、74nm、54nm、50nm、45nm、42nm、40nm、35nm、32nm、30nm、25nm、24nm、22nm、20nm、19nm、18nm、17nm、16nm、15nm、12nm、10nm、9nm、8nm、7.5nm、7nm、6.5nm、6nm、5.5nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm、0.5nm、0.3nm、0.1nm、0.01nm或0.001nm的任何者。在一些实施方案中，该结合亲和力是小于约5000nm、4000nm、3000nm、2000nm、1000nm、900nm、800nm、250nm、200nm、100nm、50nm、30nm、20nm、10nm、7.5nm、7nm、6.5nm、6nm、5nm、4.5nm、4nm、3.5nm、3nm、2.5nm、2nm、1.5nm、1nm或0.5nm的任何者。

双特异性抗体为对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，可使用在本文中所公开的抗体来制备。用于产生双特异性抗体的方法是本领域中已知的(参见例如suresh等人,methodsinenzymology121：210,1986)。传统上，双特异性抗体的重组产生是基于共同表达两个免疫球蛋白重链-轻链对，其具有两个有不同特异性的重链(millsteinandcuello,nature305,537-539,1983)。因此，在一个方面中，所提供的是双特异性抗体，其中该双特异性抗体是全长的人抗体，其包含特异性结合靶抗原(例如egfrviii)的该双特异性抗体的第一抗体可变结构域，和包含能够通过特异性结合位于人免疫效应细胞上的效应抗原而召募人免疫效应细胞活性的该双特异性抗体的第二抗体可变结构域。

人免疫效应细胞可以是本技术领域中已知的任何各种免疫效应细胞。例如，该免疫效应细胞可以是人类淋巴细胞谱系的成员，其包括但不限于t细胞(例如细胞毒性t细胞)、b细胞和天然杀伤(nk)细胞。该免疫效应细胞还可例如(而不限制)为人骨髓样谱系的成员，其包括但不限于单核细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞。这样的免疫效应细胞可对靶细胞具有细胞毒性或细胞凋亡效果或在通过结合效应抗原而活化时的其他期望效果。

该效应抗原是表达在人免疫效应细胞上的抗原(例如蛋白质或多肽)。可由异二聚体蛋白(例如异二聚体抗体或双特异性抗体)所结合的效应抗原的实例包括但不限于人cd3(或cd3(分化簇)复合物)、cd16、nkg2d、nkp46、cd2、cd28、cd25、cd64和cd89。

该靶细胞可以是对人为原生(native)或外来者。在原生靶细胞中，该细胞可已转化成恶性细胞或是病理性改性的(例如原生靶细胞被病毒、疟原虫(plasmodium)或细菌感染)。在外来靶细胞中，该细胞是侵入病原体，诸如细菌、疟原虫或病毒。

靶抗原在疾病状况(例如发炎疾病、增殖性疾病(例如癌症)、免疫失调、神经疾病、神经退化疾病、自体免疫疾病、感染疾病(例如病毒感染或寄生性感染)、过敏反应、移植物抗宿主疾病或宿主抗移植物疾病)中被表达在靶细胞上。靶抗原并非效应抗原。在一些实施方案中，该靶抗原是egfrviii。

在一些实施方案中，所提供的是双特异性抗体，其中该双特异性抗体是全长的人抗体，其包含特异性结合靶抗原的该双特异性抗体的第一抗体可变结构域，和包含能够通过特异性结合位于人免疫效应细胞上的效应抗原而召募人免疫效应细胞活性的该双特异性抗体的第二抗体可变结构域，其中该第一抗体可变结构域包含重链可变(vh)区，其包含显示于seqidno：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、30、32、34、35、37、39、41、43、44、46、48、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、202、203、204、205、206、207、208、209、210、214、216、217或218中的vh序列的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3；和/或轻链可变(vl)区，其包含显示于seqidno：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、29、31、33、36、38、40、42、45、47、49、51、211、212、213或215中的vl序列的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。

在一些实施方案中，所提供的是双特异性抗体，其中该双特异性抗体是全长的人抗体，其包含特异性结合靶抗原的该双特异性抗体的第一抗体可变结构域，和包含能够通过特异性结合位于人免疫效应细胞上的效应抗原而召募人免疫效应细胞活性的该双特异性抗体的第二抗体可变结构域，其中该第一抗体可变结构域包含(a)重链可变(vh)区，其包含(i)vh互补决定区1(cdr1)，其包含显示于seqidno：62、63、64、74、75、76、80、81、82、88、89、90、93、94、95、99、100、101、109、110、111、115、116、117、121、122、123、132、133、134、137、138、139、143、144或145中的序列；(ii)vhcdr2，其包含显示于seqidno：65、66、68、69、70、71、77、78、83、84、86、87、91、92、96、97、98、102、103、105、106、112、113、118、119、124、125、127、128、130、131、135、136、140、141、146、147、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235或237中的序列；和iii)vhcdr3，其包含显示于seqidno：67、72、73、79、85、104、107、108、114、120、126、129、142、148、219、220、221、222、223或236中的序列；和/或(b)轻链可变(vl)区，其包含(i)vlcdr1，其包含显示于seqidno：149、154、156、159、162、165、166、168、169、170、171、173、174、176、178、181、182、185、187、190、192、195、198、238或239中的序列；(ii)vlcdr2，其包含显示于seqidno：150、152、155、157、160、163、172、175、179、183、186、188、191、193、196或199中的序列；和(iii)vlcdr3，其包含显示于seqidno：151、153、158、161、164、167、177、180、184、189、194、197或200中的序列。

在一些实施方案中，该第二抗体可变结构域包含重链可变(vh)区，其包含显示于seqidno：240中的vh序列的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3；和/或轻链可变(vl)区，其包含显示于seqidno：241中的vl序列的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。

在一些实施方案中，该第二抗体可变结构域包含(a)重链可变(vh)区，其包含(i)vh互补决定区1(cdr1)，其包含显示于seqidno：244、110或245中的序列；(ii)vhcdr2，其包含显示于seqidno：246或247中的序列；和iii)vhcdr3，其包含显示于seqidno：248中的序列；和/或(b)轻链可变(vl)区，其包含(i)vlcdr1，其包含显示于seqidno：249中的序列；(ii)vlcdr2，其包含显示于seqidno：250中的序列；和(iii)vlcdr3，其包含显示于seqidno：251中的序列。

表3显示第二抗体可变结构域(对cd3具有特异性)的特定氨基酸和核酸序列。在表3中，画底线序列是根据kabat的cdr序列，粗体是根据chothia的cdr序列。

表4显示第二抗体可变结构域(对cd3具有特异性)的cdr序列实例。

在一些实施方案中，在本文中所提供的含有cd3特异性可变结构域的双特异性抗体含有抗cd3序列，如美国申请号20160297885中所提供者，其在此为所有目的以引用方式并入。

根据产生双特异性抗体的一个途径，具有期望的结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)经融合至免疫球蛋白恒定区序列。该融合优选的是与免疫球蛋白重链恒定区，其包含至少部分铰链、ch2和ch3区。优选是具有第一重链恒定区(ch1)，其含有轻链结合所必需的位点，存在于所述融合的至少一个中。编码免疫球蛋白重链融合和免疫球蛋白轻链(若需要的话)的dna被插入分开的表达载体，并且共同转染至适合宿主生物中。在当不相等比例的三个多肽链用于构建提供最佳产率时的实施方案中，此在调整三个多肽片段的共有部分提供极大的弹性。然后，当至少两个多肽链的相同比例的表达产生高产率或当比例不为特别重要时，可插入两个或全部三个多肽链的编码序列在一个表达载体中。

在另一途径中，该双特异性抗体由杂合免疫球蛋白重链(其具有第一结合特异性)在一个臂和杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)在另一臂所构成。此不对称结构，仅在双特异性分子的一半具有免疫球蛋白轻链，促进期望的双特异性化合物自非期望免疫球蛋白链组合分离。此途径描述于pct申请号wo94/04690。

在另一途径中，该双特异性抗体是由在一个臂的第一铰链区氨基酸修饰所构成，并且在第一铰链区中的该经取代/经替代的氨基酸具有与在另一臂的第二铰链区对应氨基酸相反的电荷。此方法描述于国际专利申请号pct/us2011/036419(wo2011/143545)。

在另一途径中，期望的异多聚体或异二聚体蛋白(例如双特异性抗体)的形成是通过改变或工程化第一与第二类免疫球蛋白fc区(例如铰链区和/或ch3区)之间界面而增强。在此途径中，该双特异性抗体可由ch3区所构成，其中该ch3区包含第一ch3多肽和第二ch3多肽，其一起相互作用以形成ch3界面，其中在ch3界面内的一个或多个氨基酸去稳定化均二聚体(homodimer)形成并且对均二聚体形成不是静电不利的。此方法描述于国际专利申请号pct/us2011/036419(wo2011/143545)。

在另一途径中，该双特异性抗体可使用经工程化至在一个臂中针对表位(例如egfrviii)的抗体的含有谷氨酰胺的肽标签和经工程化至在另一臂中针对第二表位的第二抗体的另一肽标签(例如含有lys肽标签或反应性内源性lys)来产生(于存在转谷氨酰胺酶下)。此方法描述于国际专利申请号pct/ib2011/054899(wo2012/059882)。

在一些实施方案中，如本文中所述的异二聚体蛋白(例如双特异性抗体)包含全长的人抗体，其中特异性结合靶抗原(例如egfrviii)的双特异性抗体的第一抗体可变结构域，和包含能够通过特异性结合位于人免疫效应细胞上的效应抗原(例如cd3)而召募人免疫效应细胞活性的该双特异性抗体的第二抗体可变结构域，其中该异二聚体蛋白的该第一和第二抗体可变结构域包含人igg2(seqidno：290)的铰链区中位置223、225和228(例如(c223e或c223r)、(e225r)和(p228e或p228r))以及在ch3区中的位置409或368(例如k409r或l368e(eu编码方案))的氨基酸修饰。

在一些实施方案中，该异二聚体蛋白的该第一和第二抗体可变结构域包含人igg1(seqidno：291)的铰链区中位置221和228(例如(d221r或d221e)和(p228r或p228e))以及在ch3区中的位置409或368(例如k409r或l368e(eu编码方案))的氨基酸修饰。

在一些实施方案中，该异二聚体蛋白的该第一和第二抗体可变结构域包含人igg4(seqidno：292)的铰链区中位置228(例如(p228e或p228r))以及在ch3区中的位置409或368(例如r409或l368e(eu编码方案))的氨基酸修饰。

人igg1、igg2和igg4的野生型fc区的氨基酸序列列于下文：

igg2(seqidno:290)

astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

igg1(seqidno:291)

astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

igg4(seqidno:292)

astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk

可用于本发明的抗体可涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如fab、fab’、f(ab’)2、fv、fc等)、嵌合抗体、双特异性抗体、异缀合抗体(heteroconjugateantibody)、单链(scfv)、其突变体、包含抗体部分(例如结构域抗体)的融合蛋白、人源化抗体和任何包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的其他修饰构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰抗体。抗体可以是鼠、大鼠、人或任何其他来源(包括嵌合或人源化抗体)。

在一些实施方案中，如本文中所述的egfrviii抗体是单克隆抗体。例如，egfrviii抗体是人源化单克隆抗体或嵌合单克隆抗体。

在一些实施方案中，该抗体包含经修饰的恒定区，诸如但不限于具有激起免疫反应潜力提高的恒定区。例如，恒定区可以是经修饰以具有对fcγ受体(诸如fcγri、fcγriia或fcγiii)的增加的亲和力。

在一些实施方案中，该抗体包含经修饰的恒定区，诸如免疫惰性的恒定区，即，具有下降的激起免疫反应的潜力。在一些实施方案中，该恒定区的修饰是如eur.j.immunol.,29：2613-2624,1999；pctapplicationno.pct/gb99/01441；和/或ukpatentapplicationno.98099518中所述的。fc可以是人igg1、人igg2、人igg3或人igg4。fc可以是人igg2，并含有突变a330p331至s330s331(igg2△a)，其中氨基酸残基参照野生型igg2序列来编号。eur.j.immunol.,29：2613-2624,1999。在一些实施方案中，该抗体包含igg4的恒定区，其包含下列突变(armour等人,molecularimmunology40585-593,2003)：e233f234l235至p233v234a235(igg4△c)，其中编号是参照野生型igg4。在又另一个实施方案中，fc是人igg4e233f234l235至p233v234a235，具有g236(igg4△b)删除。在另一个实施方案中，fc是任何人igg4fc(igg4、igg4△b或igg4△c)，其含有铰链稳定化突变s228至p228(aalberse等人,immunology105,9-19,2002)。在另一个实施方案中，fc可以是经去糖基化(aglycosylated)的fc。

在一些实施方案中，该恒定区通过突变恒定区中的寡糖接附残基(诸如asn297)和/或糖基化识别序列部分的侧翼残基而去糖基化。在一些实施方案中，该恒定区针对n-连接的糖基化而被酶促去糖基化。该恒定区可以是针对n-连接的糖基化而被酶促去糖基化或在糖基化缺陷宿主细胞中表达而被去糖基化。

在一些实施方案中，该恒定区具有经修饰的恒定区，其移除或减少fcγ受体结合。例如，fc可以是含有d265突变的人igg2，其中该氨基酸残基是参照野生型igg2序列(seqidno：290)而编号。因此，在一些实施方案中，该恒定区具有经修饰的恒定区，其具有显示于seqidno：252中的序列：

astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkcrvrcprcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvavshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpssiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflysrltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

编码显示于seqidno：252中的序列的核酸是显示于seqidno：253：

gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtagtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgtcgtgtcaggtgcccaaggtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggccgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccatcctccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa。

在一些实施方案中，该恒定区具有经修饰的恒定区，其具有显示于seqidno：254中的序列：

astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkcevecpecpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvavshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpssiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltcevkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

编码显示于seqidno：254中的序列的核酸是显示于seqidno：255：

gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtagtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgtgaggtcgagtgcccagagtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggccgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccatcctccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcgaggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa。

人kappa恒定区的氨基酸是显示于seqidno：256：gtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec。并且编码seqidno：256中的序列的核酸是显示于seqidno：257：

ggaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag。

测定抗体对egfrviii的结合亲和力之一种方式是测量双价抗体对单体egfrviii蛋白质的结合亲和力。egfrviii抗体的亲和力可通过配备有预先固定化的抗小鼠fc或抗人fc的表面等离子体共振(biacore^tm3000^tm表面等离子体共振系统,biacore^tm,inc,piscatawaynj)、使用hbs-ep运行缓冲液(0.01mhepes,ph7.4,0.15nacl,3mmedta,0.005％v/vsurfactantp20)来测定。经单体性8个组氨酸标记的人egfrviii胞外结构域可被稀释于hbs-ep缓冲液至小于0.5μg/ml的浓度并使用各种接触时间跨个体芯片通道来注射，以达到两个抗原密度范围，针对详细动力学研究为50至200反应单位(ru)或针对筛选测定为800至1,000ru。再生研究已显示25mmnaoh于25％v/v乙醇中有效地移除结合的egfrviii蛋白质而维持芯片上egfrviii抗体的活性超过200次注射。通常，经纯化的经8个组氨酸标记的egfrviii样本的连续稀释(横跨0.1至10x浓度的估计kd)是注射1min(100μl/分钟)并且允许达至2小时的解离时间。egfrviii蛋白质的浓度是通过在280nm下的吸光度基于经8个组氨酸标记的egfrviii蛋白质的序列特异性消光系数来测定。动力学结合速率(kon或ka)和解离速率(koff或kd)是通过总体拟合数据至1：1langmuir结合模型(karlsson,r.roos,h.fagerstam,l.petersson,b.(1994).methodsenzymology6.99-110)、使用biaevaluation程序而同时获得。平衡解离常数(kd)值以koff/kon计算。此操作方案适合用于测定抗体对任何单体egfrviii结合亲和力，包括人egfrviii、其他动物的egfrviii(诸如小鼠egfrviii、大鼠egfrviii或灵长类egfrviii)，以及不同形式egfrviii(例如经糖基化的egfrviii)。抗体结合亲和力通常在25℃下来测量，但还可在37℃下来测量。

如本文中所述的抗体可通过任何本技术领域中已知方法来制成。对于产生杂交瘤细胞系，宿主动物的免疫化的途径和方案通常依照经建立和熟知的抗体刺激和产生技术，如本文中进一步所述的。用于产生人和小鼠抗体的一般技术是本技术领域中已知的和/或如本文中所述。

应涵盖的是，任何哺乳动物受试者(包括人)或来自其产生抗体细胞可经操作以供作为产生哺乳动物(包括人)和杂交瘤细胞系的基础。通常，宿主动物经由腹腔、肌肉注射、口服、皮下、脚底和/或皮内接种一定量的免疫原，并且包括于此所述的方法。

可使用一般体细胞杂交技术(kohler,b.andmilstein,c.,nature256：495-497,1975)或由buck,d.w.,等人,invitro,18：377-381,1982改良的技术，从淋巴细胞和永生骨髓瘤细胞制备杂交瘤。杂交可使用的骨髓瘤细胞系包括但不限于x63-ag8.653及其他由salkinstitute,celldistributioncenter,sandiego,calif.,usa取得的。一般而言，使用融合剂(fusogen)(如聚乙二醇)或通过电学方法融合骨髓瘤细胞和淋巴细胞细胞的技术均为此技术领域的熟知技术。于融合后，将细胞从融合培养基中相互分离，并且于选定的成长培养基中成长，如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶脱氧核苷(hat)培养基，以去除未杂交的母细胞。于此所述的任何一种培养基，不论是含有血清或不含血清的培养基，均可用来培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。而以另一种细胞融合技术，可使用ebv永生b细胞(ebvimmprtalizedbcell)生产本发明的单克隆抗体。于此技术中杂交瘤将扩大并经过亚克隆，需要时，可使用一般免疫法的步骤(如放射免疫分析法、酶免疫分析法或荧光免疫分析法)检验其上清液中的抗免疫原的活性。

杂交瘤包含所有杂交瘤母细胞的衍生物和子代细胞，均可作为生产对egfrviii或其部分具有特异性的单克隆抗体的抗体来源。

以杂交瘤生产的抗体，可使用熟知方法于体内或体外成长抗体。需要时，还可使用传统纯化免疫球蛋白的方法(如硫酸胺沉淀法、凝胶电泳法、透析法、色层分析法和超过滤作用)，将单克隆抗体由培养基或体液中分离出来。当其中含有不想要的活性抗体存在时，可使用固相上接有由免疫原制成的吸附剂进行纯化，再将想要的抗体由免疫原上冲提并且释放出来。将宿主动物以表达人egfrviii的细胞、人egfrviii蛋白或包含经缀合至蛋白质的靶氨基酸序列的片段免疫化，可产出抗体(如单克隆抗体)群体，其中该蛋白质是为待免疫物种的免疫原，如锁孔帽贝血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin)、血清蛋白(serumalbumin)、牛甲状腺蛋白(bovinethyroglobulin)或使用双功能性或衍生化试剂的大豆胰蛋白酶(soybeantrypsin)抑制剂，例如：顺丁烯二酰亚胺苄酰基磺基琥珀酰亚胺酯(maleimidobenzoylsulfosuccinimideester)(由半胱氨酸残基结合)、n-羟基琥珀酰亚胺(n-hydroxysuccinimide)(由赖氨酸残基结合)、戊二醛(glutaraldehyde)、琥珀酸酐(succinicanhydride)、socl2或r¹n＝c＝nr，其中r和r¹是不同烷基。

需要时，可将所关注的抗体(单克隆或多克隆抗体)测序，并且其核苷酸序列可克隆在载体上用以表达或增殖。编码所关注的抗体的序列可维持于宿主细胞的载体，之后可扩增宿主细胞，并且将其冰冻以供将来利用。在细胞培养中产生重组单克隆抗体可通过本技术领域中已知方法克隆来自b细胞的抗体基因来进行。参见例如tiller等人,j.immunol.methods329,112,2008；美国专利号7,314,622。

