本发明涉及微生物学领域,特别是涉及生物合成途径工程化改造领域。更具体来说,本发明涉及使用遗传修饰的细菌生产八氢番茄红素的领域。
背景技术:
类胡萝卜素是一类由所有光合生物体以及在某些异养生长的细菌和真菌中合成的天然色素。由于动物不能从头合成合成这些分子,因此类胡萝卜素在商业上已被广泛用作食品增补剂、动物饲料添加剂或营养保健品。也已发现它们作为着色剂或用于美容和制药用途的各种不同应用。
尽管有色的类胡萝卜素被研究得最为广泛,但无色的类胡萝卜素例如八氢番茄红素和六氢番茄红素已显示出相似的有效和有益活性。这些类胡萝卜素存在于大多数水果和蔬菜中,并且可以充当uv吸收剂、抗氧化剂和抗炎剂。因此,发现它们在化妆品、营养品和治疗剂,特别是在皮肤障碍的治疗中是有用的。
八氢番茄红素(7,8,11,12,7’,8’,11’,12’-八氢-ψ,ψ-胡萝卜素)是类胡萝卜素生物合成途径中的第一种类胡萝卜素,并通过20个碳原子的前体——香叶基香叶基焦磷酸(ggpp)的二聚化产生。这个反应由酶——八氢番茄红素合酶催化。作为前体,八氢番茄红素随后去饱和,相继形成六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素和最终的番茄红素。
由于它们是所有其他类胡萝卜素的前体,六氢番茄红素和八氢番茄红素已在应对这些化合物的生物合成的调查中被广泛研究。然而,它们在其他类型的研究中被极大忽略。因此,到目前为止,当前没有方法可用于通过任何生物过程生产八氢番茄红素,特别是用于生产不含六氢番茄红素的八氢番茄红素。
技术实现要素:
本发明涉及一种重组奇异球菌属(deinococcus)细菌,其被遗传修饰成生产并积累大量(substantialamount)的八氢番茄红素,优选地不含六氢番茄红素,还涉及所述重组细菌用于生产八氢番茄红素的用途。
因此,第一方面,本发明涉及一种生产八氢番茄红素的方法,所述方法包括将重组奇异球菌属细菌在适合于生产八氢番茄红素的条件下培养,并任选地回收所述八氢番茄红素,其中所述重组奇异球菌属细菌被遗传修饰成表现出提高的八氢番茄红素合酶活性和降低的八氢番茄红素去饱和酶活性。
优选地,所述重组奇异球菌属细菌不表现出任何八氢番茄红素去饱和酶活性。可以通过失活编码八氢番茄红素去饱和酶的基因,优选地通过缺失所述基因的全部或一部分或引入无义密码子、表达盒、基因或引起移码的突变,对所述重组奇异球菌属细菌进行遗传修饰。优选地,通过缺失编码八氢番茄红素去饱和酶的基因的全部或一部分,对所述重组奇异球菌属细菌进行遗传修饰。
所述重组奇异球菌属细菌也可以被遗传修饰成过表达编码八氢番茄红素合酶的本源基因、表达编码八氢番茄红素合酶的异源基因、表达编码八氢番茄红素合酶并包含提高所编码的酶的八氢番茄红素合酶活性的突变的本源基因或表达编码抗反馈抑制(feedbackresistant)的八氢番茄红素合酶的基因。
在某些实施方式中,所述重组奇异球菌属细菌还可以表现出提高的fpp合酶活性、提高的dxp合酶和/或ipp异构酶活性,优选为提高的fpp合酶、dxp合酶和ipp异构酶活性。
优选地,所述重组奇异球菌属细菌是选自d.geothermalis、d.murrayi、d.grandis、d.aquaticus、d.indicus、d.cellulosilyticus、d.depolymerans和d.maricopensis的奇异球菌属细菌。更优选地,所述重组奇异球菌属细菌是deinococcusgeothermalis细菌。
所述重组奇异球菌属细菌优选地能够生产至少20mg/gdcw(细胞干重)的八氢番茄红素,特别是当在好氧生活中并在作为碳源的葡萄糖存在下培养时。
优选地,所述重组奇异球菌属细菌只生产八氢番茄红素的一种异构体,即15-顺式八氢番茄红素,并且不生产六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素或番茄红素。
在某些实施方式中,所述重组奇异球菌属细菌是嗜热奇异球菌(deinococcus),优选为d.geothermalis,并且所述重组奇异球菌属细菌在适合于生产八氢番茄红素的条件下的培养在40至50℃之间、优选地45至48℃之间的温度下进行。
第二方面,本发明还涉及在本发明的方法中使用的重组奇异球菌属细菌或其细胞提取物,优选为包含细胞膜的级分。优选地,所述细胞提取物包含八氢番茄红素并且不包含任何可检测量的六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素或番茄红素。优选地,本发明的细胞提取物只包含八氢番茄红素的一种异构体,即15-顺式八氢番茄红素。
另一方面,本发明还涉及本发明的重组奇异球菌属细菌用于生产八氢番茄红素的用途。
另一方面,本发明还涉及一种组合物,其包含通过本发明的方法获得的八氢番茄红素,优选地仅为15-顺式八氢番茄红素,其中所述组合物不包含任何可检测量的六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素或番茄红素。优选地,所述组合物是美容、药物或营养保健、营养美容组合物或者食品或饲料添加剂
发明详述
奇异球菌属细菌是非病原细菌,在1956年由anderson和合作者首次分离。这种极端生物体已被提出用于使用生物质的工业过程或反应中(参见例如wo2009/063079、wo2010/094665或wo2010/081899)。在关于奇异球菌代谢和遗传学的坚实知识的基础上,本发明人发现奇异球菌属细菌可以被遗传修饰成在与大规模生产相容的条件下生产大量的八氢番茄红素。此外,他们显示这种重组细菌能够生产八氢番茄红素而不含六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素或番茄红素,从而抑制了对进一步纯化步骤的需求。
定义
在本发明的上下文中,术语“奇异球菌”包括奇异球菌属的野生型或天然变体菌株,例如通过加速进化、诱变、通过dna穿梭技术获得的菌株或通过插入真核、原核和/或合成的核酸而获得的重组菌株。奇异球菌属细菌可以是指奇异球菌属的任何细菌,例如但不限于d.actinosclerus、d.aerius、d.aerolatus、d.aerophilus、d.aetherius、d.alpinitundrae、d.altitudinis、d.antarcticus、d.apachensis、d.aquaticus、d.aquaticus、d.aquatilis、d.aquiradiocola、d.caeni、d.carri、d.cellulosilyticus、d.citri、d.claudionis、d.daejeonensis、d.depolymerans、d.desertii、d.enclensis、d.ficus、d.frigens、d.geothermalis、d.gobiensis、d.grandis、d.guangriensis、d.guilhemensis、d.hohokamensis、d.hopiensis、d.humi、d.indicus、d.maricopensis、d.marmoris、d.metalli、d.metallilatus、d.misasensis、d.murrayi、d.navajonensis、d.papagonensis、d.peraridilitoris、d.phoenicis、d.pimensis、d.piscis、d.proteolyticus、d.puniceus、d.radiodurans、d.radiomollis、d.radiophilus、d.radiopugnans、d.radioresistens、d.radiotolerans、d.reticulitermitis、d.roseus、d.sahariens、d.saxicola、d.soli、d.sonorensis、d.swuensis、d.wulumuqiensis、d.xinjiangensis、d.xibeiensis和d.yavapaiensis细菌或其任何组合。优选地,术语“奇异球菌”是指d.geothermalis、d.murrayi、d.grandis、d.aquaticus、d.indicus、d.cellulosilyticus、d.depolymerans或d.maricopensis。更优选地,术语“奇异球菌”是指d.geothermalis、d.murrayi或d.maricopensis。甚至更优选地,术语“奇异球菌”是指d.geothermalis。