或者，多核苷酸序列还可用于基因操作，以将此抗体“人源化”或增进其抗体的亲和力或其他特性。例如，可将恒定区工程化为更像人恒定区，以避免抗体使用于人体临床试验和治疗时产生免疫反应。优选的是，对抗体序列进行基因操作，使其对egfrviii具有更大亲和力并且对抑制egfrviii有更大效力。

人源化单克隆抗体有四个一般步骤。有：(1)确定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸和预测的氨基酸序列；(2)设计人源化抗体，即，确定在人源化过程中使用何种抗体框架区；(3)实际人源化方法/技术；以及(4)转染和表达人源化抗体。参见例如美国专利号4,816,567；5,807,715；5,866,692；6,331,415；5,530,101；5,693,761；5,693,762；5,585,089；和6,180,370。

业已阐述了诸多含有源自非人免疫球蛋白的抗原结合位点的“人源化”抗体分子，包括具有融合至人恒定区的啮齿类或经改造的啮齿类v区及其毗连cdr的嵌合抗体。参见例如winter等人nature349：293-299,1991、lobuglio等人proc.nat.acad.sci.usa86：4220-4224,1989、shaw等人jimmunol.138：4534-4538,1987和brown等人cancerres.47：3577-3583,1987。其他参考文献阐述在与适宜人抗体恒定区融合之前接枝至人支撑构架区(fr)的啮齿类cdr。参见例如riechmann等人nature332：323-327,1988、verhoeyen等人science239：1534-1536,1988和jones等人nature321：522-525,1986。另一参考文献阐述由以重组方式构建的啮齿类构架区支撑的啮齿类cdr。参见例如europeanpatentpublicationno.0519596。这样的“人源化”分子经设计可使针对啮齿类抗人抗体分子的不期望的免疫学反应最小化，否则该不期望的免疫学反应会限制其部分在人接受者中治疗应用的持续时间和效力。例如，抗体恒定区可经工程化而使其免疫学上呈惰性(例如不引发补体裂解)。参见例如pct申请号pct/gb99/01441；ukpatentapplicationno.9809951.8。其他还可利用的人源化抗体的方法是经公开于下列者：daugherty等人,nucl.acidsres.19：2471-2476,1991和美国专利号6,180,377；6,054,297；5,997,867；5,866,692；6,210,671；和6,350,861；和pct申请号wo01/27160。

有关上文讨论的人源化抗体的一般原理还可适用于定制抗体以用于例如犬、猫、灵长类、马和牛。此外，可组合人源化如本文中所述抗体的一个或多个方面，例如cdr移植、构架突变和cdr突变。

在一个变型中，全人抗体可通过使用市售的已被工程化以表达特定人免疫球蛋白的蛋白质的小鼠来获得。还可使用经设计可产生更合乎需要(例如，全人抗体)或具更强免疫反应的转基因动物来产生人源化或人抗体。此技术的实例是xenomousetm(来自abgenix,inc.(fremont,ca))和humab-和tcmousetm(来自medarex,inc.(princeton,nj))。

或者，抗体可用本技术领域中已知的任何方法以重组方式制备并表达。或者，抗体可通过噬菌体展示技术以重组方式制备。参见例如美国专利号5,565,332；5,580,717；5,733,743；和6,265,150；和winter等人,annu.rev.immunol.12：433-455,1994。或者，可使用噬菌体展示技术(mccafferty等人,nature348：552-553,1990)在体外由来自未经免疫的供体的所有免疫球蛋白可变(v)结构域基因产生人类抗体和抗体片段。根据此技术，将抗体v结构域基因在框内克隆至丝状噬菌体(诸如m13或fd)的主要或次要衣壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒含有噬菌体基因组的单链dna拷贝，故基于抗体功能性质的选择还会实现对编码展示其性质的抗体的基因的选择。故噬菌体可模拟b细胞的某些性质。噬菌体展示可在各种形式中进行，文献综述参见例如johnson,kevins.andchiswell,davidj.,currentopinioninstructuralbiology3：564-571,1993。v基因片段的若干来源可用于噬菌体展示。clackson等人,nature352：624-628,1991从源自经免疫小鼠脾的v基因的小型随机组合库中分离到多样系列的抗恶唑酮抗体。可构建来自未经免疫的人类供体的所有v基因，并且可基本依照mark等人,j.mol.biol.222：581-597,1991或griffith等人,emboj.12：725-734,1993所述的技术分离到针对抗原(包括自身抗原)多样阵列的抗体。在天然免疫反应中，抗体基因可以以高比率积累突变(体细胞超突变)。所引入的某些改变会赋予更高的亲和力，并且展现高亲和力表面免疫球蛋白的b细胞会在随后抗原攻击过程中优先复制和分化。此天然过程可利用称作“链重排(chainshuffling)”的技术来模拟。(marks等人,bio/technol.10：779-783,1992)。在此方法中，由噬菌体展示获得的“初级(primary)”人抗体的亲和力可通过以自未经免疫的供体获得的所有天然存在的v结构域基因变体(库(repertoire))依序取代重链和轻链v区基因来改进。此技术能够产生亲和力介于pm至nm之间的抗体和抗体片段。用于制备相当大的噬菌体抗体库的策略(还称作“所有文库(themother-of-alllibraries)”)已由waterhouse等人,nucl.acidsres.21：2265-2266,1993阐述。基因重排还已用来自啮齿类抗体得到人抗体，其中人抗体具有类似于起始啮齿类抗体的亲和力和特异性。根据此方法(还称作“表位印迹(epitopeimprinting)”)，由噬菌体展示技术得到的啮齿类抗体的重链或轻链v结构域基因由人v结构域基因库取代，从而形成啮齿类-人嵌合体。对抗原的选择可促成能够恢复功能性抗原结合位点的人类可变区的分离，即，表位可控制(印迹)配偶体的选择。当重复该过程以取代余下的啮齿类v结构域时，可得到人抗体(参见pct申请号wo93/06213)。与通过cdr接枝进行的啮齿类抗体的传统人源化不同，此技术可提供全人抗体，这样的抗体不含啮齿类来源的构架或cdr残基。

抗体可以以重组方式如下制备：首先分离由宿主动物产生的抗体；获得基因序列；并使用基因序列以重组方式在宿主细胞(例如，cho细胞)中表达抗体。可采用的另一方法是在植物(例如烟草)或转基因乳中表达抗体序列。曾有人公开了用于在植物或乳内以重组方式表达抗体的方法。参见例如peeters,等人vaccine19：2756,2001；lonberg,n.andd.huszarint.rev.immunol13：65,1995；andpollock,等人,jimmunolmethods231：147,1999。用于制备抗体衍生物(例如人源化、单链等)的方法为本技术领域中已知。

还可利用免疫测定和流式细胞测量(诸如荧光激活细胞分选(facs))来分离对egfrviii或所关注的肿瘤抗原具有特异性的抗体。

可使如本文中所述的抗体结合至多种不同载体上。载体可具活性和/或呈惰性。熟知载体的实例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、耐纶、淀粉酶、玻璃、天然和改质纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖以及磁石。就本发明目的而言载体性质可以是可溶或不可溶。熟知此项技术者知晓用于结合抗体的其他适宜载体，或能够使用常规实验对此加以确认。在一些实施方案中，该载体包含靶向心肌的部分。

编码单克隆抗体的dna易于利用熟知方法(例如利用能与编码该单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)分离和测序。杂交瘤细胞作为该dna的优选来源。一经分离后，该dna可被置入表达载体中(诸如pct申请号wo87/04462所公开的表达载体)，该表达载体接着被转染至原本并不产生免疫球蛋白的宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、类人猿cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或骨髓瘤细胞，以获得单克隆抗体在该重组宿主细胞中的合成。参见例如pct申请号wo87/04462。该dna还可通过例如以人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(morrison等人,proc.nat.acad.sci.81：6851,1984)或通过使非免疫球蛋白多肽的所有或部分的编码序列与该免疫球蛋白编码序列共价结合而加以修饰。在该方式中，“嵌合(chimeric)”或“杂交(hybrid)”抗体经制备以具有在本文中的单克隆抗体的结合特异性。

如本文中所述的egfrviii抗体可利用本技术领域中已知的方法鉴定或特征分析，藉此检测和/或测量egfrviii表达的降低。在一些实施方案中，egfrviii抗体通过培养候选剂与egfrviii和监测结合和/或随之而来的egfrviii表达降低而鉴别。该结合测定可以以纯化的egfrviii多肽或以天然表达或经转染以表达egfrviii多肽的细胞进行。在一个实施方案中，该结合测定是竞争结合测定，其中候选抗体与已知egfrviii抗体竞争egfrviii结合的能力被评估。该测定可以不同形式进行，包括elisa形式。

在初步鉴定之后，候选egfrviii抗体的活性可进一步通过已知用于测试靶生物活性的生物测定证实和再确认。或者，生物测定可被直接用于筛选候选物。若干用于识别和表征抗体的方法是详细描述于实施例中。

egfrviii抗体可利用本领域众所周知的方法表征。举例来说，一个方法用于识别其所结合的表位或“表位定位(epitopemapping)”。本领域有许多已知的用于定位和表征蛋白质上表位的位置的方法，包括解析抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争测定、基因片段表达测定和基于合成肽的测定，例如于harlowandlane,usingantibodies,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1999第11章所述。另一实例中，表位定位可被用于决定抗体所结合的序列。表位定位可自不同商业来源取得，例如pepscansystems(edelhertweg15,8219phlelystad,thenetherlands)。该表位可为线性表位，也就是包含在单个区段的氨基酸中，或由不一定包含在单个区段中的氨基酸的三维相互作用所形成的构象表位。各种长度的肽(例如至少4至6个氨基酸长)可被分离或合成(例如重组)和用于egfrviii或其他肿瘤抗体的结合测定。在另一实例中，egfrviii抗体所结合的表位可在系统性筛选中决定，其是通过使用衍生自egfrviii序列的重叠肽并测定egfrviii抗体的结合。根据基因片段表达测定，编码egfrviii的开放阅读框被随机地或按特异性基因结构片段化，并且测定egfrviii的表达片段与期望测试的抗体的反应性。该基因片段举例来说可能由pcr产生，接着于体外在放射性氨基酸存在时被转录和翻译成蛋白质。该抗体与该放射性标记的egfrviii的结合接着由免疫沉淀和胶体电泳测定。特定表位还可通过使用噬菌体颗粒表面所展示的随机肽序列的大型库(噬菌体库)识别。或者，经定义的重叠肽片段库可于简单结合测定中被测试与该受测抗体的结合。在另一实例中，抗原结合结构域的突变诱发、结构域替换实验和丙氨酸扫描突变诱发可被进行以识别表位结合所需、足够和/或必要的残基。举例来说，结构域替换实验可利用突变egfrviii进行，其中egfrviii蛋白质的各种片段已被来自其他物种(例如小鼠)的egfrviii序列或密切相关但具抗原独特性的蛋白(例如trop-1)取代(替换)。通过评估该抗体与该突变egfrviii的结合，可评估特定egfrviii片段对抗体结合的重要性。在egfrviii特异性抗体(即抗体不结合egfrwt(野生型)或任何其他蛋白质)的情况中，表位可自egfrviii对egfrwt的序列比对来推衍出。

另一可用于表征egfrviii抗体的方法是使用已知与相同的抗原(也就是egfrviii的不同片段)结合的其他抗体的竞争测定，以确定egfrviii抗体是否如其他抗体般与该相同表位结合。竞争测定为本领域的本领域技术人员所广为周知。

表达载体可被用于直接表达egfrviii抗体。本领域的本领域技术人员熟悉施用表达载体以获得活体内外源性蛋白质的表达。参见例如美国专利号6,436,908；6,413,942；和6,376,471。施用表达载体包括局部或全身性施用，包括注射、经口施用、粒子枪或经导管施用和局部施用。在另一个实施方案中，该表达载体直接施用至交感神经干或神经节，或至冠状动脉、心房、心室或心包膜中。

靶向递送含有表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗性组合物也可被使用。受体介导的dna递送技术描述于例如findeis等人,trendsbiotechnol.,1993,11：202；chiou等人,genetherapeutics：methodsandapplicationsofdirectgenetransfer,j.a.wolff,ed.,1994；wu等人,j.biol.chem.,263：621,1988；wu等人,j.biol.chem.,269：542,1994；zenke等人,proc.natl.acad.sci.usa,87：3655,1990；和wu等人,j.biol.chem.,266：338,1991。含有多核苷酸的治疗性组合物以约100ng至约200mg的dna施用以供基因治疗疗程中的局部施用。在基因治疗操作方案期间还可使用约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg和约20μg至约100μg的dna浓度范围。该治疗性多核苷酸和多肽可利用基因递送媒介物来递送。该基因递送媒介物可为病毒性或非病毒性来源(一般参见jolly,cancergenetherapy,1：51,1994；kimura,humangenetherapy,5：845,1994；connelly,humangenetherapy,1995,1：185；andkaplitt,naturegenetics,6：148,1994)。该基因递送媒介物可为病毒性或非病毒性来源(一般参见jolly,1994,cancergenetherapy1：51；kimura,1994,humangenetherapy5：845；connelly,1995,humangenetherapy1：185和kaplitt,1994,naturegenetics6：148)。所述编码序列的表达可利用内源性哺乳动物或异源性启动子来诱导。编码序列的表达可为组成性或经调节的。

用于递送期望多核苷酸和在期望细胞中表达的基于病毒的载体是本领域所熟知的。示例性基于病毒的媒介物包括但不限于重组反转录病毒(参见例如pct申请号wo90/07936；wo94/03622；wo93/25698；wo93/25234；wo93/11230；wo93/10218；wo91/02805；美国专利号5,219,740and4,777,127；gbpat.no.2,200,651；和eppat.no.0345242)、基于甲病毒的载体(例如辛得比司(sindbis)病毒载体、圣利基(semliki)森林病毒(atccvr-67；atccvr-1247)、罗氏河病毒(atccvr-373；atccvr-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(atccvr-923；atccvr-1250；atccvr1249；atccvr-532))和腺病毒相关病毒(aav)载体(参见例如pct申请号wo94/12649,wo93/03769；wo93/19191；wo94/28938；wo95/11984和wo95/00655)。还可采用如curiel,hum.genether.,1992,3：147所述的施用与已杀死的腺病毒连接的dna。

还可采用非病毒性递送媒介物和方法，包括但不限于与单独的已杀死的腺病毒连接或未连接的多价阳离子缩合dna(参见例如curiel,hum.genether.,3：147,1992)；与配体连接的dna(参见例如wu,j.biol.chem.,264：16985,1989)；真核细胞递送媒介物细胞(参见例如美国专利号5,814,482；pct申请号wo95/07994；wo96/17072；wo95/30763；和wo97/42338)和核电荷中和或与细胞膜融合。还可采用裸dna。示例性裸dna引入方法描述于pct申请号wo90/11092和美国专利号5,580,859。可作为基因递送媒介物的脂质体描述于美国专利号5,422,120；pct申请号wo95/13796；wo94/23697；wo91/14445；和ep0524968。其他方法描述于philip,mol.cellbiol.,14：2411,1994和woffendin,proc.natl.acad.sci.,91：1581,1994。

在一些实施方案中，本发明涵盖组合物，包括药物组合物，其包含本文中所述的抗体或由本文中所述的方法所产生并且具有本文中所述的特性。如本文中所使用，组合物包含一种或多种结合至egfrviii的抗体和/或一种或多种包含编码一种或多种这些抗体的序列的多核苷酸。这些组合物可另包含适合赋形剂，诸如药学上可接受的赋形剂，其包括缓冲剂，其是本技术领域中已熟知的。

本发明还提供制备任何所述抗体的方法。本发明的抗体可利用本领域已知的方法制备。多肽可通过抗体的蛋白水解或其他降解方式、通过如上所述的重组方法(即单一或融合多肽)或通过化学合成加以制备。所述抗体的多肽特别是最多约50个氨基酸的较短多肽方便地通过化学合成制备。化学合成的方法是本领域所知并且可自商业途径获得。举例来说，抗体可通过采用固相方法的自动多肽合成仪产生。还见美国专利第5,807,715、4,816,567和6,331,415号。

在另一替代方面中，所述抗体可利用本领域广为周知的重组方法制备。在一个实施方案中，多核苷酸包含编码下列抗体的重链和/或轻链可变区的序列：m62g7、h62g7、h62g7-h14/l1-dv、h62g7-eq/l6、42g9、32a10、20b9、14c11、21e11、49b11、46e10、12h6、19a9、21e7、11b11、12b2、11f10、17g11、29d5、30d8、20e12、26b9、32g8、34e7、20g5、c6、b5、42g9-1、32a10-1、20b9-1、14c11-1、21e11-1、49b11-1、46e10-1、12h6-1、19a9-1、21e7-1、11b11-1、12b2-1、11f10-1、17g11-1、29d5-1、30d8-1、20e12-1、26b9-1、32g8-1、34e7-1、20g5-1、c6-1或b5-1。编码该感兴趣的抗体的序列可被维持于宿主细胞的载体中，接着该宿主细胞可被扩增和冷冻以供将来使用。载体(包括表达载体)和宿主细胞另于本文说明。

包含两个共价连结抗体的异源缀合抗体还属于本发明的范围内。所述抗体已被用于使免疫系统细胞以非期望细胞为靶(美国专利号4,676,980)和用于治疗hiv感染(pct申请号wo91/00360和wo92/200373；ep03089)。异源缀合抗体可利用任何方便的交联方法制备。适当的交联剂和技术是本领域所广为周知并且描述于美国专利号4,676,980。

嵌合或杂交抗体还可利用已知的合成蛋白质化学方法于体外制备，包括涉及交联剂的方法。举例来说，免疫毒素可利用二硫交换反应或通过形成硫醚键被构建。供此目的使用的适当试剂的实例包括亚氨基硫醇盐(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁亚氨酸酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。

在重组人源化抗体中，fcγ部分可经修饰以避免与fcγ受体和补体和免疫系统的相互作用。用于制备所述抗体的技术描述于wo99/58572。举例来说，恒定区可经基因工程改造以更为近似人恒定区以避免若该抗体用于人的临床试验和治疗时的免疫反应。参见例如美国专利号5,997,867和5,866,692。

本发明涵盖对本发明的抗体和多肽的修饰，包括如表5中所示的变体，其包括不会显著影响它们的性质的功能性等效抗体和具有增强或下降的活性和/或亲和力的变体。举例而言，该氨基酸序列可经突变以获得具有期望的对egfrviii的结合亲和力的抗体。多肽的修饰是本领域中的常规实践并且不需在本文中详述。修饰多肽的实例包括具有氨基酸残基保守性取代、氨基酸的一个或多个删除或添加(其不显著不利地改变功能性活性或成熟(增强)多肽对其配体的亲和力)或使用化学类似物的多肽。

氨基酸序列插入包括氨端和/或羧端融合(范围在一个残基至含有一百或更多个残基的多肽的长度)和序列内插入单个或多个氨基酸残基。末端插入的实例包括具有n端甲硫胺酰基残基的抗体或融合至表位标记的抗体。其他抗体分子的插入变体包括融合至酶或多肽(增加抗体在血液循环中的半衰期)的抗体n或c端。

取代变体具有抗体分子中至少一个氨基酸残基的移除并且不同残基被插入其位置。取代性突变诱发最感兴趣的位置包括超可变区，但fr改变还被考虑。保留性取代显示于表头“保守性取代”的表5中。若该取代导致生物活性改变，则更多在表5中称为“示例性取代”或另外在下述参照氨基酸分类的实质性改变可被导入和筛选该产物。在一些实施方案中，相较于标准亲代抗体，在本文中所提供的抗体取代变体在vh或vl区具有不多于15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个保守性取代。在一些实施方案中，该取代不在vh或vl区的cdr内。

表5：氨基酸取代

抗体生物性质的实质性修饰通过选择其在维持下列的效果上显著不同的取代加以完成：(a)取代区域的多肽骨架的结构，例如片状或螺旋构型，(b)靶位置的分子的电荷或疏水性或(c)侧链的主体。天然存在的氨基酸残基根据常见的侧链性质分成下列组：

(1)非极性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；

(2)极性不带电荷：cys、ser、thr、asn、gln；

(3)酸性(负电荷)：asp、glu；(4)碱性(正电荷)：lys、arg；

(5)影响侧链方向性的残基：gly、pro；和

(6)芳香性：trp、tyr、phe、his。

非保守性取代通过以所述分类之一中的成员与另一分类交换实现。

任何未参与维持抗体适当构型的半胱氨酸残基还可被取代，通常由丝氨酸取代，以增进该分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反的，半胱氨酸键可被加入抗体以增进其稳定性，特别是当该抗体是抗体片段诸如fv片段。

氨基酸修饰可从改变或修饰一个或多个氨基酸至完全重新设计一个区域诸如可变区。可变区的变化可改变结合亲和力和/或特异性。在一些实施方案中，不超过一至五个保守性氨基酸取代发生在cdr结构域内。在其他实施方案中，不超过一至三个保守性氨基酸取代发生在cdr结构域内。在其他实施方案中，该cdr结构域是cdrh3和/或cdrl3。

修饰还包括糖基化和非糖基化多肽，也包括具有其他翻译后修饰的多肽，诸如举例来说以不同的糖进行糖基化、乙酰化和磷酸化。抗体在其恒定区中的保守位置被糖基化(jefferisandlund,chem.immunol.65：111-128,1997；wrightandmorrison,tibtech15：26-32,1997)。免疫球蛋白的寡糖侧链影响该蛋白质的功能(boyd等人,mol.immunol.32：1311-1318,1996；wittweandhoward,biochem.29：4175-4180,1990)和该糖蛋白的不同部分之间的分子内相互作用，其可影响该糖蛋白的构象和所呈现的三维表面(jefferisandlund,supra；wyssandwagner,currentopin.biotech.7：409-416,1996)。根据特定识别结构，寡糖还可被用来使给定糖蛋白靶向某些分子。也有报告指出抗体的糖基化会影响抗体依赖性细胞性细胞毒性(adcc)。特别是，经四环素调节表达β(1,4)-n-乙酰葡萄氨基转移酶iii(gntiii，一种催化形成平分型glcnac的糖基转移酶)的cho细胞被报告具有增强的adcc活性(umana等人,naturebiotech.17：176-180,1999)。

抗体的糖基化通常n-连接或o-连接的。n-连接是指碳水化合物基团连接至天冬酰氨酸残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸、天冬酰胺-x-苏氨酸和天冬酰胺-x-半胱氨酸是用于碳水化合物基团与天冬酰胺侧链酶性连接的识别序列，其中x是除脯氨酸以外的任何氨基酸。因此，多肽中任何所述三肽序列的存在产生可能的糖基化位置。o-连接糖基化是指连接糖类n-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸，最常见为丝氨酸或苏氨酸，不过5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸也可被使用。

在抗体中加入糖基化位置可通过改变氨基酸序列以使该序列包含一个或多个上述的三肽序列(供n-连接糖基化位置)而方便地完成。该改变还可通过在原始抗体的序列加入或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基加以完成(供o-连接糖基化位置)。

抗体的糖基化模式还可在不改变基础核苷酸序列下加以改变。糖基化大多取决于用来表达该抗体的宿主细胞。由于用来表达重组糖蛋白(例如抗体)以作为潜在治疗剂的细胞种类很少为天然细胞，因此抗体的糖基化模式的变化可被预期(见例如hse等人,j.biol.chem.272：9062-9070,1997)。

除了宿主细胞的选择以外，在重组产生抗体期间可影响糖基化的因素包括生长模式、培养基配方、培养密度、氧化、ph、纯化程序和该类似因素。多种方法已被提出以改变在特定宿主生物体中实现的糖基化模式，包括导入或过度表达与寡糖产生有关的某些酶(美国专利第5,047,335、5,510,261和5,278,299号)。糖基化(或某些类型的糖基化)可通过酶自糖蛋白移除，举例来说利用内切糖苷酶h(endoh)、n-糖苷酶f、内切糖苷酶f1、内切糖苷酶f2、内切糖苷酶f3。此外，该重组宿主细胞可经基因工程化以不处理某些种类的多糖。这些和类似的技术是本领域所广为周知的。

其他修饰的方法包括使用本领域已知的偶合技术，包括但不限于酶方法、氧化性取代和螯合。修饰可被用于例如连接用于免疫测定的标记。经修饰的多肽利用本领域已建立的方法制备，并且可利用本领域已知的标准测定筛选，这些方法中有些是于下面和实施例中描述。

其他抗体修饰包括如pct公开号wo99/58572所述经修饰的抗体。所述抗体除了包含针对靶分子的结合结构域，还包含具有实质上与人免疫球蛋白重链的所有或部分恒定区同源的氨基酸序列的效应结构域。所述抗体能与靶分子结合但不引发显著的补体依赖性裂解或细胞介导的靶破坏。在一些实施方案中，该效应结构域能与fcrn和/或fcγriib特异性结合。其通常是根据衍生自两种或更多种人免疫球蛋白重链ch2区的嵌合性结构域。以此方式修饰的抗体特别适用于慢性抗体治疗，以避免传统抗体治疗所引发的发炎及其他不良反应。

本发明包括亲和性成熟的实施方案。举例来说，亲和性成熟抗体可通过本领域已知的方法产生(marks等人,bio/technology,10：779-783,1992；barbas等人,procnat.acad.sci,usa91：3809-3813,1994；schier等人,gene,169：147-155,1995；yelton等人,j.immunol.,155：1994-2004,1995；jackson等人,j.immunol.,154(7)：3310-9,1995,hawkins等人,j.mol.biol.,226：889-896,1992；andpct申请号wo2004/058184)。

下列方法可被用于调整抗体的亲和性和表征cdr。一种表征抗体的cdr和/或改变(诸如改善)多肽诸如抗体的结合亲和性的方法被称为“库扫描诱变”。通常，库扫描诱变是如下述。cdr中的一个或多个氨基酸位置利用本领域已建立的方法经两个或更多个(诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸取代。如此产生小型克隆库(在一些实施方案中，每个经分析的氨基酸位置均有一个克隆)，每个克隆均有两个或更多个成员的复杂性(若各位置被两个或更多个氨基酸取代)。通常，该克隆库还包括包含天然(未经取代的)氨基酸的克隆。对各库中的少量克隆(例如约20至80个克隆，依该库的复杂性而定)筛选其与该靶多肽(或其他结合靶)的结合亲和性，结合性增加、相同、降低或不具结合性的候选克隆株被识别。测定结合亲和性的方法是本领域所广为周知的。结合亲和性可利用biacore^tm表面等离子体共振分析测定，该分析检测约2倍或更高的结合亲和性差异。biacore^tm特别适用于当起始抗体已经以相当高的亲和性结合时，例如约10nm或小于10nm的kd。利用biacoretm表面等离子体共振筛选描述于本文的实施例。

结合亲和性可利用金耐科萨(kinexa)生物传感器、邻近闪烁检测、elisa、origen免疫测定(igen)、荧光淬灭、荧光转移和/或酵母菌展示测定。结合亲和性还可利用适当的生物测定筛选。

在一些实施方案中，cdr中的每个氨基酸位置(在一些实施方案中一次一个位置)均利用本领域已知的诱变方法(某些方法于本文描述)以所有20个天然氨基酸取代。如此产生小型克隆库(在一些实施方案中，每个经分析的氨基酸位置有一个克隆)，各克隆具有20个成员的复杂性(若每个位置被所有20个氨基酸取代)。

在一些实施方案中，该经筛选的库包含两个或更多个位置的取代，该两个或更多个位置可能在相同cdr内或在两个或更多个cdr内中。因此，该库可能包含在一个cdr中取代两个或更多个位置。该库可能包含在两个或更多个cdr中取代两个或更多个位置。该库可能包含取代3、4、5或多个位置，所述位置见于二、三、四、五或六个cdr中。该取代可利用低冗余性密码子制备。见例如balint等人,gene137(1)：109-18,1993的表2。

该cdr可为cdrh3和/或cdrl3。该cdr可为cdrl1、cdrl2、cdrl3、cdrh1、cdrh2和/或cdrh3中的一个或多个。该cdr可为kabatcdr、chothiacdr或延长型cdr。

具有改善的结合性的候选物可被测序，藉此识别导致改善亲和性的cdr取代突变(还称为“改善”取代)。可结合的候选物还被测序，藉此识别保留结合性的cdr取代。

可进行多次筛选。举例来说，具有改善结合性的候选物(各候选物在一个或多个cdr的一个或多个位置包含氨基酸取代)还可被用于设计第二库，该库在各经改善的cdr位置(即在cdr中取代突变显示改善结合性的氨基酸位置)包含至少该原始和经取代的氨基酸。此库的制备、筛选和选择另于下讨论。

库扫描诱变还提供表征cdr的方法，因为具有改善结合力、相同结合力、降低结合力或无结合力的克隆的频率还提供有关各氨基酸位置对抗体-抗原复合物的稳定性的重要性的信息。举例来说，如果cdr的一个位置被改变成所有20个氨基酸仍保留结合力，该位置被认为不可能是抗原结合所必需的位置。相反地，如果cdr的一个位置只有在低比例的取代中保留结合力，该位置被认为是对cdr的功能具重要性的位置。因此，库扫描诱变方法产生有关cdr中的位置的信息，有些位置可被改变成许多不同的氨基酸(包括所有20个氨基酸)，有些位置无法被改变或仅能被改变成少数几种氨基酸。

具有改善亲和性的候选物可利用所希望的筛选或选择方法被组合于第二库中，该库包括在该位置经改善的氨基酸和原始氨基酸，并且可能另外包括该位置的额外取代，视所希望或所允许的该库的复杂性而定。此外若有需要的话，邻近的氨基酸位置可被随机化成至少两或多种氨基酸。邻近氨基酸的随机化可能允许该突变cdr的额外构型可塑性，此可能进而允许或促进导入更多的改善突变。该库还可能包含在第一次筛选时不显示改善亲和性的取代位置。

该第二库是利用本领域已知的任何方法筛选或选择具有改善和/或改变的结合亲和性的库成员，包括利用biacore^tm表面等离子体共振分析筛选，和利用本领域已知的任何用于选择的方法选择，包括噬菌体展示、酵母菌展示和核糖体展示。

本发明还包含融合蛋白质，该融合蛋白质包含一个或多个源自本发明的抗体的片段或区域。在一个实施方案中，本发明提供一种融合多肽，该融合多肽包含如seqidno：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、29、31、33、36、38、40、42、45、47、49、51、211、212、213或215所示的轻链可变区的至少10个连续氨基酸，和/或如seqidno：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、30、32、34、35、37、39、41、43、44、46、48、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、202、203、204、205、206、207、208、209、210、214、216、217或218所示的重链可变区的至少10个连续氨基酸。在其他实施方案中，本发明提供包含该轻链可变区的至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个或至少约30个连续氨基酸和/或该重链可变区的至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个或至少约30个连续氨基酸的融合多肽。在另一个实施方案中，该融合多肽包含一个或多个cdr。在另一个实施方案中，该融合多肽包含轻链可变区和/或重链可变区，如选自seqidno：1和2、3和4、3和5、6和5、7和5、8和9、10和11或12和13的任一序列对所示。在另一个实施方案中，该融合多肽包含一个或多个cdr。在其他实施方案中，该融合多肽包含cdrh3(vhcdr3)和/或cdrl3(vlcdr3)。就本发明的目的而言，融合蛋白包含一种或多种抗体和在天然分子中未与其连接的另一氨基酸序列，例如异源性序列或来自另一区的同源性序列。示例性异源序列包括但不限于“标签”诸如flag标签或6his标签。标签是本领域所广为周知的。

融合多肽可通过本领域已知的方法产生，例如合成或重组。通常，本发明的融合蛋白通过使用本文所描述的重组方法使编码其多核苷酸表达加以制备，不过还可通过本领域所知的其他方法制备，包括例如化学合成。

本发明还提供组合物，所述组合物包含与药剂缀合(例如连接)以利与固相支持物(诸如生物素或抗生物素蛋白)偶合的抗体。为了简单起见大致将以抗体为例，但应了解所述方法适用于本文所述的任何egfrviii抗体实施方案。缀合一般是指如本文所述的连接所述成分。该连接(通常以近距离相连固定所述成分以至少用于施用)可以以数种方式实现。举例来说，当药剂与抗体各自具有能与彼此反应的取代基时，两者间的直接反应是可能的。举例来说，一个的亲核基团(诸如氨基或氢硫基)可能能与另一个的含有羰基的基团(诸如酐或酸性卤化物)或含有好的离去基团(例如卤化物)的烷基反应。

本发明还提供编码本发明的抗体的经分离的多核苷酸，和包含该多核苷酸的载体和宿主细胞。

因此，本发明提供多核苷酸(或组合物，其包括药物组合物)，其包含编码下列任何者的多核苷酸：m62g7、h62g7、h62g7-h14/l1-dv、h62g7-eq/l6、42g9、32a10、20b9、14c11、21e11、49b11、46e10、12h6、19a9、21e7、11b11、12b2、11f10、17g11、29d5、30d8、20e12、26b9、32g8、34e7、20g5、c6、b5、42g9-1、32a10-1、20b9-1、14c11-1、21e11-1、49b11-1、46e10-1、12h6-1、19a9-1、21e7-1、11b11-1、12b2-1、11f10-1、17g11-1、29d5-1、30d8-1、20e12-1、26b9-1、32g8-1、34e7-1、20g5-1、c6-1和b5-1，或具有结合egfrviii能力的任何片段或其部分。

在另一方面中，本发明提供编码本文所述的任何抗体(包括抗体片段)和多肽的多核苷酸，诸如具有受损效应功能的抗体和多肽。多核苷酸可利用本领域已知的方法制备和表达。

在另一方面中，本发明提供包含本发明的任何多核苷酸的组合物(诸如药物组合物)。在一些实施方案中，该组合物包含表达载体，该表达载体包含编码本文所述的任何抗体的多核苷酸。

表达载体和施用多核苷酸组合物另于本文描述。

在另一方面中，本发明提供制备本文所述的任何多核苷酸的方法。

与任何所述序列互补的多核苷酸还包含于本发明中。多核苷酸可能为单链(编码或反义)或双链，并且可能为dna(基因组、cdna或合成性)或rna分子。rna分子包括hnrna分子和mrna分子，该hnrna分子包含内含子并且以一对一的方式对应dna分子，该mrna分子不包含内含子。额外的编码或非编码序列可能(但不一定)存在于本发明的多核苷酸内，并且多核苷酸可能(但不一定)与其他分子和/或支持物质连接。

多核苷酸可能包含天然序列(即编码抗体或其部分的内源性序列)或可能包含该序列的变体。多核苷酸变体包含一个或多个取代、添加、删除和/或插入以使该经编码的多肽的免疫反应性相对于天然免疫反应性分子而言不被减少。对该经编码的多肽的免疫反应性的影响通常如本文所述检测。变体优选地展现与编码天然抗体或其部分的多核苷酸序列具有至少约70％的同一性，更优选地至少约80％的同一性，甚至更优选地至少约90％的同一性和最优选至少约95％的同一性。

若两个多核苷酸或多肽序列如下所述比对以得到最高对应性并且该两个序列中的核苷酸或氨基酸序列相同，则该两个序列被称为“相同”。两个序列之间的比较通常通过在比较窗中比较序列加以进行，以识别和比较具有序列相似性的局部区域。本文所使用的“比较窗”是指至少约20个、通常30个至约75个或40个至约50个连续位置的区段，在该窗中一个序列可与具有相同连续位置数量的参考序列在该两个序列经最佳比对后比较。

供比较的序列的最佳比对可利用雷斯基(lasergene)生物信息软件包中的迈佳来(megalign)程序(dnastar,inc.,madison,wi)以内建参数进行。此程序体现了下列文献中描述的数种比对法：dayhoff,m.o.,1978,amodelofevolutionarychangeinproteins-matricesfordetectingdistantrelationships.indayhoff,m.o.(ed.)atlasofproteinsequenceandstructure,nationalbiomedicalresearchfoundation,washingtondcvol.5,suppl.3,pp.345-358；heinj.,1990,unifiedapproachtoalignmentandphylogenespp.626-645methodsinenzymologyvol.183,academicpress,inc.,sandiego,ca；higgins,d.g.andsharp,p.m.,1989,cabios5：151-153；myers,e.w.andmullerw.,1988,cabios4：11-17；robinson,e.d.,1971,comb.theor.11：105；santou,n.,nes,m.,1987,mol.biol.evol.4：406-425；sneath,p.h.a.andsokal,r.r.,1973,numericaltaxonomytheprinciplesandpracticeofnumericaltaxonomy,freemanpress,sanfrancisco,ca；wilbur,w..j.andlipman,d.j.,1983,proc.natl.acad.sci.usa80：726-730。

优选地，“序列同一性的百分比”通过在至少20个位置的比较窗中比较两个经最佳比对的序列加以决定，其中在比较窗中多核苷酸或多肽序列的部分相较于用于两个序列的最佳比对的参考序列(其不包含添加或删除)可能包含20％或低于20％、通常5％至15％或10％至12％的添加或删除(即缺口)。百分比的计算是通过测定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，以得到匹配位置的数目，将该匹配位置的数目除以参考序列的位置总数(即窗的大小)，并将该结果乘以100以得到序列同一性百分比。

变体还可能或选择性地与天然基因或其部分或互补部分实质上同源。所述多核苷酸变体能在中度严谨度条件下与编码天然抗体的天然发生的dna序列(或互补序列)杂交。

适当的“中度严谨度条件”包括在5倍ssc、0.5％sds、1.0毫摩尔edta(ph8.0)的溶液中预先清洗；于50℃至60℃的5倍ssc中过夜杂交；接着于65℃中各以含有0.1％sds的2倍、0.5倍和0.2倍ssc清洗20分钟两次。

本文所使用的“高度严谨度条件”或“高严谨条件”是：(1)采用低离子张力和高温清洗，例如于50℃的0.015m氯化钠/0.0015m柠檬酸钠/0.1％十二基硫酸钠；(2)在42℃的杂交期间采用变性剂，诸如甲酰胺，例如具有0.1％牛血清白蛋白/0.1％ficoll/0.1％聚乙烯基吡咯烷酮/含有750mm氯化钠、75mm柠檬酸钠的ph6.5的50mm磷酸钠缓冲液的50％(体积/体积)甲酰胺；或(3)于42℃采用50％甲酰胺、5倍ssc(0.75mnacl、0.075m柠檬酸钠)、50mm磷酸钠(ph6.8)、0.1％焦磷酸钠、5倍丹哈德(denhardt’s)溶液、经超声处理的鲑鱼精子dna(50μg/ml)、0.1％sds和10％硫酸葡聚糖，并于42℃以0.2倍ssc(氯化钠/柠檬酸钠)清洗和于55℃以50％甲酰胺清洗，之后于55℃以含有edta的0.1倍ssc进行高严谨度清洗。本领域的本领域技术人员将知道如何视需要调整温度、离子强度等条件以配合诸如探针长度等类似的因子。

本领域的一般本领域技术人员将了解的是，由于基因密码简并的结果，有许多核苷酸序列编码本文所描述的多肽。这些多核苷酸中有些与任何天然基因的核苷酸序列具有极低的同源性。然而，本发明特别考虑因为使用不同的密码子而有所差异的多核苷酸。另外，包含本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因属于本发明的范围内。等位基因是因为一个或多个突变，诸如核苷酸的删除、添加和/或取代而被改变的内源性基因。该形成的mrna和蛋白质可能但不一定具有经改变的结构或功能。等位基因可利用标准技术(诸如杂交、扩增和/或数据库序列比较)加以识别。

本发明的多核苷酸可利用化学合成、重组方法或pcr获得。化学多核苷酸合成的方法是本领域所广为周知，不须在此详细说明。本领域的本领域技术人员可利用本文所提供的序列和商用dna合成仪产生期望的dna序列。