术语“重组细菌”和“遗传修饰的细菌”或“工程化改造的细菌”在本文中可互换使用,并且是指在自然界中不存在并且作为一个或几个遗传元件的缺失、插入或修饰的结果而含有修饰的基因组的细菌。
“重组核酸”是指已被工程化改造并且不原样存在于野生型细菌中的核酸。在某些特定实施方式中,该术语可以是指可操作地连接到与其天然存在的启动子不同的启动子的基因。
术语“基因”是指编码蛋白质的任何核酸。术语基因涵盖dna例如cdna或gdna以及rna。基因可以首先通过例如重组、酶和/或化学技术来制备,并随后在宿主细胞或体外系统中复制。基因通常包含编码所需蛋白质的开放阅读框。基因可以含有其他序列例如转录终止子或信号肽。
术语“可操作地连接”意味着其中将控制序列放置在相对于编码序列的适合位置处使得所述控制序列指导所述编码序列的表达的构造。
术语“控制序列”意味着基因的表达所必需的核酸序列。控制序列可以是本源或异源的。公知的和本领域技术人员目前使用的控制序列将是优选的。这些控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。优选地,所述控制序列包括启动子和转录终止子。
术语“表达盒”是指包含编码区即基因以及调控区即包含可操作地连接的一个或多个控制序列的核酸构建物。优选地,所述控制序列适合于奇异球菌宿主细胞。
当在本文中使用时,术语“表达载体”意味着包含表达盒的dna或rna分子。优选地,所述表达载体是线性或环状双链dna分子。
当在本文中使用时,术语“本源的”或“内源的”对于细菌来说,是指天然存在于所述细菌中的遗传元件或蛋白质。术语“异源的”对于细菌来说,是指不天然存在于所述细菌中的遗传元件或蛋白质。
当在本文中使用时,术语“过表达”和“提高的表达”可互换使用,并且意味着与未修饰的细菌例如野生型细菌或尚未被遗传修饰以便生产八氢番茄红素的相应细菌相比,基因或酶的表达提高。酶的提高的表达通常通过提高编码所述酶的基因的表达来获得。在其中基因或酶不天然存在于本发明的细菌中,即异源基因或酶的实施方式中,术语“过表达”和“表达”可以互换使用。为了提高基因的表达,专业技术人员可以使用任何已知的技术,例如提高所述细菌中所述基因的拷贝数,使用引起所述基因的高水平表达的启动子即强启动子,使用使相应的信使rna稳定的元件或修饰核糖体结合位点(rbs)序列和它们周围的序列。具体来说,所述过表达可以通过提高所述细菌中所述基因的拷贝数来获得。可以通过本领域专业人员已知的重组方法,包括基因置换或is序列中的多拷贝插入(参见例如国际专利申请wo2015/092013),将所述基因的一个或几个拷贝引入到基因组中。优选地,将包含优选地置于强启动子控制之下的基因的表达盒整合到基因组中。可选地,所述基因可以被表达载体、优选地质粒携带,所述表达载体包含具有优选地置于强启动子控制之下的感兴趣的基因的表达盒。取决于复制起点的性质,所述表达载体可以以一个或几个拷贝存在于所述细菌中。所述基因的过表达也可以使用引起所述基因的高水平表达的启动子来获得。例如,可以将内源基因的启动子用更强的启动子即引起更高表达水平的启动子替换。适合于在本发明中使用的启动子为专业技术人员所知,并且可以是组成型或诱导型的,本源或异源的。
当在本文中使用时,术语“提高的活性”是指与未修饰的细菌例如野生型细菌或尚未被遗传修饰以便生产或积累八氢番茄红素的相应细菌相比,提高的酶活性。这种提高可以例如通过本源基因的过表达或异源基因的表达来获得。
当在本文中使用时,术语“降低的活性”是指与未修饰的细菌例如野生型细菌或尚未被遗传修饰以便生产或积累八氢番茄红素的相应细菌相比,降低的酶活性。这种降低可以例如通过失活编码负责这种活性的酶的基因来获得。
当在本文中使用时,术语“序列同一性”或“同一性”是指在来自于两个多肽序列的比对的位置中匹配(一致的氨基酸残基)的数目(%)。序列同一性通过在对齐以便使重叠和同一性最大化并同时使序列间隙最小化时对序列进行比较来确定。具体来说,根据两个序列的长度,可以使用大量数学全局或局部比对算法中的任一者来确定序列同一性。长度相近的序列优选地使用将序列在整个长度上最佳地比对的全局比对算法(例如needleman和wunsch算法,needleman和wunsch,1970)来比对,而长度基本上不同的序列优选地使用局部比对算法(例如smith和waterman算法(smith和waterman,1981)或altschul算法(altschul等,1997;altschul等,2005))来比对。用于确定氨基酸序列同一性百分数目的的比对可以以本领域技术范围之内的各种不同方式来实现,例如使用可以在因特网网站例如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/tools/emboss/上获得的可公开获得的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于计算比对的适合的参数,包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。出于本文的目的,氨基酸序列同一性的百分数值是指使用成对序列比对程序embossneedle产生的值,所述程序使用needleman-wunsch算法产生两个序列的最佳全局比对,其中所有搜索参数被设定到默认值,即评分矩阵=blosum62,间隙开口=10,间隙延长=0.5,末端间隙罚分=虚假,末端间隙开口=10和末端间隙延长=0.5
术语“低严紧性”、“中严紧性”、“中/高严紧性”、“高严紧性”和“非常高严紧性”是指杂交条件。用于确定核苷酸探针与同源dna或rna序列之间的杂交的适合的实验条件包括将含有待杂交的dna片段或rna的滤膜在5×ssc(氯化钠/柠檬酸钠)中预浸泡10min,将所述滤膜在5×ssc、5×denhardt's溶液、0.5%sds和100μg/ml超声处理的变性鲑鱼精子dna的溶液中预杂交,然后在含有浓度为10ng/ml的随机引发的32p-dctp标记的(比活性>1×109cpm/μg)探针的相同溶液中在约45℃下杂交12小时(feinberg和vogelstein,1983)。对于各种不同的严紧性条件来说,然后将所述滤膜在2×ssc、0.5%sds中和至少55℃(低严紧性)、更优选地至少60℃(中严紧性)、更优选地至少65℃(中/高严紧性)、甚至更优选地至少70℃(高严紧性)、甚至更优选地至少75℃(非常高严紧性)下进行两次30分钟的洗涤。
当在本说明书中使用时,术语“约”是指所指定值的值±10%的范围。例如,“约20”包括20的±10%或18至22。优选地,术语“约”是指所指定值的值±5%的范围。
当在本文中使用时,术语“crtb”或“八氢番茄红素合酶”是指由crtb基因编码的八氢番茄红素合酶(ec2.5.1.32),所述酶催化两分子的香叶基香叶基二磷酸(ggpp)缩合以产生八氢番茄红素。
术语“crti”或“八氢番茄红素去饱和酶”或“八氢番茄红素脱氢酶”是指由crti基因编码的八氢番茄红素去饱和酶(ec1.3.99.31),所述酶催化多达4个去饱和步骤(ec1.3.99.28[八氢番茄红素去饱和酶(链孢红素形成)]、ec1.3.99.29[八氢番茄红素去饱和酶(ζ-胡萝卜素形成)]和ec1.3.99.30[八氢番茄红素去饱和酶(3,4-二脱氢番茄红素形成)])。在优选实施方式中,所述八氢番茄红素去饱和酶将八氢番茄红素通过六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素中间体转变成链孢红素和番茄红素。
根据生物体,上面鉴定的酶和编码基因的命名可以改变。然而,出于清楚的目的,在本说明书中,这些术语独立于所述酶或基因的起源来使用。
当在本文中使用时,术语“八氢番茄红素”是指任何八氢番茄红素异构体,优选是指15-顺式八氢番茄红素。