在利用重组方法制备多核苷酸时，包含期望序列的多核苷酸可被插入适当的载体中，该载体接着可被导入适当的宿主细胞以供复制和扩增，在下面进一步讨论。多核苷酸可通过本领域所知的任何方法被插入宿主细胞中。细胞的转化是通过直接摄取、胞饮作用、转染、f交配(f-mating)或电穿孔导入外源性多核苷酸。一旦导入后，该外源性多核苷酸可以以非整合性载体(诸如质粒)或整合至该宿主细胞的基因组中而被维持于该细胞内。经此扩增的多核苷酸可利用本领域所熟知的方法自该宿主细胞分离。见例如sambrook等人,1989。

另外，pcr能复制dna序列。pcr技术是本领域所广为周知的，于美国专利第4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202号和pcr：thepolymerasechainreaction,mullis等人eds.,birkauswerpress,boston,1994中描述。

rna可通过使用适当载体中经分离的dna并且将其插入适当的宿主细胞中获得。当细胞复制并且该dna被转录成为rna时，该rna即可利用本领域的本领域技术人员所广为周知的方法分离，例如于sambrook等人,1989(同上)所述。

适当的克隆载体可根据标准技术构建，或可选自本领域为数众多的可用克隆载体。虽然该经选择的克隆载体可能因所意图使用的宿主细胞而异，适用的克隆载体通常具有自我复制的能力、可能具有特定限制内切酶的单一目标和/或可能带有可用于选择含有该载体的克隆的标志基因。适当实例包括质粒和细菌性病毒，例如puc18、puc19、bluescript(例如pbssk+)及其衍生物、mp18、mp19、pbr322、pmb9、cole1、pcr1、rp4、噬菌体dna和穿梭载体诸如psa3和pat28。这些和许多其他克隆载体可购自商业卖方诸如biorad、strategene和invitrogen。

表达载体通常是可复制的多核苷酸构建体，其包含本发明的多核苷酸。这暗示表达载体必需能在宿主细胞中以附加体或染色体dna的组成部分被复制。适当的表达载体包括但不限于质粒、病毒载体(包括腺病毒、腺病毒相关病毒、反转录病毒)、粘质粒和pct公开号wo87/04462中所公开的表达载体。载体成分通常包括但不限于下列一或多项：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、适当的转录控制组件(诸如启动子、增强子和终止子)。就表达(即翻译)而言，通常也需要一种或多种翻译控制组件，诸如核糖体结合位置、翻译起始位置和终止密码子。

含有感兴趣的多核苷酸的载体可通过任何适当的方法导入宿主细胞，包括电穿孔、使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、deae-葡聚糖或其他物质的转染、微弹撞击(microprojectilebombardment)、脂质体转染(lipofection)和感染(例如该载体为感染性剂诸如痘疮病毒)。导入载体或多核苷酸的选择通常将视该宿主细胞的特征而定。

本发明还提供包含本文所述的任何多核苷酸的宿主细胞。任何能过表达异源性dna的宿主细胞可被使用以分离编码该感兴趣的抗体、多肽或蛋白质的基因。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于cos、hela和cho细胞。还见pct公开号wo87/04462。适当的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(诸如大肠杆菌或枯草杆菌)和酵母菌(诸如啤酒酿母菌、分裂酵母(s.pombe)或乳酸克鲁维酵母菌(k.lactis))。优选地，该宿主细胞以相较于该对应的感兴趣的内源性抗体或蛋白质若存在于宿主细胞中的表达量高出约5倍、更优选为高出10倍、甚至更优选为高出20倍的量表达cdna。筛选与egfrviii特异性结合的宿主细胞利用免疫测定或facs进行。可识别过表达感兴趣的抗体或蛋白的细胞。

egfrviii抗体缀合物

本发明还提供一种如本文所述的egfrviii抗体的缀合物(或免疫缀合物)，其中该抗体是直接或间接经由接头与药剂(例如细胞毒性剂)缀合以用于靶向性免疫疗法(例如抗体-药物缀合物)。举例来说，细胞毒性剂可如本文所述与该egfrviii抗体或连接或缀合以用于靶向性局部递送该细胞毒性剂至肿瘤(例如egfrviii表达肿瘤)。

用于缀合细胞毒性剂或其他治疗剂与抗体的方法已于许多文献中说明。举例来说，抗体的化学修饰可经由赖氨酸侧链胺或通过还原链间二硫键而被活化的半胱氨酸氢硫基进行，以使缀合反应得以发生。见例如tanaka等人,febsletters579：2092-2096,2005和gentle等人,bioconjugatechem.15：658-663,2004。还已描述了经工程化于抗体的特定位置的反应性半胱氨酸残基以利用经定义的化学计量用于特定药物缀合。见例如junutula等人,naturebiotechnology,26：925-932,2008。在转谷氨酰胺酶和胺存在时，使用含有谷氨酰胺的酰基供体标签或通过多肽工程化使成反应性的内源性谷氨酰胺(即形成共价键以作为酰基供体的能力)的缀合(例如包含或连接至反应性胺的细胞毒性剂)还描述于国际专利申请wo2012/059882和wo2015015448。

在一些实施方案中，本文描述的egfrviii抗体或缀合物包含在该抗体的特定位置(例如该egfrviii抗体的羧基端、氨基端或其他位置)经工程化的含有谷氨酰胺的酰基供体标签。在一些实施方案中，该标签包含氨基酸谷氨酰胺(q)或氨基酸序列lqg、llqgg(seqidno：258)、llqg(seqidno：259)、lslsqg(seqidno：260)、gggllqgg(seqidno：261)、gllqg(seqidno：262)、llq、gsplaqshgg(seqidno：263)、gllqggg(seqidno：264)、gllqgg(seqidno：265)、gllq(seqidno：266)、llqllqga(seqidno：267)、llqga(seqidno：268)、llqyqga(seqidno：269)、llqgsg(seqidno：270)、llqyqg(seqidno：271)、llqllqg(seqidno：272)、sllqg(seqidno：273)、llqlq(seqidno：274)、llqllq(seqidno：275)、llqgr(seqidno：276)、llqgpp(seqidno：277)、llqgpa(seqidno：278)、ggllqgpp(seqidno：279)、ggllqga(seqidno：280)、llqgpgk(seqidno：281)、llqgpg(seqidno：282)、llqgp(seqidno：283)、llqp(seqidno：284)、llqpgk(seqidno：285)、llqapgk(seqidno：286)、llqgapg(seqidno：287)、llqgap(seqidno：288)和llqlqg(seqidno：289)。

还提供了分离的抗体，其包含在抗体的位置222、340或370(eu编码方案)的含有谷氨酰胺的酰基供体标签和氨基酸修饰，其中该修饰是氨基酸删除、插入、取代、突变或其任何组合。在一些实施方案中，该氨基酸修饰是自赖氨酸至精氨酸(例如k222r、k340r或k370r)的取代。

可与本发明的egfrviii抗体缀合的药剂包括但不限于细胞毒性剂、免疫调节剂、成像剂、治疗性蛋白质、生物聚合物或寡核苷酸。

细胞毒性剂的实例包括但不限于蒽环素(anthracycline)、耳抑素(auristatin)、尾海兔素(dolastatin)、康柏达司塔汀(combretastatin)、倍癌霉素(duocarmycin)、吡咯并苯并二吖呯二聚物(pyrrolobenzodiazepinedimer)、吲哚啉并-苯并二吖呯二聚物(indolino-benzodiazepinedimer)、烯双炔(enediyne)、格尔德霉素(geldanamycin)、美登素(maytansine)、嘌霉素(puromycin)、紫杉烷(taxane)、长春花生物碱(vincaalkaloid)、喜树碱(camptothecin)、妥布赖森(tubulysin)、半星芒体(hemiasterlin)、司普力西欧史塔丁(spliceostatin)、普拉地内酯(pladienolide)、及其立体异构物、同电子排列体(isostere)、类似物或衍生物。

蒽环素是源自细菌链霉菌，并且已用于治疗广泛范围的癌症，诸如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌。示例性蒽环素包括但不限于正定霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)(即甲烯土霉素(adriamycin))、表阿霉素(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、戊柔比星(valrubicin)和米托蒽醌(mitoxantrone)。

海兔毒素(dolastatin)及其肽类似物和衍生物耳抑素是高度有效的抗有丝分裂剂，已被显示具有抗癌和抗真菌活性。见例如美国专利号5,663,149和pettit等人,antimicrob.agentschemother.42：2961-2965,1998。示例性海兔毒素和耳抑素包括但不限于海兔毒素10、耳抑素e、耳抑素eb(aeb)、耳抑素efp(aefp)、mmad(单甲基耳抑素d或单甲基海兔毒素10)、mmaf(单甲基耳抑素f或n-甲基缬氨酸-缬氨酸-dolaisoleuine-dolaproine-苯丙氨酸)，mmae(单甲基耳抑素e或n-甲基缬氨酸-缬氨酸-dolaisoleuine-dolaproine-降麻黄碱)、5-苯甲酰基戊酸-ae酯(aevb)及其他新颖的耳抑素(诸如美国申请号2013/0129753中所述者)。在一些实施方案中，该耳抑素是0101(2-甲基丙氨酰基-n-[(3r,4s,5s)-3-甲氧基-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1s)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-n-甲基-l-缬氨酰胺)，其具有下列结构：

在一些实施方案中，该耳抑素是3377(n,2-二甲基丙氨酰基-n-{(1s,2r)-4-{(2s)-2-[(1r,2r)-3-{[(1s)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯啶-1-基}-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-n-甲基-l-缬氨酰胺)，其具有下列结构：

在一些实施方案中，该耳抑素是0131-ome(n,2-二甲基丙氨酰基-n-[(3r,4s,5s)-3-甲氧基-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-1-甲氧基-3-{[(2s)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-n-甲基-l-缬氨酰胺)，其具有下列结构：

在其他实施方案中，该耳抑素是0131(2-甲基-l-脯氨酰基-n-[(3r,4s,5s)-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-3-{[(1s)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-n-甲基-l-缬氨酰胺)，其具有下列结构：

在其他实施方案中，该耳抑素是0121(2-甲基-l-脯氨酰基-n-[(3r,4s,5s)-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-3-{[(2s)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-n-甲基-l-缬氨酰胺)，其具有下列结构：

喜树碱(camptothecin)为细胞毒性喹啉生物碱，其可抑制拓朴异构酶i。喜树碱(camptothecin)及其衍生物的实例包括但不限于拓朴替康(topotecan)和伊立替康(irinotecan)，及其代谢物诸如sn-38。

康柏达司塔汀类(combretastatins)为天然酚类，其于肿瘤中具有血管裂解性质。例示的康柏达司塔汀类(combretastatins)及其衍生物包括但不限于康柏达司塔汀a-4(combretastatina-4)(ca-4)和奥瑞布尔(ombrabulin)。

倍癌霉素(duocarmycin)和cc-1065是具有细胞毒性效力的dna烷化剂。见bogerandjohnson,pnas92：3642-3649(1995)。例示的倍癌霉素(duocarmycin)和cc-1065包括但不限于(+)-倍癌霉素a(duocarmycina)和(+)-倍癌霉素sa(duocarmycinsa)、(+)-cc-1065和如同于国际专利申请案pct/ib2015/050280中公开的化合物，包括但不限于具有下面结构的n～2～-乙酰基-l-离胺酰基-l-缬氨酰基-n～5～-胺甲酰基-n-[4-({[(2-{[({(1s)-1-(氯甲基)-3-[(5-{[(1s)-1-(氯甲基)-5-(膦酰氧基)-1,2-二氢-3h-苯并[e]吲哚-3-基]羰基}噻吩-2-基)羰基]-2,3-二氢-1h-苯并[e]吲哚-5-基}氧基)羰基](甲基)氨基}乙基)(甲基)胺甲酰基]氧基}甲基)苯基]-l-鸟胺酰胺：

具有下面结构的n～2～-乙酰基-l-离胺酰基-l-缬氨酰基-n～5～-胺甲酰基-n-[4-({[(2-{[({(8s)-8-(氯甲基)-6-[(3-{[(1s)-1-(氯甲基)-8-甲基-5-(膦酰氧基)-1,6-二氢吡咯并[3,2-e]吲哚-3(2h)-基]羰基}双环[1.1.1]戊-1-基)羰基]-1-甲基-3,6,7,8-四氢吡咯并[3,2-e]吲哚-4-基}氧基)羰基](甲基)氨基}乙基)(甲基)胺甲酰基]氧基}甲基)苯基]-l-鸟胺酰胺：

具有下面结构的n～2～-乙酰基-l-离胺酰基-l-缬氨酰基-n～5～-胺甲酰基-n-[4-({[(2-{[({(8s)-8-(氯甲基)-6-[(4-{[(1s)-1-(氯甲基)-8-甲基-5-(膦酰氧基)-1,6-二氢吡咯并[3,2-e]吲哚-3(2h)-基]羰基}五环[4.2.0.0～2,5～.0～3,8～.0～4,7～]辛-1-基)羰基]-1-甲基-3,6,7,8-四氢吡咯并[3,2-e]吲哚-4-基}氧基)羰基](甲基)氨基}乙基)(甲基)胺甲酰基]氧基}甲基)苯基]-l-鸟胺酰胺：

烯双炔(enediyne)是一类抗肿瘤细菌产物，其特征为具有九员和十员环或有经缀合的三键-双键-三键的环状系统存在。示例性烯双炔(enediyne)包括但不限于卡利奇霉素(calicheamicin)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、恩西拉霉素(uncialamicin)、达内霉素(dynemicin)及其衍生物。

格尔德霉素(geldanamycin)是与hsp90(热休克蛋白90)结合的苯醌安莎霉素(ansamycin)抗生素，其已被用来作为抗肿瘤药。示例性格尔德霉素(geldanamycin)包括但不限于17-aag(17-n-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素)和17-dmag(17-二甲基氨基乙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素)。

半星芒体(hemiasterlin)及其类似物(例如hti-286)结合至微管蛋白，裂解正常的微管动态学，并且于化学计量下使微管解聚合化。

美登素类(maytansines)或其衍生物类美登素类(maytansinoids)可藉于有丝分裂期间经由抑制微管蛋白的聚合以抑制微管形成而抑制细胞增殖。参见remillard等人,science189：1002-1005,1975。例示的美登素类(maytansines)和类美登素类(maytansinoids)包括但不限于美登素(mertansine)(dm1)及其衍生物以及安丝菌素(ansamitocin)。

吡咯并苯并二吖呯二聚物类(pyrrolobenzodiazepinedimers)(pbd)和吲哚啉并-苯并二吖呯二聚物类(indolino-benzodiazepinedimers)(ign)为含有一种或多种免疫官能团或其相等物的抗肿瘤剂，其结合至双螺旋dna。pbd和ign分子是以天然产物安曲霉素(athramycin)为基底，并且与dna以序列选择性方式相互作用，又优选地为嘌呤-鸟嘌呤-嘌呤序列。例示的pbd及其类似物包括但不限于sjg-136。

司普力西欧史塔丁类(spliceostatins)和普拉地内酯类(pladienolides)为抗肿瘤剂，其抑制剪接和与剪接体sf3b相互作用。司普力西欧史塔丁类(spliceostatins)包括但不限于司普力西欧史塔丁a(spliceostatina)、fr901464和具有下面结构的乙酸(2s,3z)-5-{[(2r,3r,5s,6s)-6-{(2e,4e)-5-[(3r,4r,5r,7s)-7-(2-肼基-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2h-哌喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基酯：

普拉地内酯类(pladienolides)的实例包括但不限于普拉地内酯b(pladienolideb)、普拉地内酯d(pladienolided)或e7107。

紫杉烷类(taxanes)为双萜类，其作为抗微管蛋白剂或有丝分裂抑制剂。例示的紫杉烷类(taxanes)包括但不限于太平洋紫杉醇(paclitaxel)(例如)和欧洲紫杉醇(docetaxel)

妥布赖森类(tubulysins)为由粘球菌(myxobacteria)菌型中分离出来的天然产物，其已显示可使微管解聚合化并且诱使有丝分裂停顿。例示的妥布赖森类(tubulysins)包括但不限于妥布赖森a(tubulysina)、妥布赖森b(tubulysinb)和妥布赖森d(tubulysind)。

长春花生物碱类(vincaalkyloids)还为抗微管蛋白剂。例示的长春花生物碱类(vincaalkyloids)包括但不限于长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、长春花碱酰胺(vindesine)和长春瑞滨(vinorelbine)。

因此，在一些实施方案中，该细胞毒性剂选自由下列所组成的组：mmad(单甲基耳抑素d(monomethylauristatind))、0101(2-甲基丙氨酰基-n-[(3r,4s,5s)-3-甲氧基-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1s)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-n-甲基-l-缬氨酰胺)、3377(n,2-二甲基丙氨酰基-n-{(1s,2r)-4-{(2s)-2-[(1r,2r)-3-{[(1s)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯啶-1-基}-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-n-甲基-l-缬氨酰胺)、0131(2-甲基-l-脯氨酰基-n-[(3r,4s,5s)-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-3-{[(1s)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-n-甲基-l-缬氨酰胺)、0131-ome(n,2-二甲基丙氨酰基-n-[(3r,4s,5s)-3-甲氧基-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-1-甲氧基-3-{[(2s)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-n-甲基-l-缬氨酰胺)、0121(2-甲基-l-脯氨酰基-n-[(3r,4s,5s)-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-3-{[(2s)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-n-甲基-l-缬氨酰胺)和乙酸(2s,3z)-5-{[(2r,3r,5s,6s)-6-{(2e,4e)-5-[(3r,4r,5r,7s)-7-(2-肼基-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2h-哌喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基酯。

在一些实施方案中，该药剂为免疫调节剂。免疫调节剂的实例包括但不限于更昔洛韦(gancyclovier)、伊那西普(etanercept)、他克艾司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、沃克普林(voclosporin)、环孢灵素(cyclosporine)、雷帕霉素(rapamycin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、马替麦考分酯(mycophenolgatemofetil)、胺甲蝶呤(methotrextrate)、糖皮质激素(glucocorticoid)及其类似物、细胞激素、干细胞生长因子、淋巴毒素、肿瘤坏死因子(tnf)、造血因子、介白素(例如介白素-1(il-1)、il-2、il-3、il-6、il-10、il-12、il-18和il-21)、集落刺激因子(例如颗粒性白血球集落刺激因子(g-csf)和颗粒性白血球巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf))、干扰素(例如干扰素-α、-β和-γ)、定名为“s1因子”的干细胞生长因子、红血球生成素和血小板生成素或其组合。

在一些实施方案中，该药剂部分为成像剂(例如荧光团或螯合剂)，诸如荧光素、若丹明(rhodamine)、镧系元素荧光质、及其衍生物或结合至螯合剂的放射性同位素。荧光团的实例包括但不限于异硫氰酸荧光素(fitc)(例如5-fitc)、亚酰胺荧光素(fluoresceinamidite)(fam)(例如5-fam)、伊红、羧基荧光素、赤藓红、alexa(例如alexa350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700或750)、羧基四甲基若丹明(carboxytetramethylrhodamine)(tamra)(例如5,-tamra)、四甲基若丹明(tetramethylrhodamine)(tmr)和磺酰若丹明(sulforhodamine)(sr)(例如sr101)。螯合剂的实例包括但不限于1,4,7,10-四氮杂环十二烷-n,n',n",n”'-四乙酸(dota)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(nota)、1,4,7-三氮杂环壬烷，1-戊二酸-4,7-乙酸(deferoxamine)、二伸乙基三胺五乙酸(dtpa)和1,2-双(o-氨基苯氧基)乙烷-n,n,n',n'-四乙酸)(bapta)。