第一方面,本发明涉及一种重组奇异球菌属细菌,其被遗传修饰成表现出提高的八氢番茄红素合酶活性和降低的八氢番茄红素去饱和酶活性。本发明人确实显示这些细菌可以生产和积累大量的八氢番茄红素,不含六氢番茄红素,并且不改变所述细菌的生存力或生长。
本发明的重组奇异球菌属细菌是已被遗传修饰以便提高其八氢番茄红素的生产和积累的奇异球菌属细菌。与野生型细菌相比,这种重组细菌可以包含如上所述的修饰,但是也可以包含不与八氢番茄红素的生产直接相关但提供八氢番茄红素的工业生产优势例如抗生素抗性或扩大底物范围的酶活性的其他修饰。
在本发明的重组奇异球菌属细菌中,与未修饰的细菌相比八氢番茄红素合酶活性提高。
所述八氢番茄红素合酶活性可以通过专业技术人员已知的任何方法来确定。例如,所述活性可以如下进行评估:将八氢番茄红素合酶与ggpp温育,回收八氢番茄红素,并通过液体闪烁计数对所述八氢番茄红素进行定量(参见例如welsch等,theplantcell,vol.22:3348-3356,2010)。
优选地,通过将所述奇异球菌属细菌遗传修饰成过表达内源crtb基因、表达异源crtb基因和/或表达所述内源八氢番茄红素合酶的改进的变体来获得提高的八氢番茄红素合酶活性。
具体来说,本发明的重组奇异球菌属细菌可以包含编码表现出八氢番茄红素合酶活性的多肽的异源核酸,和/或可以过表达编码表现出八氢番茄红素合酶活性的多肽的内源核酸。
为了提高基因的表达(即过表达基因),专业技术人员可以使用任何已知的技术,例如提高所述细菌中所述基因的拷贝数,使用引起所述基因的高水平表达的启动子即强启动子,使用使相应的信使rna稳定的元件,或修饰核糖体结合位点(rbs)序列和它们周围的序列。
在特定实施方式中,通过提高所述细菌中所述基因的拷贝数来获得所述过表达。可以通过本领域专业人员已知的重组方法,包括基因置换,将所述基因的一个或几个拷贝引入到基因组中。优选地,将包含所述基因的表达盒整合到基因组中。
可选地,所述基因可以被表达载体、优选地质粒携带,所述表达载体包含具有感兴趣的基因的表达盒。取决于复制起点的性质,所述表达载体可以以1至5、20、100或500个拷贝存在于所述细菌中。
在另一个特定实施方式中,使用引起所述基因的高水平表达的启动子来获得所述基因的过表达。例如,可以将内源基因的启动子用更强的启动子即引起更高表达水平的启动子替换。适合于在本发明中使用的启动子为专业技术人员所知,并且可以是组成型或诱导型的,本源或异源的。
在本发明中有用的表达盒至少包含可操作地连接到一个或多个控制序列的crtb基因,所述控制序列通常包含转录启动子和转录终止子,其指导所述基因的表达。
控制序列可以包括被宿主细胞识别的启动子。所述启动子含有介导所述酶的表达的转录控制序列。所述启动子可以是在所述奇异球菌属细菌中显示出转录活性的任何多核苷酸。所述启动子可以是本源或异源启动子。优选的启动子是本源的奇异球菌启动子。就此而言,各种不同的启动子已被研究并用于奇异球菌属细菌中的基因表达。适合的启动子的实例包括来自于翻译延伸因子tu基因tufa(例如d.radiodurans:dr_0309)和tufb(例如d.radiodurans:dr_2050)的ptufa和ptufb启动子,位于pi3中的resu基因的启动子,groesl操纵子的启动子区pgroesl(lecointe等,2004.molmicrobiol53:1721–1730;meima等,2001.jbacteriol183:3169–3175),或这些启动子的衍生物。优选地,所述启动子是强组成型启动子。
控制序列也可以包含转录终止子,其被奇异球菌属细菌识别以终止转录。所述终止子被可操作地连接到所述基因的3'-端。在奇异球菌属细菌中有功能的任何终止子都可用于本发明,例如在lecointe等,2004.molmicrobiol53:1721–1730中描述的终止子term116。
任选地,所述表达盒还可以包含允许容易地选择重组细菌的选择标记。通常,所述选择标记是编码抗生素抗性或提供自养的基因。
在特定实施方式中,本发明的重组奇异球菌属细菌包含表达盒,所述表达盒包含可操作地连接到强组成型启动子的crtb基因。