在一些实施方案中，治疗性或诊断性放射性同位素或其他标记(例如pet或spect标记)可引入该缀合至本文所述egfrviii抗体的药剂中。放射性同位素或其他标记的实例包括但不限于³h,¹¹c,¹³n,¹⁴c,¹⁵n,¹⁵o,³⁵s,¹⁸f,³²p,³³p,⁴⁷sc,⁵¹cr,⁵⁷co,⁵⁸co,⁵⁹fe,⁶²cu,⁶⁴cu,⁶⁷cu,⁶⁷ga,⁶⁸ga,⁷⁵se,⁷⁶br,⁷⁷br,⁸⁶y,⁸⁹zr,⁹⁰y,⁹⁴tc,⁹⁵ru,⁹⁷ru,⁹⁹tc,¹⁰³ru,¹⁰⁵rh,¹⁰⁵ru,¹⁰⁷hg,¹⁰⁹pd,¹¹¹ag,¹¹¹in,¹¹³in,¹²¹te,¹²²te,¹²³i,¹²⁴i,¹²⁵i,¹²⁵te,¹²⁶i,¹³¹i,¹³¹in,¹³³i,¹⁴²pr,¹⁴³pr,¹⁵³pb,¹⁵³sm,¹⁶¹tb,¹⁶⁵tm,¹⁶⁶dy,¹⁶⁶h,¹⁶⁷tm,¹⁶⁸tm,¹⁶⁹yb,¹⁷⁷lu,¹⁸⁶re,¹⁸⁸re,¹⁸⁹re,¹⁹⁷pt,¹⁹⁸au,¹⁹⁹au,²⁰¹tl,²⁰³hg,²¹¹at,²¹²bi,²¹²pb,²¹³bi,²²³ra,²²⁴ac,或²²⁵ac。

一些实施方案中，该药剂为治疗性蛋白包括但不限于毒素、激素、酶和生长因子。

毒素蛋白(或多肽)的实例包括但不限于白喉(例如白喉a链)、假单胞菌外毒素和内毒素、蓖麻毒素(例如蓖麻毒素a链)、相思豆毒素(例如相思豆毒素a链)、莫迪素(modeccin)(例如莫迪素a链)、α-核糖毒素(alpha-sarcin)、三年桐蛋白(aleuritesfordiiprotein)、香石竹毒蛋白(dianthinprotein)、核糖核酸酶(rnase)、dnasei、葡萄球菌肠毒素-a、商陆抗病毒蛋白(pokeweedantiviralprotein)、白树毒素(gelonin)、白喉毒素、美洲商陆蛋白(phytolacaamericanaprotein)(papi、papii和pap-s)、苦瓜抑制剂(momordicacharantiainhibitor)、麻疯素毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥阜草抑制剂(sapaonariaofficinalisinhibitor)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲霉素、酚徽素、伊诺霉素(neomycin)、单端孢霉烯、抑制剂胱氨酸结模体(ick)肽(例如地中海果蝇毒素(ceratotoxin))和芋螺毒素(例如kiiia或smiiia)。

在一些实施方案中，该药剂为生物可兼容性聚合物。如本文所述的egfrviii抗体可缀合至生物可兼容性聚合物以增加血清半衰期和生物活性和/或延长体内半衰期。生物可兼容性聚合物的实例包括水溶性聚合物诸如聚乙二醇(peg)或其衍生物和含两性离子的生物可兼容性聚合物(例如含磷酸胆碱的聚合物)。

在一些实施方案中，该药剂为寡核苷酸，诸如反义寡核苷酸。

在另一方面中，本发明提供如本文所述的抗体或抗原结合片段的缀合物，其中该缀合物包含下式：抗体-(含有谷氨酰胺的酰基供体标签)-(接头)-(细胞毒性剂)。

含一个或多个反应性胺的接头的实例包括但不限于ac-lys-gly(乙酰基-赖氨酸-甘氨酸)、氨基己酸、ac-lys-β-ala(乙酰基-赖氨酸-β-丙氨酸)、氨基-peg2(聚乙二醇)-c2、氨基-peg3-c2、氨基-peg6-c2(或氨基peg6-丙酰基)、ac-lys-val-cit-pabc(乙酰基-赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧羰基)、氨基-peg6-c2-val-cit-pabc、氨基己酰基-val-cit-pabc、[(3r,5r)-1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰基}哌啶-3,5-二基]双-val-cit-pabc、[(3s,5s)-1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰基}哌啶-3,5-二基]双-val-cit-pabc、腐胺或ac-lys-腐胺。

使用egfrviii抗体及其抗体缀合物的方法

本发明的抗体或抗体缀合物可用于许多应用，其包括但不限于治疗性处理方法和诊断性处理方法。

通过上文所述的方法而获得的抗体(例如单特异性和双特异性)和抗体缀合物可用以作为药物。在一些实施方案中，此药物可用于治疗癌，包括实体肿瘤和液体肿瘤(liquidtumor)。在一些实施方案中，该癌症是egfrviii相关癌症，其包括但不限于：胶质母细胞瘤(例如多型性胶质母细胞瘤(glioblastomamultiform))、间变性星细胞瘤(anaplasticastrocytoma)、巨细胞胶质母细胞瘤(giantcellglioblastoma)、神经胶质肉瘤(gliosarcoma)、间变性寡树突神经胶细胞瘤(anaplasticoligodendroglioma)、间变性室管膜瘤(anaplasticependymoma)、间变性寡星细胞瘤(anaplasticoligoastrocytoma)、脉络丛癌(choroidplexuscarcinoma)、间变性神经节性神经胶质瘤(anaplasticganglioglioma)、松果体母细胞瘤(pineoblastoma)、松果体细胞瘤(pineocytoma)、脑膜瘤(meningioma)、髓质上皮瘤(medulloepithelioma)、室管膜母细胞瘤(ependymoblastoma)、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、小脑幕上原始神经外胚层肿瘤(supraentorialprimitiveneuroectodermaltumor)、非典型畸胎/类横纹肌细胞瘤(atypicalteratoid/rhabdoidtumor)、混合型神经胶质瘤(mixedglioma)、头颈癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、髓母细胞瘤(medullobastoma)、结直肠癌、肛门癌、子宫颈癌、肾癌、皮肤癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、甲状腺癌、间皮瘤(mesothelioma)、子宫癌、淋巴瘤或白血病。

在一些实施方案中，所提供的是抑制具有表达egfrviii的恶性细胞的受试者中肿瘤生长或进展的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的组合物，该组合物包含如本文中所述的egfrviii抗体或egfrviii抗体缀合物。在其他实施方案中，所提供的是抑制受试者中表达egfrviii的细胞转移(metastasis)的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的组合物，该组合物包含如本文中所述的egfrviii抗体或egfrviii抗体缀合物。在其他实施方案中，所提供的是诱发受试者中恶性细胞肿瘤消退的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的组合物，该组合物包含如本文中所述的egfrviii抗体或egfrviii抗体缀合物。

在一些实施方案中，根据本发明的抗体(例如单特异性或双特异性)或抗体缀合物可用于产生用于治疗有此需要的患者的癌症的药物。

在一些实施方案中，治疗可组合一种或多种针对癌症的疗法，该疗法选自下列组：抗体疗法、化疗、细胞介素疗法、靶向疗法、疫苗疗法、树突细胞疗法、基因疗法、激素疗法、手术切除、激光疗法和放射疗法。例如，本发明的的抗体(单特异性或双特异性)或抗体缀合物可连同以下施用至患者(例如之前、同时或之后)：1)标准照护，包括辐射、手术切除、化疗(例如替莫唑胺(temozolomide)、丙卡巴肼(procarbazine)、双氯乙基亚硝脲(carmustine)、环己亚硝脲(lomustine)、长春新碱(vincristine)等)、抗体疗法诸如贝伐单抗(bevacizumab)、抗血管新生疗法和/或肿瘤治疗领域；2)疫苗，其包括egfrviii疫苗；3)靶向疗法，诸如激酶抑制剂(例如依维莫司(everolimus))；和4)免疫疗法，其包括但不限于抗pd-1、抗pd-l1、抗pd-l2、抗41bb、抗tim3、抗lag3、抗tigit、抗ox40、抗hvem、抗btla、抗cd40、抗cd47、抗csf1r、抗csf1、抗marco、抗il8、抗cxcr4和抗ctla4抗体。

根据本发明的抗体(例如单特异性或双特异性)或抗体缀合物的施用可以任何便利方式进行，其包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输液、植入或移植。本文中所述的组合物可皮下、皮内、肿瘤内、颅内、节间内(intranodally)、髓内(intramedullary)、肌内、静脉内或淋巴内(intralymphatic)或腹膜内注射而施用。在一个实施方案中，本发明的异多聚体抗体组合物优选的是通过静脉内注射来施用。

在一些实施方案中，抗体(例如单特异性或双特异性)或抗体缀合物的施用可包含施用例如每kg体重约0.01至约20mg(包括在此范围内所有mg/kg的整数值)。在一些实施方案中，抗体或抗体缀合物的施用可包含施用每kg体重约0.1至10mg(包括在此范围内所有mg/kg的整数值)。该异多聚体抗体可以以一个或多个剂量施用。在一些实施方案中，该抗体或抗体缀合物有效量可以单个剂量施用。在一些实施方案中，该抗体有效量可以在一段时间超过一个剂量施用。施用时机是在管理医师的判断内并且取决于患者临床病况。虽然受试者需求各异，但针对特定疾病或病况的给定抗体(例如单特异性或双特异性)或抗体缀合物的有效量最佳范围的测定是在本领域能力范围内的。有效量意指提供治疗或预防益处的量。所施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和重量、共同治疗(若有的话)的种类、治疗频率和期望的效果的性质。在一些实施方案中，有效量的异多聚体抗体或包含其抗体的组合物是非经肠胃施用的。在一些实施方案中，施用可以静脉内施用。在一些实施方案中，施用可通过注射至肿瘤内而直接完成。

在一些实施方案中，在本文中所提供的抗egfrviii抗体可用于诊断目的，诸如在测定中，以鉴别样本中或患者中的egfrviii蛋白质(例如在免疫组织化学测定)。

组合物

在一个方面中，本发明提供药物组合物，其包含如上述的本发明的抗体(例如单特异性或双特异性)或抗体缀合物或其部分于药学上可接受的载体中。在某些实施方案中，本发明的多肽可以中性形式(包括两性离子形式)存在或为正电荷或负电荷物质。在一些实施方案中，该多肽可与抗衡离子络合以形成“药学上可接受的盐类”，其是指包含一个或多个多肽和一个或多个抗衡离子的络合物，其中所述抗衡离子是源自药学上可接受的无机和有机酸类和碱类。

该抗体(例如单特异性或双特异性)或该抗体缀合物或其部分可单独施用或组合一个或多个其他本发明的多肽或组合一种或多种其他药物(或为其任何组合)。本发明的药物组合物、方法和用途由此还涵盖组合(共同施用)其他活性剂的实施方案，如下所述。

如本文中所使用，术语“共同施用”和“组合(与...组合)”是指本发明的抗体和一种或多种其他治疗剂，是意欲意指、并且是指并包括下列者：(i)当这样的组分经配制一起成为单一药剂型(该单一药剂型实质上同时释放该组分至该患者)时，同时施用在本文中所公开的异二聚体和治疗剂的此组合至需要治疗的患者；(ii)当这样的组分是互相分开配制成为分离的剂型(其于实质上同时被患者用药、因此所述组分是在实质上同时经释放中该患者)时，实质上同时施用在本文中所公开的异二聚体和治疗剂的此组合至需要治疗的患者；(iii)当这样的组分是互相分开配制成为分离的剂型(其于连续时间被患者以各施用之间明显时间间隔用药、因此所述组分是在实质上不同时间经释放予该患者)时，是依序施用在本文中所公开的异二聚体和治疗剂的此组合至需要治疗的患者；(iv)当这样的组分是经配制一起成为单一药剂型(该单一药剂型以经控制方式释放该组分、因此它们在相同和/或不同时间同时、连续和/或重叠释放至该患者)时(若各部分可通过相同或不同途径来施用)，是依序施用在本文中所公开的异二聚体和治疗剂的此组合至需要治疗的患者。

通常，在本文中所公开的抗体(例如单特异性或双特异性)或抗体缀合物或其部分适合以与一种或多种药学上可接受的赋形剂联合的配制物来施用。术语“赋形剂”在本文中所使用是描述本发明的化合物以外的任何成分。赋形剂的选择将很大程度地取决于诸如特定施用模式、赋形剂对裂解度和稳定性的效果和剂型性质的因素。如本文中所使用，“药学上可接受的赋形剂”包括任何和所有生理可兼容的溶剂、分散液介质、涂覆、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收迟滞剂(delayingagent)和类似者。药学上可接受的赋形剂的一些实例是水、食盐水、磷酸盐缓冲液、右旋糖、甘油、乙醇和类似者，及其组合。在许多情况中，优选的是包括等张剂，例如糖、多元醇诸如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠在该组合物中。药学上可接受的物质的另外实例是润湿剂或小量辅助物质诸如润湿或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强抗体的储放寿命或有效性。

本发明的药物组合物及其制备方法将为熟知本领域者所清楚明了的。这样的组合物及其制备方法可见于例如remington’spharmaceuticalsciences,19thedition(mackpublishingcompany,1995)。药物组合物优选的是于gmp条件下产生。

本发明的药物组合物可以大量、以单一单位剂量或复几个单一单位剂量来制备、包装或贩卖。如本文中所使用，“单位剂量”是分离的药物组合物量，其包含预定量的活性成分。活性成分量通常等同会施用受试者或此剂量便利分额(诸如此剂量的二分之一或三分之一)的有效成分的剂量。本领域中所接受的用于施用肽、蛋白质或抗体的任何方法可适用于在本文中所公开的异二聚体蛋白质及其部分。

本发明的药物组合物典型上适用于非经肠胃施用。如本文中所使用，药物组合物的“非经肠胃施用(parenteraladministration)”包括以受试者的组织的物理破裂为特征的任何施用途径和通过组织内裂口施用药物组合物，由此通常导致直接施用至血流中、至肌肉中或至内部器官中。非经肠胃施用由此包括但不限于通过注射剂组合物、通过通过手术切口施加组合物、通过通过穿入组织非手术伤口施加组合物和类似者施用药物组合物。特别地，非经肠胃施用所涵盖者包括但不限于皮下、腹膜内、肌内、胸骨内、静脉内、动脉内、脊髓内、室内、尿道内、颅内、滑液内(intrasynovial)注射或输注；和肾透析输注技术。优选实施方案包括静脉内和皮下途径。

适用于非经肠胃施用的药物组合物配制物典型上通常包含活性成分组合药学上可接受的载体，诸如无菌水或无菌等张食盐水。这样的配制物可以适用于推注(bolus)施用或连续施用的形式来制备、包装或贩卖。可注射配制物可以单位剂型(诸如安瓿)或含有防腐剂的多剂容器来制备、包装或贩卖。用于非经肠胃施用的配制物包括但不限于悬浮液、溶液、乳胶于油状或水性媒液、糊剂和类似者中。这样的配制物可另包含一种或多种额外成分，其包括但不限于悬浮剂、安定剂或分散剂。在用于非经肠胃施用的配制物的一个实施方案中，该活性成分是以干燥(即粉末或颗粒)形成来提供以供非经肠胃施用经重组的组合物之前用适合的媒介物(例如无菌无热原水)来重构(reconstitution)。非经肠胃配制物还包括水溶液，其可含有赋形剂诸如盐类、碳水化合物和缓冲剂(优选的是ph为3至9)，但为一些应用，它们可更适于经配制为无菌非水溶液或为经干燥的形式以与适合的媒介物(诸如无菌无热原水)合用。示例性非经肠胃施用形式包括在无菌水溶液中的溶液或悬浮液，例如水性丙二醇或右旋糖溶液。这样的剂型可适于缓冲，若需要时。其他可用的可非经肠胃施用的配制物包括包含微晶形式或微脂体制剂的活性成分者。用于非经肠胃施用的配制物可经配制以立即和/或修饰释放(modifiedrelease)。修饰释放配制物包括控释、迟释、持续释放、脉冲释放、靶向释放和计划性释放配制物。例如，在一个方面中，无菌可注射溶液可通过并入所需量的异二聚体蛋白质(例如双特异性抗体)于适当溶剂中、依需要加上前述所列成分的一者或组合、接以过滤灭菌来制备。通常，分散液是通过并入活性化合物至含有基本分散介质和来自上文所列的所需其他成分的无菌媒介物来制备。在用于无菌可注射溶液制备的无菌粉末情况中，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上任何额外期望的成分(来自其先前无菌过滤溶液)的粉末。溶液的适当流动性可通过例如使用涂覆诸如卵磷脂、通过维持需要粒径(在分散的情况中)和通过使用界面活性剂来维持。可注射组合物的延长吸收可通过延迟吸收的用剂(例如单硬脂酸盐类和明胶)包括至组合物中来产生。

本发明的示例性、非限制性药物组合物是作为无菌水溶液的配制物，该无菌水溶液具有ph范围在约5.0至约6.5并且包含约1mg/ml至约200mg/ml的在本文中所公开的抗体(例如单特异性或双特异性)或抗体缀合物，约1毫摩尔(millimolar)至约100毫摩尔的组氨酸缓冲液、约0.01mg/ml至约10mg/ml的聚山梨糖醇酯80、约100毫摩尔至约400毫摩尔的茧糖和约0.01毫摩尔至约1.0毫摩尔的二钠edta二水合物。

给药方案可经调整以提供最佳期望的反应。例如，可施用单一推注、随时间施用数次分开的剂量可或该药剂量可依治疗情况急迫性所指示来比例减少或增加。特别有利的是配制非经肠胃组合物成剂量单位型以供简便施用和剂量均一。剂量单位型，如本文中所使用，是指物理性分离的单元，其适用作为待治疗患者/受试者的单位剂量；各单位含有预定数量的活性化合物，其经计算以联合需要的医药载体产生期望的治疗效果。用于本发明的剂量单位型的规格通常通过和直接取决于下列来规定：(a)化学治疗剂独特的特性和期望实现的特定治疗或预防效果，和(b)针对受试者治疗敏感性混炼此活性化合物的本领域中固有限制。

因此，本领域技术人员将理解，基于在本文中所提供的揭露，该药剂量和给剂方案是根据治疗技术领域中所熟知的方法来调整。即，最大可耐受剂量可即建立并且有效量提供可检测的对患者治疗益处还可测定，施用各剂的时序需要还同，以提供可检测的治疗益处予患者。因此，虽然某些剂量和施用给药方案在本文中是示例性，但这些实施例并非限制在实施本发明中可提供予患者的剂量和施用给药方案。

应注意的是，剂量值可随欲减轻的病况的型式和严重度而异，并且可包括单剂或多剂。应进一步了解的是，针对任何特定受试者，特定给药方案应根据受试者需求和施用或指导组合物施用的人员的专业判断随时间调整，并且在本文中所述的剂量范围仅是示例性并且不欲限制所请的组合物的范围或实施。进一步，以此发明的组合物的给药方案可基于各种因素，包括患者的疾病类型、年龄、重量、性别、病况、病况的严重度、投与途径、以及所利用的特定抗体。因此，该给药方案可变异大，但可使用标准方法例行测定。例如，剂量可基于药物动力学或药力学参数来调整，可包括临床效果诸如毒性效果和/或实验室数值。因此，本发明涵盖以熟悉本技术者测定的患者内剂量递升(intra-patientdose-escalation)。测定适当剂量和给药方案是相关技术领域中所熟知的并且一旦提供在本文中所公开的教导内容可为本领域技术人员理解为涵盖在内。

针对施用人受试者，在本文中所公开的抗体(例如单特异性或双特异性)或抗体缀合物的总每月剂量典型上范围在每位患者约0.5至约1200mg，当然取决于施用模式、作用机制和靶生物学。举例而言，静脉内每月剂量可需要约1至约1000mg/患者。总每月剂量可以单一或分开剂量施用，并且可在医师的考虑下，落在本文中所给定的典型范围外。

用于治疗或预防有效量的在本文中所公开的抗体(例如单特异性或双特异性)或抗体缀合物的示例性、非限制性范围是约1至约1000mg/患者/月。在某些实施方案中，该异二聚体蛋白质可以约1至约200或约1至约150mg/患者/月来施用。

试剂盒

本发明还提供用于本方法的试剂盒。本发明的试剂盒包含一个或多个含有如本文所述的抗体(例如单特异性或双特异性)或抗体缀合物的容器和根据本文中所述的本发明的方法中的任一者所使用的说明。通常，所述说明包含施用该异二聚体蛋白质的说明以用于上述的治疗性处理。

有关使用如本文所述的抗体(例如单特异性或双特异性)或抗体缀合物的说明通常包括用于该意图处理的剂量、给剂方案和施用途径的信息。所述容器可为单位剂量、大量包装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒所提供的说明通常为在标签或包装仿单上的书面说明(例如包含在试剂盒中的纸)，但机器读取的说明(例如磁性或光学储存磁盘上携带的说明)也可被接受。

本发明的试剂盒经适当包装。适当的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐、可弯折的包装(例如密封的美拉(mylar)或塑料袋)和该类似物。还考虑的是与特殊装置组合使用的包装，诸如吸入器、经鼻施用装置(例如雾化器)或输注装置诸如小型泵。试剂盒可能具有无菌接口(例如该容器可能为具有可被皮下注射针穿刺的塞子的静注溶液袋或小瓶)。该容器也可能具有无菌接口(例如该容器可能为具有可被皮下注射针穿刺的塞子的静注溶液袋或小瓶)。该组合物中的至少一种活性剂是双特异性抗体。该容器可能另包含第二药物活性剂。

试剂盒可能可任意选择地提供额外成分诸如缓冲剂和解说信息。通常，该试剂盒包含容器和在该容器上或与该容器相关的标签或包装仿单。

为所有目的以引用方式并入的是美国临时申请案第62/281,543号(2016年1月21日申请)和第62/431,766号(2016年12月8日申请)内容。

生物保藏

本发明的代表材料于_____保藏在美国典型培养物保藏中心,10801universityboulevard,manassas,va.20110-2209,usa。具有atcc保藏号_____的载体_____是编码轻链可变区的多核苷酸，以及具有atcc保藏号_____的载体_____是编码重链可变区的多核苷酸。所述保藏是根据布达佩斯条约中关于用于专利程序目的的微生物保藏的国际认可条款和根据布达佩斯条约的管理条款进行。这确保从保藏之日起30年该保藏的存活培养物的维持。该保藏的培养物将根据布达佩斯条约的条款由atcc予以提供，并受制于辉瑞公司和atcc之间的协议，此确保该保藏的培养物的后代在相关的美国专利发布时或任何美国或外国专利申请案对公众公开(以先行者为准)时能被永久和不受限制地取得，并保证美国专利商标局专员所决定的可取用该保藏的培养物的后代的个人将有权按35u.s.c.第122节和根据35u.s.c.第122节的专员规则(包括37c.f.r.第1.14节，特别参考886og638)来取得。

本申请的受让人已同意若保藏物质的培养在合适的条件下培养而死亡或损失或被破坏，该物质将在通知时以另一相同物质及时更换。保藏物质的可用性并不能被解释为被许可在违反任何政府当局根据其专利法所授予的权利下实施本发明。

下列实施例仅用于说明目的并且不欲以任何方式限制本发明的范围。事实上，除了在本文中所示和描述的，熟知本领域者依据前述说明将更清楚本发明的各种改良，本发明的各种改良落在所附申请专利范围的范围内。

实施例

实施例1：针对重组抗egfrviii鼠-人嵌合抗体和人源化抗体的亲和力测定

此实施例测定嵌合和人源化抗egfrviii抗体在25℃和37℃下的亲和力。

自杂交瘤产生的抗egfrviii小鼠(m)抗体m62g7是经测序和经亚克隆至用于表达鼠-人嵌合抗体的适合载体中。小鼠抗体m62g7的cdr是经移植至人构架上，并且经表达为人igg1重组抗体h62g7。h62g7的亲和力变体通过引入突变至重链和轻链的cdr中而制成。重组抗egfrviii嵌合抗体m62g7和人源化h62g7抗体的亲和力是在配备有研究级经抗人fc偶合的cm4感测芯片的表面等离子体共振biacore^tmt200生物传感器(gehealthcareinc.,piscataway,nj)上来测量。接着将抗egfrviii抗体通过抗人fc来捕获。接着，将单体经8个组氨酸标记的人egfrviii胞外结构域注射作为分析物(10倍连续稀释，最高浓度在1000nm)。抗egfrviii抗体对人egfrviii的亲和力是在25℃和37℃两者下测量(表6)。在相同测定条件下，这些抗体均未显示可检测的结合至1000nm的经8个组氨酸标记的重组野生型蛋白质egfrwt。

在表6中，h62g7变体是参照重链变异接着轻链变异来描述。举例而言，抗体株“h62g7-eq/l6”是指该h62g7株含有该“eq”变异在重链(在本文中还称为“h62g7-eq”)中和该“l6”变异在轻链(在本文中还称为“h62g7-l6”)中。这些重链和轻链氨基酸序列是提供在表2中。此外，在本申请案中，h62g7变体可用重链或轻链变体先写在前面来提及-所以，例如“h62g7-eq/l6”和“h62g7-l6/eq”两者均是指含有h62g7-eq重链和h62g7-l6轻链的抗体。

表6

实施例2：针对人抗egfrviii抗体的亲和力测定

此实施例测定各种人抗egfrviii抗体在37℃下的亲和力。

为产生人的抗egfrviii抗体，将转基因alivamab小鼠(ablexisllc,sanfrancisco,ca)用表达egfrviii、f98-npegfrviii(美国典型培养物保藏中心,manassas,va)和针对egfrviii中的链接区域(junctionregion)的肽(seqidno：227：cgsgsgleekkgnyvvtdh)的大鼠胶质母细胞瘤细胞系交替方案来免疫化。杂交瘤是使用标准技术而产生。为测定这些杂交瘤对egfrviii的结合亲和力和特异性，将培养物上清液中的抗体使用配备有经抗小鼠fc偶合的cm4感测芯片的biacore^tmt200生物传感器(biacore^tmab,uppsala,sweden-nowgehealthcare)、通过抗小鼠fc来捕获。接着，将单体经8个组氨酸标记的人egfrviii胞外结构域注射作为分析物(以最高浓度1000nm开始10倍连续稀释)。抗egfrviii抗体对人egfrviii的亲和力是在37℃下测量(表7)。在相同测定条件下，这些杂交瘤抗体均未显示可检测的结合至1000nm的经8个组氨酸标记的重组野生型蛋白质egfrwt。

表7

实施例3：通过流动式细胞测量术的抗egfrviii抗体对表达egfrviii细胞系的结合特异性

此实施例证实抗egfrviii抗体对表达egfrviii的细胞的细胞结合特异性

为评估自alivamab小鼠所产生的egfrviii抗体的细胞结合特异性，使用三种等基因是(isogenic)大鼠胶质母细胞瘤细胞系和人癌细胞系：f98(不表达任何形式的人egfr)、f98-egfrwt(表达野生型egfr)、f98-npegfrviii(表达egfrviii)和a431(表皮样癌细胞系，具有野生型egfr过量表达)，均获自美国典型培养物保藏中心(manassas,va)。对于细胞染色，将500,000个细胞以50μl杂交瘤上清液在4℃下孵育45min、用结合缓冲液(pbs(磷酸盐缓冲液)+0.5％bsa(牛血清白蛋白))洗涤，接以用来自jacksonimmunoresearchlaboratories(westgrove,pa)的经fitc缀合的山羊抗小鼠fc特异性第二抗体孵育。表8a和8b显示egfrviii抗体(抗体株20g5除外)在表达egfrviii细胞系上的平均荧光强度(mfi)是在未表达的细胞系上的至少10倍大。图1a、图1b和图1c显示三种egfrviii特异性抗体株(其已被克隆并且经表达为重组人igg1抗体)42g9(图1a)、32a10(图1b)和32g8(图1c)对三种f98细胞系的facs结合直方图的实施例。

表8a

表8b

实施例4：针对来自噬菌体库的全人抗egfrviii抗体的亲和力测定

此实施例测定各种人抗egfrviii抗体在25℃下的亲和力。

获自噬菌体库筛选的人抗egfrviii抗体是经测序和经亚克隆至用于表达重组人igg1抗体的适合载体中。抗体的亲和力是在配备有经抗人fc偶合的cm4感测芯片的表面等离子体共振biacore^tmt200生物传感器(gehealthcareinc.,piscataway,nj)上在25℃下(表9)来测量。将抗egfrviii抗体通过抗人fc来捕获。接着，将单体经8个组氨酸标记的人egfrviii胞外结构域注射作为分析物(在1000nm开始10倍连续稀释)。在两种抗体中，仅c6显示在25℃下极弱但可检测的结合至1000nm的经8个组氨酸标记的重组野生型蛋白质egfrwt。

表9

实施例5：gbm细胞系表达egfrviii的产生和特性分析

此实施例证实野生型egfr和egfrviii表达于gbm细胞系中。

使用五种经gfp(绿荧光蛋白)和荧光素酶转导(transduce)的人胶质母细胞瘤细胞系dkmg、ln18、ln18-egfrviii、ln229和ln229-egfrviii以用于功能性特征分析。dkmg，其表达内源野生型egfr和egfrviii两者，是获自dsmz(braunschweig,germany)。ln18和ln229，其仅表达野生型egfr，是获自美国典型培养物保藏中心(manassas,va)。为产生经gfp-荧光素酶标记的细胞系，将dkmg、ln18和ln229是用编码gfp(绿荧光蛋白)和荧光素酶两者于双顺反子(bicistronic)系统中的慢病毒(lentivirus)颗粒(amsbio,cambridge,ma)来转导。接着，通过用编码全长egfrviii基因(seqidno：201)的慢病毒(lentivirus)载体来性状引入(transduction)亲代细胞系而产生ln18-egfrviii和ln229-egfrviii。接着，使用流式细胞仪分析在各个细胞系中的野生型egfr和egfrviii表达。对于细胞染色，将300,000个细胞以在100μl结合缓冲液中的3μgegfr野生型特异性或egfrviii特异性抗体在4℃下孵育45min、用结合缓冲液洗涤，接以用来自jacksonimmunoresearchlaboratories(westgrove,pa)的经alexafluor647缀合的山羊抗人fc特异性第二抗体孵育。图2a至c显示野生型egfr和egfrviii分别在ln229-egfrviii、ln18-egfrviii和dkmg中表达分布数据变化(expressionprofile)。

实施例6：egfrviii-cd3双特异性抗体的体外细胞毒性测定

此实施例证实egfrviii-cd3双特异性抗体对表达egfrviii的gbm细胞系的细胞毒性。

为产生egfrviii-cd3双特异性抗体，将抗egfrviii和抗cd3抗体的重链可变结构域经亚克隆至适当的基于人igg2的双特异性载体并在hek293细胞中与它们的对应轻链表达。纯化egfrviii-cd3双特异性抗体是根据经公开发表的方法来完成(jmolbiol,2012,3,pp204-219；美国专利公开案2013/0115208)。在这些测定中，egfrviii-cd3双特异性抗体含有抗egfrviii抗体株h62g7-eq/l6、30d8或42g9的抗egfrviii序列。

在此实施例中，靶细胞系：经egfrviii转导的ln18-egfrviii细胞(图3a)和亲代ln18(图3b)细胞；经egfrviii转导的ln229-egfrviii(图4a)和亲代ln229(图4b)细胞；以及dkmg细胞(其表达内源性egfrviii和egfr野生型蛋白质)(图5)。

对于细胞毒性测定，将经荧光素酶转导的靶细胞在10,000个细胞/孔下、在pbmc培养基(rpmi，10％fbs，2mm的l-谷氨酰胺，1％pen/strep，20umβ-巯乙醇，10mm的hepes，1％的非必需氨基酸，1mm丙酮酸钠)中平板培养于白色96孔盘，并在37℃下孵育。二十四小时后，经活化的t细胞在期望的t：e(靶：效应细胞)比例下(10,000个t细胞用于1：1，针对ln18和ln229细胞；50,000个t细胞用于1：5，针对dkmg细胞)是加至靶细胞连同egfrviii-cd3双特异性抗体、阴性对照组人igg、阴性对照组于双特异性fc骨架(backbone)中的cd3单价抗体或阴性对照组于野生型人igg中的双价抗egfrviiimab42g9。将细胞在37℃下孵育另外24h。为检测在测定结束下存活靶细胞的量，将培养基丢弃并将100μl的150μg/ml荧光素加至各孔。发光信号是在spectramaxm5孔盘读值机上获得(moleculardevices,sunnyvale,ca)。活靶细胞百分比是通过将各样本发光读值对仅含有靶细胞的对照组盘孔发光读值来正归化而测定。

结果总结于图3a、3b、4a、4b和5中。在图中，egfrviii-cd3双特异性抗体数据是由空心符号来示的，并且阴性对照组抗体数据是通过实心符号来示的。

表达egfrviii的靶细胞对用egfrviii-cd3双特异性抗体h62g7-eq/l6/cd3bifc、30d8/cd3bifc和42g9/cd3bifc的处理显示剂量依赖性反应。相反地，仅表达egfr野生型蛋白质的靶细胞未经杀除，由此指示出egfrviii-cd3双特异性抗体对表达egfrviii的细胞的特异性。此外，表达egfrviii的靶细胞并未显示对以阴性对照抗体(人igg、cd3单价bifc或42g1higg1(抗egfrviii抗体))处理的反应。

举例而言，经用0.01nm的h62g7-eq/l6/cd3bifc处理的ln18-egfrviii靶细胞在测定结束时是仅约20％存活。相反地，经用0.1nm的对照igg、cd3单价bifc或42g9higg1处理的ln18-egfrviii靶细胞在测定结束时是约100％存活(图3a)。此外，经用0.01nm的h62g7-eq/l6/cd3bifc处理的亲代细胞系ln18靶细胞在测定结束时是约100％存活(图3b)。

在另一实施例中，经用0.01nm的42g9/cd3bifc处理的ln229-egfrviii靶细胞在测定结束时是仅约35％存活。相反地，经用0.1nm的对照igg、cd3单价bifc或42g9higg1处理的ln229-egfrviii靶细胞在测定结束时是约90至100％存活(图4a)。此外，经用0.01nm的42g9/cd3bifc处理的亲代细胞系ln229靶细胞在测定结束时是约100％存活(图4b)。

在另一实施例中，经用1nm的h62g7-eq/l6/cd3bifc处理的dkmg靶细胞在测定结束时是仅约35％存活(图5)。相反地，经用1nm的对照igg、cd3单价bifc或42g9higg1处理的dkmg靶细胞在测定结束时是约100％存活(图5)。

这些数据证实egfrviii-cd3双特异性抗体有效介导egfrviii表达细胞的通过t细胞的杀除。

实施例7：抗egfrviii-cd3双特异性抗体在gbm模式ln229-egfrviii中的体内研究

此实施例测定抗egfrviii双特异性抗体在皮下ln229-egfrviiigbm细胞系模式中的体内抗肿瘤活性。

将三百万个ln229-egfrviii细胞皮下植入至5至6周大的nsg小鼠(jacksonlaboratory,sacramento,ca)中。肿瘤体积是通过卡尺装置每周测量一次并且以下式计算：肿瘤体积＝(长度×宽度2)/2。在肿瘤植入后第18天，将动物依肿瘤尺寸随机分配为每组五只动物。腹膜内施用单一药剂量2千万新鲜泛t细胞，接以尾静脉一次推注(bolustailveininjection)0.5mg/kg的egfrviii-cd3双特异性抗体(该抗体含有抗egfrviii抗体株h62g7-eq/l6、30d8或42g9的抗egfrviii序列)或在双特异性fc骨架中的cd3单价对照组。

结果总结于图6中。在图中，egfrviii-cd3双特异性抗体数据是由空心符号来示的，并且阴性对照组抗体数据是通过实心符号来示的。

egfrviii-cd3双特异性抗体h62g7-eq/l6/cd3bifc、30d8/cd3bifc和42g9/cd3bifc抑制表达egfrviii的ln229-egfrviiigbm细胞的体内生长。相反地，阴性对照抗体cd3单价bifc和未处理对照组(即小鼠未以t细胞或抗体给剂)并未抑制ln229-egfrviiigbm细胞的体内生长。举例而言，在肿瘤植入后第37天，经egfrviii-cd3双特异性抗体30d8/cd3bifc和42g9/cd3bifc处理的小鼠的平均肿瘤体积小于100mm³，而未处理或经cd3单价bifc处理的小鼠的平均肿瘤体积是大于1200mm³。

这些数据证实egfrviii-cd3双特异性抗体抵抗表达egfrviii肿瘤细胞的体内抗肿瘤活性。

虽然所公开的教导内容已被参照各种应用、方法、试剂盒和组合物来说明，但应理解的是，可在不悖离本文中的教导内容和下文所请发明下而作出各种改变和修饰。上文的实施例是提供以更能描绘所公开的教导内容并且未意欲限制在本文中所呈现的教导内容范围。虽然该教导内容已就这些示例性实施方案而言来说明，但熟悉本技术者将容易了解可有这些示例性实施方案的许多变异和修饰而不需过度实验。所有这样的变异和修饰是在本教导内容的范围内。

在本文中所引用的所有参考文献，包括专利、专利申请案、论文、教科书和类似者，以及其中所引用的参考文献，在此是以引用方式全部并入。若所并入的文献和类似材料的一个或多个不同于或抵触本案，包括但不限于所界定的术语、术语的使用、所述的技术或类似者，则以本案为准。

上文的说明和实施例详述某些本发明的特定实施方案并且说明本案发明人所思酌的最佳模式。然而，应理解的是，不论前述文字中显现详述有多详尽，本发明是可以许多方式来实施，并且本发明应依据所附的申请专利范围及其任何等效物来解读。

序列表

<110>pfizerinc.

wong,oikwan

chou,joyceching

<120>针对表皮生长因子受体变体iii和cd3的单特异性和双特异性抗体及其用途

<130>pc72271prov2

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phealatrptyrglnglnargproglyglnalaproargleuleuleu

354045

tyrglyalathrthrargalathrglyleuproglyargphesergly

505560

serglyserglythrgluasnileleuthrileserserleuglnser

65707580

gluaspphealailetyrphecysglnglntyrlysasptrpprophe

859095

thrpheglyproglyserlysvalaspilelys

100105

<210>13

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>13

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuserasnala

202530

argmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaleuglu

354045

trpleuglyhisilepheserthraspglulyssertyrserthrser

505560

leuargglyargilethrileserlysaspthrserargglyleuval

65707580

valleuthrleuthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyr

859095

cysalaargaspserserasntyrgluglytyrpheaspphetrpgly

100105110

proglypheleuvalthrvalserser

115120

<210>14

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>14

gluilevalmetthrglnserproalathrleuservalserprogly

151015

gluargalathrleusercysargvalserglnserileglyalaasn

202530

leualatrptyrglnglnlyspheglyglnalaproargleuleuile

354045

tyrglyalaserthrargalathrglyileprovalargphesergly

505560

glyglyserglythrgluphethrleuthrileserserleuglnser

65707580

gluaspphealailetyrsercysglnglntyriletyrtrpprophe

859095

thrpheglyproglythrthrvalaspilelys

100105

<210>15

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>15

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuasnasnala

202530

argmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaleuglu

354045

trpphealahisilepheserthraspglulysserpheargthrser

505560

leuargserargleuthrleuserlysaspthrserlysserglnval

65707580

valleuthrmetthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyr

859095

cysalaargaspserserasntyrgluglytyrpheasptyrtrpgly

100105110

glnglyileleuvalthrvalserser

115120

<210>16

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>16

gluilevalmetthrglnserproalathrleuservalserprogly

151015

gluargalathrleusercysargalaserglnservalserasnasn

202530

leualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleuile

354045

tyrglyalaserthrargalathrglyvalproalaargphesergly

505560

seraspserglythrglupheserleuthrileserserleuglnser

65707580

gluaspphealavaltyrphecysglnglntyrlysasptrpprophe

859095

thrpheglyproglythrlysvalgluilelys

100105

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<211>122

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>17

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuserasnval

202530

argmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaleuglu

354045

trpphealahisilepheserseraspglulysserileargargser

505560

leuargserargleuthrleuserlysaspthrserlysserglnval

65707580

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859095

cysalaargaspserserasntyrgluglytyrpheaspphetrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserserasn

115120

<210>18

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>18

aspmetvalvalthrglnserproalathrleuservalserprogly

151015

gluargalathrleusercysargalaserglnservalglyserasp

202530

leualatrptyrglnglnproproglyglnserproargleuleuile

354045

tyrglyalaserthrargalathrglyvalproalaargphesergly

505560

serglyserglythraspphethrleuthrilethrserleugluser

65707580

gluaspphealavaltyrtyrcysglnglntyrasnasptrpprophe

859095

thrpheglyproglythrlysvalaspilelys

100105

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<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>19

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuserasnval

202530

argmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaleuglu

354045

trpphealahisilepheserseraspglulysserileargargser

505560

leuargserargleuthrleuserlysaspthrserlysserglnval

65707580

valleuthrmetthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyr

859095

cysalaargaspserserasntyrgluglytyrpheasptyrtrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>20

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>20

glumetgluvalthrglnserproalathrleuservalserprogly

151015

gluargalathrleusercysargalaserglnasnileglyserasp

202530

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354045

serglyalaserthrargalathrglyvalprothrargphesergly

505560

serglyserglythraspphethrleuthrilethrserleuglnser

65707580

gluaspphealavaltyrtyrcysglnglntyrasnasptrpprophe

859095

thrpheglyproglythrlysvalaspilelys

100105

<210>21

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>21

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuserasnala

202530

argmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaleuglu

354045

trpleualahisilepheserthraspglulysserileargargser

505560

leuargserargleuthrleuserlysaspthrserlysserglnval

65707580

valleuilemetthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyr

859095

cysalaargaspserserasntyrgluglytyrpheasptyrtrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>22

<211>107

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<220>

<223>合成的构建体

<400>22

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151015

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202530

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354045

tyrglyalaserthrargalathrglyvalproglyargphesergly

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serglyserglythrgluasnileleuthrileserserleuglnser

65707580

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thrpheglyproglyserlysvalaspilelys

100105

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<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>23

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuserasnala

202530

argmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaleuglu

354045

trpleualahisilepheserthraspglulysserileargargser

505560

leuargserargleuthrleuserlysaspthrserlysserglnval

65707580

valleuthrmetthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyr

859095

cysalaargaspserserasntyrgluglytyrpheasptyrtrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserser

115120

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<211>107

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<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>24

gluvalvalmetthrglnserproalathrleuservalserprogly

151015

gluargalathrleusercysargalaserglnglyvalserserasn

202530

phealatrptyrglnglnargproglyglnserproargleuleuleu

354045

tyrglyalaserthrargalathrglyvalproglyargphesergly

505560

serglyserglythrgluasnileleuthrileserserleuglnser

65707580

gluaspphealailetyrphecysglnglntyrlysasptrpprophe

859095

thrpheglyproglyserlysvalaspilelys

100105

<210>25

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>25

glnvalthrleuglugluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuserasnala

202530

argmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaproglu

354045

trpphealahisilepheserthraspglulysserleuargleuser

505560

leuargserargleuthrleuserlysaspthrserlysserglnval

65707580

valleuthrmetthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyr

859095

cysalaargaspserserasntyrgluglytyrpheasptyrtrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>26

<211>107

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<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>26

gluvalvalmetthrglnserproalathrleuservalserprogly

151015

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202530

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354045

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thrpheglyproglythrlysvalaspilelys

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<211>121

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<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>27

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuserasnala

202530

lysmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaleuglu

354045

trpleualahisilepheserthraspglulysserileargargser

505560

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65707580

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859095

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100105110

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115120

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<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>28

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151015

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202530

phealatrptyrglnglnargproglyglnalaproargleuleuleu

354045

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65707580

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>29

aspvalvalleuthrglnserproalathrleuservalserprogly

151015

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202530

leualatrptyrglnglnasnproglyglnalaproargleuleuile

354045

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505560

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65707580

gluhisseralavaltyrtyrcysglnglntyrasnasptrpprophe

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thrpheglyproglythrlysvalaspilelys

100105

<210>30

<211>121

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<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>30

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuserasnpro

202530

argmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaleuglu

354045

trpleuglyhisilepheserseraspglulyssertyrargleuser

505560

leuargserargleuserileserlysaspthrserlysserglnval

65707580

valleuthrmetthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyr

859095

cysvalargaspserserasntyrglyglytyrpheasptyrtrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>31

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>31

gluvalvalmetthrglnserproalathrleuservalserprogly

151015

gluargalathrleusercysargalaserglnservalileasnasn

202530

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354045

tyrglythrserthrargalathraspileproalaargphesergly

505560

serglyserglythrgluphethrleuthrileserserleuglnser

65707580

gluaspphealavaltyrtyrcysglnasptyrasnasntrpprophe

859095

thrpheglyproglythrlysvalaspilelys

100105

<210>32

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>32

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysproileglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalcysglypheserleuserasnpro

202530

argmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaleuglu

354045

trpleuglyhisilepheserseraspglulyssertyrargleuphe

505560

leuargserargleuserileserlysaspthrserlysserglnval

65707580

valleuthrmetthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyr

859095

cysalaargaspserserasptyrgluglytyrpheasptyrtrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>33

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>33

gluilevalmetthrglnserproalathrleuservalserprogly

151015

gluargthrthrleusercysargalaserglnservalglyserasn

202530

leualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleuile

354045

tyrglyalaserthrargalaserglyvalproalaargphesergly

505560

serglyserglythrgluphethrleuthrileserserleuglnser

65707580

gluaspphealavaltyrsercysglnglutyrasnasntrpprophe

859095

thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys

100105

<210>34

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>34

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysproileglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalcysglypheserleuserasnpro

202530

argmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaleuglu

354045

trpleuglyhisilepheserseraspglulyssertyrargleuphe

505560

leuargserargleuserileserlysaspthrserlysserglnval

65707580

valleuthrmetthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyr

859095

cysalaargaspserserasptyrgluglytyrpheasptyrtrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>35

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>35

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuserasnpro

202530

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354045

trpphealahisilepheserthraspglulyssertyrserproser

505560

leuargglyargleuthrvalserlysaspthrserlysserglnval

65707580

valleuthrleuthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyr

859095

cysalaargaspserserasntyrgluglytyrpheasptyrtrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>36

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>36

lysilevalmetthrglnserproalathrleuservalserprogly

151015

gluargalathrleusercysargalaasnglnilevalserserasn

202530

leualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleuval

354045

pheglythrserthrargalathrglyileproileargphesergly

505560

serglyserglythrgluphethrleuthrvalserserleuglnser

65707580

gluaspphealavaltyrvalcysglnglntyrasnasptrpprophe

859095

thrpheglyproglythrlysvalaspilelys

100105

<210>37

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>37

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly

151015

serleuargleusercysglualaserglyphethrpheseraspala

202530

trpmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

glyargilelysserlysthraspglyglythrthrasptyrvalval

505560

proleuasnglyargpheileileserargaspaspserargasnthr

65707580

leutyrleuglnleuasnasnleulysthrgluaspthralavaltyr

859095

tyrcysthrthrvalproglysertyrglytyrtrpglyglnglythr

100105110

leuvalthrvalserser

115

<210>38

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>38

aspilevalmetthrglnserproleuserleuprovalthrprogly

151015

gluproalaserilesercysargserserglnserleuleuhisasn

202530

lysargasnasntyrleuasptrppheleuglnlysproglyglnser

354045

proglnleuleuiletyrleualaserasnargalaserglyvalpro

505560

aspargpheserglyglyglyserglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnala

859095

glnglnthrproilethrpheglyglnglythrargleugluilelys

100105110

<210>39

<211>120

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>39

gluvalasnleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly

151015

serleuargleusercysglualaserglyphethrphesertyrala

202530

trpmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

glyargilelysserilealaaspglyglyalathrasptyralaala

505560

provalargasnargphethrileserargaspaspserargasnthr

65707580

leutyrleuglumethisserleulysthrgluaspthralavaltyr

859095

tyrcysthrthrileproglyasnaspalapheaspmettrpglygln

100105110

glythrmetvalthrvalserser

115120

<210>40

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>40

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151015

gluproalaserilesercysargserserglnserleuleutyrser

202530

asnglylysasntyrleuasptrppheleuhislysproglyglnser

354045

proglnleuleuiletyrleuglyserasnargalaserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglyileasppheileleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnala

859095

glnglnthrproilethrpheglyglnglythrargleugluilelys

100105110

<210>41

<211>119

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>41

gluvalglnleuvalglusertrpglyvalleuvallysproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglypheilepheasnasnala

202530

trpmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpile

354045

glyargilelysserlysseraspglyglythrthrasptyralaala

505560

provallysaspargphethrileserargaspaspserlysaspthr

65707580

leutyrleuglnmetasnglyleulysthrgluaspthralavaltyr

859095

phecysthrthralaproglyglypropheasptyrtrpglyglngly

100105110

thrleuvalthrvalserser

115

<210>42

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>42

aspilevalleuthrglnserproleuserleuprovalthrprogly

151015

gluproalaserilesercysargserserglnserleuleuhisarg

202530

aspglypheasntyrleuasptrppheleuglnlysproglyglnser

354045

proglnleuleuiletyrleualaserserargalaserglyvalpro

505560

aspargpheserglyseraspserglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnala

859095

leuglnthrproilethrpheglyglnglythrargleugluilelys

100105110

<210>43

<211>120

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>43

gluvalasnleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly

151015

serleuargleusercysglualaserglyphethrphesertyrala

202530

trpmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

glyargilelysserilethraspglyglyvalileasptyralaala

505560

provalargasnargcysthrileserargaspaspserargasnthr

65707580

leutyrleuglumethisserleulysthrgluaspthralavaltyr

859095

tyrcysthrthrileproglyasnaspasppheaspmettrpglygln

100105110

glyargmetvalthrvalserser

115120

<210>44

<211>120

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>44

gluvalasnleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly

151015

serleuargleusercysglualaserglyphethrphesertyrala

202530

trpmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

glyargilelysserileasnaspglyglyalathrasptyralaser

505560

provalargasnargphethrileserargaspaspserargasnmet

65707580

leutyrleuglumethisserleulysthrgluaspthralavaltyr

859095

tyrcysthrthrileproglyasnaspalapheaspmettrpglygln

100105110

glythrleuvalthrvalserser

115120

<210>45

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>45

aspilevalleuthrglnserproleuserleuservalthrprogly

151015

gluproalaserilesercysargserthrglnserleuleutyrser

202530

asnglylysasntyrleuasptrppheleuhislysproglyglnser

354045

proglnleuleuilepheleuglyserileargalaserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglyileasppheileleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnala

859095

glnglnthrproilethrpheglyglnglythrargleugluilelys

100105110

<210>46

<211>119

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>46

gluvalglnleuvalgluserglyglyaspleuvallysproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphethrasnala

202530

trpmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

glyargilelysserlysileaspglyglythrthrasptyralaala

505560

provallysglyargpheileileserargaspaspserlysasnthr

65707580

leuserleuglnmetasnserleulysthrgluaspthralamettyr

859095

tyrcysthrthralaproglyglypropheasptyrtrpglyglngly

100105110

serleuvalthrvalserser

115

<210>47

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>47

aspilevalleuthrglnserproleuserleuprovalthrprogly

151015

gluproalaserilesercysargserserglnserleuleutyrser

202530

aspargargasntyrleuasptrppheleuglnlysproglyglnser

354045

prohisleuleuiletyrleuglysertyrargalaserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnala

859095

leuglnileproilethrpheglyglnglythrargleugluilelys

100105110

<210>48

<211>126

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>48

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyser

151015

servallysvalsercyslysalaserglyaspthrpheserserasn

202530

alailesertrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet

354045

glyvalileileproilepheglythralaasptyralaglnlysphe

505560

glnglyargvalthrilethralaaspgluserthrserthralatyr

65707580

metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaarghisthrtyrhisglutyralaglyglytyrtyrglyglyala

100105110

metaspprotrpglyglnglythrleuvalthrvalserser

115120125

<210>49

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>49

gluleuglnservalleuthrglnproproseralaserglythrpro

151015

glyglnargvalthrilesercysserglyserserserasnilegly

202530

serasntyrvaltyrtrptyrglnglnleuproglythralaprolys

354045

ileleuiletyrargasnasnglnargproserglyvalproasparg

505560

pheserglyserlysserglythrseralaserleualailesergly

65707580

leuargsergluaspglualaasptyrtyrcysalaalatrpaspasp

859095

asnleuserglytrpvalpheglythrglythrlysleuthrvalleu

100105110

<210>50

<211>123

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>50

gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserasntyr

202530

alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seraspileserglyglyglyglyargthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargalaglyleuleutyrglyglyglyvaltyrprometaspile

100105110

trpglyglnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>51

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>51

aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcysargalaserglnserilesersertyr

202530

leuasntrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile

354045

tyralaalaserserleuglnserglyvalproserargphesergly

505560

serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro

65707580

gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnsertyrserthrproleu

859095

thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys

100105

<210>52

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(100)..(101)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>52

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuleulysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuserasnpro

202530

argmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaleuglu

354045

trpphealahisilepheserthraspglulysserleulysleuser

505560

leuargserargleuthrleuserlysaspthrserlysserglnval

65707580

valleuthrmetthrasnmetalaprovalaspseralathrtyrtyr

859095

cysalaargxaaxaaserasntyrgluglytyrpheaspphetrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>53

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(100)..(101)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>53

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuserasnala

202530

argmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaleuglu

354045

trpleualahisilepheserthraspglulysserileargargser

505560

leuargserargleuthrleuserlysaspthrserlysserglnval

65707580

valleuthrmetthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrphe

859095

cysalaargxaaxaaserasntyrgluglytyrpheasptyrtrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>54

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(100)..(101)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>54

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuserasnala

202530

argmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaleuglu

354045

trpleuglyhisilepheserthraspglulyssertyrserthrser

505560

leuargglyargilethrileserlysaspthrserargglyleuval

65707580

valleuthrleuthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyr

859095

cysalaargxaaxaaserasntyrgluglytyrpheaspphetrpgly

100105110

proglypheleuvalthrvalserser

115120

<210>55

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(100)..(101)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>55

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuasnasnala

202530

argmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaleuglu

354045

trpphealahisilepheserthraspglulysserpheargthrser

505560

leuargserargleuthrleuserlysaspthrserlysserglnval

65707580

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859095

cysalaargxaaxaaserasntyrgluglytyrpheasptyrtrpgly

100105110

glnglyileleuvalthrvalserser

115120

<210>56

<211>122

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(100)..(101)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>56

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuserasnval

202530

argmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaleuglu

354045

trpphealahisilepheserseraspglulysserileargargser

505560

leuargserargleuthrleuserlysaspthrserlysserglnval

65707580

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859095

cysalaargxaaxaaserasntyrgluglytyrpheaspphetrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserserasn

115120

<210>57

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(100)..(101)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>57

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuserasnval

202530

argmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaleuglu

354045

trpphealahisilepheserseraspglulysserileargargser

505560

leuargserargleuthrleuserlysaspthrserlysserglnval

65707580

valleuthrmetthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyr

859095

cysalaargxaaxaaserasntyrgluglytyrpheasptyrtrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>58

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(100)..(101)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>58

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuserasnala

202530

argmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaleuglu

354045

trpleualahisilepheserthraspglulysserileargargser

505560

leuargserargleuthrleuserlysaspthrserlysserglnval

65707580

valleuilemetthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyr

859095

cysalaargxaaxaaserasntyrgluglytyrpheasptyrtrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>59

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(100)..(101)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>59

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuserasnala

202530

argmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaleuglu

354045

trpleualahisilepheserthraspglulysserileargargser

505560

leuargserargleuthrleuserlysaspthrserlysserglnval

65707580

valleuthrmetthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyr

859095

cysalaargxaaxaaserasntyrgluglytyrpheasptyrtrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>60

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(100)..(101)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>60

glnvalthrleuglugluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuserasnala

202530

argmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaproglu

354045

trpphealahisilepheserthraspglulysserleuargleuser

505560

leuargserargleuthrleuserlysaspthrserlysserglnval

65707580

valleuthrmetthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyr

859095

cysalaargxaaxaaserasntyrgluglytyrpheasptyrtrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>61

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(100)..(101)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>61

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuserasnala

202530

lysmetglyvalsertrpileargglnproproglylysalaleuglu

354045

trpleualahisilepheserthraspglulysserileargargser

505560

leuargserargleuthrmetserlysaspthrserlysserglnval

65707580

valleuthrmetthrasnmetaspprovalaspthralathrtyrtyr

859095

cysvalargxaaxaaserasntyrgluglytyrpheasptyrtrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>62