所述表达盒可以被整合到所述细菌的基因组中,和/或可以以游离体形式维持在表达载体中。
优选地,所述表达盒被整合到所述细菌的基因组中。可以通过本领域专业人员已知的重组方法,包括基因置换,将所述表达盒的一个或几个拷贝引入到基因组中。所述表达盒可以替换内源crtb基因,或者可以在另一个位置整合到基因组中。
也可以将表达盒整合到基因组中以便失活靶基因。在特定实施方式中,将表达盒整合到基因组中以便失活crti基因。在另一个实施方式中,将表达盒整合到基因组中以便失活磷酸转乙酰酶(pta)基因。靶基因可以通过所述表达盒的插入而被替换或失活。
可选地或此外,可以将表达盒整合到基因组中的非编码序列例如插入序列(is)中(参见例如国际专利申请wo2015/092013)。
在其中所述表达盒以游离体形式维持的实施方式中,取决于复制起点的性质,表达载体可以以一个或几个拷贝存在于所述细菌中。
所述奇异球菌宿主细胞可以以瞬时或稳定方式进行转化、转染或转导。本发明的重组奇异球菌属细菌可以通过专业技术人员已知的任何方法例如电穿孔、接合、转导、感受态细胞转化、原生质体转化、原生质体融合、生物弹道“基因枪”转化、peg介导的转化、脂质协助的转化或转染、化学介导的转染、乙酸锂介导的转化或脂质体介导的转化来获得。
术语“重组奇异球菌属细菌”还涵盖遗传修饰的宿主细胞以及与亲代宿主细胞不一致的任何后代,特别是由复制期间发生的突变所造成的。
在本发明的重组细菌中表达或过表达的crtb基因可以编码内源八氢番茄红素合酶、异源八氢番茄红素合酶或所述内源八氢番茄红素合酶的改进的变体。
具体来说,表现出八氢番茄红素合酶活性的多肽可以是任何已知的八氢番茄红素合酶,例如选自已知的细菌、藻类或植物的八氢番茄红素合酶。
所述表现出八氢番茄红素合酶活性的多肽可以选自非奇异球菌的八氢番茄红素合酶例如来自于成团泛菌(pantoeaagglomerans)的crtb(genbank登记号:afz89043.1,seqidno:1)或来自于副球菌(paracoccus)sp_n81106的crtb(genbank登记号:bae47469.1;seqidno:2)。
优选地,所述表现出八氢番茄红素合酶活性的多肽可以选自来自于奇异球菌属细菌的任何八氢番茄红素合酶。
奇异球菌八氢番茄红素合酶(crtb)的实例包括但不限于来自于d.geothermalis(uniprot登记号:q1j109;seqidno:3)、d.actinosclerus(uniprot登记号:a0a0u3kc93;seqidno:4)、d.deserti(uniprot登记号:c1d2z3;seqidno:5)、d.gobiensis(uniprot登记号:h8gyf6;seqidno:6)、d.maricopensis(uniprot登记号:e8uam8;seqidno:7)、d.peraridilitoris(uniprot登记号:l0a567;seqidno:8)、d.puniceus(uniprot登记号:a0a172tde8;seqidno:9)、d.radiodurans(uniprot登记号:q9rw07;seqidno:10)、d.soli(uniprot登记号:a0a0f7jv05;seqidno:11)和d.swuensis(uniprot登记号:a0a0a7kgt0;seqidno:12)的八氢番茄红素合酶。
所述表现出八氢番茄红素合酶活性的多肽也可以是表现出八氢番茄红素合酶活性并与上面列出的任何八氢番茄红素合酶具有至少60%、优选地65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%同一性的任何多肽。
在特定实施方式中,所述表现出八氢番茄红素合酶活性的多肽选自:
a)包含选自seqidno:1至12、优选地选自seqidno:3至12、更优选地seqidno:3的氨基酸序列或由所述氨基酸序列构成的多肽;和