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>62

thrasptyrthrleuhis

15

<210>63

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>63

glytyrthrphethrasp

15

<210>64

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>64

glytyrthrphethrasptyrthrleuhis

1510

<210>65

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>65

glyileaspproileasnglyglythrthrtyrasnglnlysphelys

151015

gly

<210>66

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>66

glyileaspproileasnglyglythrthrtyr

1510

<210>67

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>67

glyglualametaspser

15

<210>68

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>68

glyileasnproileasnglyglythrthrtyrasnglnlysphelys

151015

gly

<210>69

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>69

glyileasnproileasnglyglythrthrtyr

1510

<210>70

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>70

glyiletrpproilethrglyglythrthrtyrasnglnlysphelys

151015

gly

<210>71

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>71

glyiletrpproilethrglyglythrthrtyr

1510

<210>72

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>72

glyiletrpproilethrglyglythrthrtyr

1510

<210>73

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>73

glyglualaglnglyser

15

<210>74

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>74

serasnproargmetglyvalser

15

<210>75

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>75

glypheserleuserasnproarg

15

<210>76

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>76

glypheserleuserasnproargmetglyvalser

1510

<210>77

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>77

hisilepheserthraspglulysserleulysleuserleuargser

151015

<210>78

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>78

hisilepheserthraspglulysserleu

1510

<210>79

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>79

aspserserasntyrgluglytyrpheaspphe

1510

<210>80

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>80

serasnalaargmetglyvalser

15

<210>81

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>81

glypheserleuserasnalaarg

15

<210>82

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>82

glypheserleuserasnalaargmetglyvalser

1510

<210>83

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>83

hisilepheserthraspglulysserileargargserleuargser

151015

<210>84

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>84

hisilepheserthraspglulysserile

1510

<210>85

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>85

aspserserasntyrgluglytyrpheasptyr

1510

<210>86

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>86

hisilepheserthraspglulyssertyrserthrserleuarggly

151015

<210>87

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>87

hisilepheserthraspglulyssertyr

1510

<210>88

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>88

asnasnalaargmetglyvalser

15

<210>89

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>89

glypheserleuasnasnalaarg

15

<210>90

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>90

glypheserleuasnasnalaargmetglyvalser

1510

<210>91

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>91

hisilepheserthraspglulysserpheargthrserleuargser

151015

<210>92

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>92

hisilepheserthraspglulysserphe

1510

<210>93

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>93

serasnvalargmetglyvalser

15

<210>94

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>94

glypheserleuserasnvalarg

15

<210>95

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>95

glypheserleuserasnvalargmetglyvalser

1510

<210>96

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>96

hisilepheserseraspglulysserileargargserleuargser

151015

<210>97

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>97

hisilepheserseraspglulysserile

1510

<210>98

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>98

hisilepheserthraspglulysserleuargleuserleuargser

151015

<210>99

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>99

serasnalalysmetglyvalser

15

<210>100

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>100

glypheserleuserasnalalys

15

<210>101

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>101

glypheserleuserasnalalysmetglyvalser

1510

<210>102

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>102

hisilepheserseraspglulyssertyrargleuserleuargser

151015

<210>103

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>103

hisilepheserseraspglulyssertyr

1510

<210>104

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>104

aspserserasntyrglyglytyrpheasptyr

1510

<210>105

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>105

hisilepheserseraspglulyssertyrargleupheleuargser

151015

<210>106

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>106

hisilepheserthraspglulyssertyrserproserleuarggly

151015

<210>107

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>107

aspserserasptyrgluglytyrpheasptyr

1510

<210>108

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>108

aspserserasntyrgluglutyrpheasptyr

1510

<210>109

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>109

seraspalatrpmetser

15

<210>110

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>110

glyphethrpheserasp

15

<210>111

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>111

glyphethrpheseraspalatrpmetser

1510

<210>112

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>112

argilelysserlysthraspglyglythrthrasptyrvalvalpro

151015

leuasngly

<210>113

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>113

argilelysserlysthraspglyglythrthrasptyr

1510

<210>114

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>114

valproglysertyrglytyr

15

<210>115

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>115

sertyralatrpmetser

15

<210>116

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>116

glyphethrphesertyr

15

<210>117

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>117

glyphethrphesertyralatrpmetser

1510

<210>118

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>118

argilelysserilealaaspglyglyalathrasptyralaalapro

151015

valargasn

<210>119

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>119

argilelysserilealaaspglyglyalathrasptyr

1510

<210>120

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>120

ileproglyasnaspalapheaspmet

15

<210>121

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>121

asnasnalatrpmetser

15

<210>122

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>122

glypheilepheasnasn

15

<210>123

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>123

glypheilepheasnasnalatrpmetser

1510

<210>124

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>124

argilelysserlysseraspglyglythrthrasptyralaalapro

151015

vallysasp

<210>125

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>125

argilelysserlysseraspglyglythrthrasptyr

1510

<210>126

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>126

alaproglyglypropheasptyr

15

<210>127

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>127

argilelysserilethraspglyglyvalileasptyralaalapro

151015

valargasn

<210>128

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>128

argilelysserilethraspglyglyvalileasptyr

1510

<210>129

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>129

ileproglyasnaspasppheaspmet

15

<210>130

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>130

argilelysserileasnaspglyglyalathrasptyralaserpro

151015

valargasn

<210>131

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>131

argilelysserileasnaspglyglyalathrasptyr

1510

<210>132

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>132

thrasnalatrpmetser

15

<210>133

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>133

glyphethrphethrasn

15

<210>134

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>134

glyphethrphethrasnalatrpmetser

1510

<210>135

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>135

argilelysserlysileaspglyglythrthrasptyralaalapro

151015

vallysgly

<210>136

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>136

argilelysserlysileaspglyglythrthrasptyr

1510

<210>137

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>137

serserasnalaileser

15

<210>138

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>138

glyaspthrpheserser

15

<210>139

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>139

glyaspthrpheserserasnalaileser

1510

<210>140

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>140

valileileproilepheglythralaasptyralaglnlysphegln

151015

gly

<210>141

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>141

valileileproilepheglythralaasptyr

1510

<210>142

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>142

histhrtyrhisglutyralaglyglytyrtyrglyglyalametasp

151015

pro

<210>143

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>143

serasntyralametser

15

<210>144

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>144

glyphethrpheserasn

15

<210>145

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>145

glyphethrpheserasntyralametser

1510

<210>146

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>146

aspileserglyglyglyglyargthrtyrtyralaaspservallys

151015

gly

<210>147

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>147

aspileserglyglyglyglyargthrtyrtyr

1510

<210>148

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>148

alaglyleuleutyrglyglyglyvaltyrprometaspile

1510

<210>149

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>149

lysserserglnserleuleutyrserasnglylysthrtyrleuasn

151015

<210>150

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>150

leuvalserlysleuaspser

15

<210>151

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>151

valglnaspthrhispheproleuthr

15

<210>152

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>152

glnvalserlysleuaspser

15

<210>153

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>153

glyglnaspthrhispheproleuthr

15

<210>154

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>154

lysserserglnserleuleutyrserasnasplysthrtyrthrasn

151015

<210>155

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>155

gluvalserlysleuaspval

15

<210>156

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>156

argalaserglnservalargserasnleuala

1510

<210>157

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>157

glyserthrileargalathr

15

<210>158

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>158

glnglntyrserasptrpprophethr

15

<210>159

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>159

argalaserglnservalserserasnpheala

1510

<210>160

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>160

glyalathrthrargalathr

15

<210>161

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>161

glnglntyrlysasptrpprophethr

15

<210>162

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>162

argvalserglnserileglyalaasnleuala

1510

<210>163

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>163

glyalaserthrargalathr

15

<210>164

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>164

glnglntyriletyrtrpprophethr

15

<210>165

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>165

argalaserglnservalserasnasnleuala

1510

<210>166

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>166

argalaserglnservalglyseraspleuala

1510

<210>167

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>167

glnglntyrasnasptrpprophethr

15

<210>168

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>168

argalaserglnasnileglyseraspleuala

1510

<210>169

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>169

argalaserglnservalthrserasnpheala

1510

<210>170

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>170

argalaserglnglyvalserserasnpheala

1510

<210>171

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>171

argalaserglnservalasnargasnleuala

1510

<210>172

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>172

glythrserthrargalathr

15

<210>173

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>173

argalaserglnservalserthrasnpheala

1510

<210>174

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>174

argalaserglnservalasnserasnleuala

1510

<210>175

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>175

glyserserthrargalathr

15

<210>176

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>176

argalaserglnservalileasnasnleuala

1510

<210>177

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>177

glnasptyrasnasntrpprophethr

15

<210>178

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>178

argalaserglnservalglyserasnleuala

1510

<210>179

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>179

glyalaserthrargalasergly

15

<210>180

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>180

glnglutyrasnasntrpprophethr

15

<210>181

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>181

argalaasnglnilevalserserasnleuala

1510

<210>182

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>182

argserserglnserleuleuhisasnlysargasnasntyrleuasp

151015

<210>183

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>183

leualaserasnargalaser

15

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<220>

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metglnalaglnglnthrproilethr

15

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leualaserserargalaser

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leuglyserileargalaser

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glyargthrlysglnhisglyglnpheserleualavalvalserleu

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asnilethrserleuglyleuargserleulysgluileseraspgly

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aspvalileileserglyasnlysasnleucystyralaasnthrile

195200205

asntrplyslysleupheglythrserglyglnlysthrlysileile

210215220

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225230235240

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asnleuleugluglygluproarggluphevalgluasnserglucys

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ileglncyshisproglucysleuproglnalametasnilethrcys

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glyprohiscysvallysthrcysproalaglyvalmetglygluasn

325330335

asnthrleuvaltrplystyralaaspalaglyhisvalcyshisleu

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cyshisproasncysthrtyrglycysthrglyproglyleuglugly

355360365

cysprothrasnglyprolysileproserilealathrglymetval

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glyalaleuleuleuleuleuvalvalalaleuglyileglyleuphe

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metargargarghisilevalarglysargthrleuargargleuleu

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glngluarggluleuvalgluproleuthrproserglyglualapro

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lysvalleuglyserglyalapheglythrvaltyrlysglyleutrp

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ileprogluglyglulysvallysileprovalalailelysgluleu

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485490495

tyrvalmetalaservalaspasnprohisvalcysargleuleugly

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ilecysleuthrserthrvalglnleuilethrglnleumetprophe

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leugluaspargargleuvalhisargaspleualaalaargasnval

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leuvallysthrproglnhisvallysilethrasppheglyleuala

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lysleuleuglyalagluglulysglutyrhisalagluglyglylys

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serserileleuglulysglygluargleuproglnproproilecys

660665670

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<211>121

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<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(100)..(101)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>203

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151015

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leuargserargleuserileserlysaspthrserlysserglnval

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100105110

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<220>

<223>合成的构建体

<220>

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<222>(100)..(101)

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glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalserglypheserleuserasnpro

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trpleuglyhisilepheserseraspglulyssertyrargleuser

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leuargserargleuserileserlysaspthrserlysserglnval

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cysvalargxaaxaaserasntyrglyglytyrpheasptyrtrpgly

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<222>(83)..(83)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(100)..(101)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

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glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

thrleuthrleuthrcysthrvalpheglypheserleuserasnpro

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<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

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<221>misc_feature

<222>(100)..(101)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>206

glnvalthrleulysgluserglyprovalleuvallysprothrglu

151015

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<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(56)..(57)

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<400>207

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly

151015

serleuargleusercysglualaserglyphethrpheseraspala

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leuvalthrvalserser

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<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(56)..(57)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>208

gluvalasnleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly

151015

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trpmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

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glythrmetvalthrvalserser

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<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(56)..(57)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>209

gluvalglnleuvalglusertrpglyvalleuvallysproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglypheilepheasnasnala

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trpmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpile

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100105110

thrleuvalthrvalserser

115

<210>210

<211>120

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(56)..(57)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>210

gluvalasnleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly

151015

serleuargleusercysglualaserglyphethrphesertyrala

202530

trpmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

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glyargmetvalthrvalserser

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<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(33)..(34)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>211

aspilevalleuthrglnserproleuserleuservalthrprogly

151015

gluproalaserilesercysargserserglnserleuleutyrser

202530

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proglnleuleuiletyrleuglyserasnargalaserglyvalpro

505560

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65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnala

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100105110

<210>212

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(33)..(34)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>212

aspilevalleuthrglnserproleuserleuprovalthrprogly

151015

gluproalaserilesercysargserserglnserleuleuhisarg

202530

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354045

proglnleuleuiletyrleualaserserargalaserglyvalpro

505560

aspargpheserglyseraspserglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnala

859095

leuglnthrproilethrpheglyglnglythrargleugluilelys

100105110

<210>213

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(33)..(34)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>213

aspilevalleuthrglnserproleuserleuservalthrprogly

151015

gluproalaserilesercysargserserglnserleuleutyrser

202530

xaaxaalysasntyrleuasptrppheleuhislysproglyglnser

354045

proglnleuleuiletyrleuglyserasnargalaserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglyileasppheileleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnala

859095

glnglnthrproilethrpheglyglnglythrargleugluilelys

100105110

<210>214

<211>120

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(56)..(57)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>214

gluvalasnleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly

151015

serleuargleusercysglualaserglyphethrphesertyrala

202530

trpmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

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505560

provalargasnargphethrileserargaspaspserargasnmet

65707580

leutyrleuglumethisserleulysthrgluaspthralavaltyr

859095

tyrcysthrthrileproglyasnaspalapheaspmettrpglygln

100105110

glythrleuvalthrvalserser

115120

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(33)..(34)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>215

aspilevalleuthrglnserproleuserleuservalthrprogly

151015

gluproalaserilesercysargserthrglnserleuleutyrser

202530

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354045

proglnleuleuilepheleuglyserileargalaserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglyileasppheileleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnala

859095

glnglnthrproilethrpheglyglnglythrargleugluilelys

100105110

<210>216

<211>119

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(56)..(57)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>216

gluvalglnleuvalgluserglyglyaspleuvallysproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphethrasnala

202530

trpmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

glyargilelysserlysilexaaxaaglythrthrasptyralaala

505560

provallysglyargpheileileserargaspaspserlysasnthr

65707580

leuserleuglnmetasnserleulysthrgluaspthralamettyr

859095

tyrcysthrthralaproglyglypropheasptyrtrpglyglngly

100105110

serleuvalthrvalserser

115

<210>217

<211>126

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(114)..(115)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>217

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyser

151015

servallysvalsercyslysalaserglyaspthrpheserserasn

202530

alailesertrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet

354045

glyvalileileproilepheglythralaasptyralaglnlysphe

505560

glnglyargvalthrilethralaaspgluserthrserthralatyr

65707580

metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaarghisthrtyrhisglutyralaglyglytyrtyrglyglyala

100105110

metxaaxaatrpglyglnglythrleuvalthrvalserser

115120125

<210>218

<211>122

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(62)..(63)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>218

gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserasntyr

202530

alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seraspileserglyglyglyglyargthrtyrtyralaxaaxaaval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargalaglyleuleutyrglyglyglyvaltyrprometaspile

100105110

trpglyglnglythrleuvalthrvalser

115120

<210>219

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>219

xaaxaaserasntyrgluglytyrpheaspphe

1510

<210>220

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>220

xaaxaaserasntyrgluglytyrpheasptyr

1510

<210>221

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>221

xaaxaaserasntyrglyglytyrpheasptyr

1510

<210>222

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>222

xaaxaaserasptyrgluglytyrpheasptyr

1510

<210>223

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>223

xaaxaaserasntyrgluglutyrpheasptyr

1510

<210>224

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(8)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>224

argilelysserlysthrxaaxaaglythrthrasptyrvalvalpro

151015

leuasngly

<210>225

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(8)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>225

argilelysserlysthrxaaxaaglythrthrasptyr

1510

<210>226

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(8)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>226

argilelysserilealaxaaxaaglyalathrasptyralaalapro

151015

valargasn

<210>227

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(8)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>227

argilelysserilealaxaaxaaglyalathrasptyr

1510

<210>228

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(8)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>228

argilelysserlysserxaaxaaglythrthrasptyralaalapro

151015

vallysasp

<210>229

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(8)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>229

argilelysserlysserxaaxaaglythrthrasptyr

1510

<210>230

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(8)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>230

argilelysserilethrxaaxaaglyvalileasptyralaalapro

151015

valargasn

<210>231

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(8)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>231

argilelysserilethrxaaxaaglyvalileasptyr

1510

<210>232

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(8)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>232

argilelysserileasnxaaxaaglyalathrasptyralaserpro

151015

valargasn

<210>233

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(8)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>233

argilelysserileasnxaaxaaglyalathrasptyr

1510

<210>234

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(8)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>234

argilelysserlysilexaaxaaglythrthrasptyralaalapro

151015

vallysgly

<210>235

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(8)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>235

argilelysserlysilexaaxaaglythrthrasptyr

1510

<210>236

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(16)..(17)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>236

histhrtyrhisglutyralaglyglytyrtyrglyglyalametxaa

151015

xaa

<210>237

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)..(14)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>237

aspileserglyglyglyglyargthrtyrtyralaxaaxaavallys

151015

gly

<210>238

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(11)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>238

argserserglnserleuleutyrserxaaxaalysasntyrleuasp

151015

<210>239

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(11)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>239

argserserglnserleuleuhisargxaaxaapheasntyrleuasp

151015

<210>240

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>240

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserasptyr

202530

tyrmetthrtrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

alapheileargasnargalaargglytyrthrserasphisasnpro

505560

servallysglyargphethrileserargaspasnalalysasnser

65707580

leutyrleuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyr

859095

tyrcysalaargaspargprosertyrtyrvalleuasptyrtrpgly

100105110

glnglythrthrvalthrvalserser

115120

<210>241

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>241

aspilevalmetthrglnserproaspserleualavalserleugly

151015

gluargalathrileasncyslysserserglnserleupheasnval

202530

argserarglysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglygln

354045

proprolysleuleuilesertrpalaserthrarggluserglyval

505560

proaspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuglnalagluaspvalalavaltyrtyrcyslysgln

859095

sertyraspleuphethrpheglyserglythrlysleugluilelys

100105110

<210>242

<211>363

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>242

gaagtccaacttgtcgaatcgggaggaggccttgtgcaacccggtggatccctgaggctg60

tcatgcgcggcctcgggcttcaccttttccgattactacatgacctgggtcagacaggcc120

cctggaaaggggttggaatgggtggcattcatccggaatagagcccgcggatacacttcc180

gaccacaaccccagcgtgaaggggcggttcaccattagccgcgacaacgccaagaactcc240

ctctacctccaaatgaacagcctgcgggcggaggataccgctgtgtactactgcgcccgc300

gaccggccgtcctactatgtgctggactactggggccagggtactacggtcaccgtctcc360

tca363

<210>243

<211>336

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>243

gacattgtgatgactcaatcccccgactccctggctgtgtccctcggcgaacgcgcaact60

atcaactgtaaaagcagccagtccctgttcaacgtccggtcgaggaagaactacctggcc120

tggtatcagcagaaacctgggcagccgccgaagcttctgatctcatgggcctcaactcgg180

gaaagcggagtgccagatagattctccggatctggctccggaaccgacttcaccctgacg240

atttcgagcttgcaagcggaggatgtggccgtgtactactgcaagcagtcctacgacctc300

ttcacctttggttcgggcaccaagctggagatcaaa336

<210>244

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>244

serasptyrtyrmetthr

15

<210>245

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>245

glyphethrpheserasptyrtyrmetthr

1510

<210>246

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>246

pheileargasnargalaargglytyrthrserasphis

1510

<210>247

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>247

pheileargasnargalaargglytyrthrserasphisasnproser

151015

vallysgly

<210>248

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>248

aspargprosertyrtyrvalleuasptyr

1510

<210>249

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>249

lysserserglnserleupheasnvalargserarglysasntyrleu

151015

ala

<210>250

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>250

trpalaserthrarggluser

15

<210>251

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>251

lysglnsertyraspleuphethr

15

<210>252

<211>326

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>252

alaserthrlysglyproservalpheproleualaprocysserarg

151015

serthrsergluserthralaalaleuglycysleuvallysasptyr

202530

pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser

354045

glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser

505560

leuserservalvalthrvalproserserasnpheglythrglnthr

65707580

tyrthrcysasnvalasphislysproserasnthrlysvalasplys

859095

thrvalgluarglyscysargvalargcysproargcysproalapro

100105110

provalalaglyproservalpheleupheproprolysprolysasp

115120125

thrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalala

130135140

valserhisgluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalaspgly

145150155160

valgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglnpheasn

165170175

serthrpheargvalvalservalleuthrvalvalhisglnasptrp

180185190

leuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysglyleupro

195200205

serserileglulysthrileserlysthrlysglyglnproargglu

210215220

proglnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthrlysasn

225230235240

glnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspile

245250255

alavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthr

260265270

thrproprometleuaspseraspglyserphepheleutyrserarg

275280285

leuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercys

290295300

servalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleu

305310315320

serleuserproglylys

325

<210>253

<211>978

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>253

gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgag60

agcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg120

tggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca180

ggactctactccctcagcagcgtagtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacc240

tacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgc300

aaatgtcgtgtcaggtgcccaaggtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttc360

ctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgc420

gtggtggtggccgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggc480

gtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgt540

gtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgc600

aaggtctccaacaaaggcctcccatcctccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggg660

cagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaac720

caggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgg780

gagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgac840

ggctccttcttcctctacagcaggctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaac900

gtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctc960

tccctgtctccgggtaaa978

<210>254

<211>326

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>254

alaserthrlysglyproservalpheproleualaprocysserarg

151015

serthrsergluserthralaalaleuglycysleuvallysasptyr

202530

pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser

354045

glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser

505560

leuserservalvalthrvalproserserasnpheglythrglnthr

65707580

tyrthrcysasnvalasphislysproserasnthrlysvalasplys

859095

thrvalgluarglyscysgluvalglucysproglucysproalapro

100105110

provalalaglyproservalpheleupheproprolysprolysasp

115120125

thrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalala

130135140

valserhisgluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalaspgly

145150155160

valgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglnpheasn

165170175

serthrpheargvalvalservalleuthrvalvalhisglnasptrp

180185190

leuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysglyleupro

195200205

serserileglulysthrileserlysthrlysglyglnproargglu

210215220

proglnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthrlysasn

225230235240

glnvalserleuthrcysgluvallysglyphetyrproseraspile

245250255

alavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthr

260265270

thrproprometleuaspseraspglyserphepheleutyrserlys

275280285

leuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercys

290295300

servalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleu

305310315320

serleuserproglylys

325

<210>255

<211>978

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>255

gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgag60

agcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg120

tggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca180

ggactctactccctcagcagcgtagtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacc240

tacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgc300

aaatgtgaggtcgagtgcccagagtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttc360

ctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgc420

gtggtggtggccgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggc480

gtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgt540

gtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgc600

aaggtctccaacaaaggcctcccatcctccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggg660

cagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaac720

caggtcagcctgacctgcgaggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgg780

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ggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaac900

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