b)表现出八氢番茄红素合酶活性并具有与选自seqidno:1至12的任何序列、优选地与选自seqidno:3至12的任何序列、更优选地与seqidno:3具有至少60%、优选地65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%同一性的氨基酸序列的多肽。
在本发明中使用的crtb基因也可以编码改进的八氢番茄红素合酶,即与野生型酶的氨基酸序列相比在其序列中具有至少一个突变的酶,所述突变导致其活性提高、比催化活性提高、底物特异性提高、蛋白质或rna稳定性提高和/或所述酶的细胞内浓度提高,或产生抗反馈抑制的突变体。
在一个实施方式中,本发明的重组奇异球菌属细菌表达编码改进的八氢番茄红素合酶、特别是改进的奇异球菌八氢番茄红素合酶的crtb基因。优选地,所述改进的奇异球菌八氢番茄红素合酶表现出提高的催化活性。
此外,在本发明的重组奇异球菌属细菌中,与未修饰的细菌相比内源八氢番茄红素去饱和酶活性被降低,优选地该活性被抑制。
所述八氢番茄红素去饱和酶活性可以通过专业技术人员已知的任何方法来确定。例如,所述活性可以如下进行评估:将八氢番茄红素去饱和酶与八氢番茄红素在过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶存在下温育,添加甲醇与koh的混合物并在60℃下加热15min以终止反应,用二乙醚/轻石油从温育混合物中提取产物,蒸发掉溶剂相并将残留物重新溶解在冷丙酮/甲醇中,并通过hplc鉴定产物(参见例如xu等,microbiology,153,1642-1652,2007)。
在优选实施方式中,本发明的重组奇异球菌属细菌不生产显著或可检测量的六氢番茄红素或来自于八氢番茄红素到番茄红素的任何其他中间体分子。
优选地,本发明的重组奇异球菌属细菌被遗传修饰成失活编码八氢番茄红素去饱和酶的基因,即crti基因。这种失活阻止了八氢番茄红素向番茄红素的转化并因此导致八氢番茄红素积累。
所述crti基因可以通过专业技术人员已知的任何方法,例如通过缺失这个基因的全部或一部分,通过引入无义密码子或引起移码的突变,通过插入基因或表达盒例如crtb基因或包含crtb基因的表达盒来失活。
可选地,可以降低所述内源crti基因的表达。这种降低可以例如通过将内源启动子用较弱的启动子例如plexa或pamye启动子替换来获得(meima等,2001.jbacteriol183:3169–3175)。
在优选实施方式中,所述crti基因被失活,优选地通过缺失所述基因的全部或一部分,例如通过基因置换而被失活。
八氢番茄红素去饱和酶的实例包括但不限于d.geothermalis(uniprot登记号:q1j108;seqidno:13)、d.actinosclerus(uniprot登记号:a0a0u4cej5;seqidno:14)、d.deserti(uniprot登记号:c1d2z4;seqidno:15)、d.gobiensis(uniprot登记号:h8gyf5;seqidno:16)、d.maricopensis(uniprot登记号:e8uam7;seqidno:17)、d.peraridilitoris(uniprot登记号:l0a6e5;seqidno:18)、d.proteolyticus(uniprot登记号:f0rj97;seqidno:19)、d.puniceus(uniprot登记号:a0a172tat8;seqidno:20)、d.radiodurans(uniprot登记号:q9rw08;seqidno:21)、d.soli(uniprot登记号:a0a0f7jtt9;seqidno:22)和d.swuensis(uniprot登记号:a0a0a7kjm4;seqidno:23)的八氢番茄红素去饱和酶。
可以使用常规方法,例如基于与编码上面鉴定的任何八氢番茄红素去饱和酶的核酸的同源性,容易地鉴定在本发明的重组奇异球菌属细菌中编码八氢番茄红素去饱和酶的基因。
为了增强八氢番茄红素的生产,本发明的重组细菌还可以被遗传修饰以便提高香叶基香叶基二磷酸(ggpp)的生产。
具体来说,本发明的重组细菌可以被遗传修饰成提高通往异戊烯焦磷酸(ipp)和二甲基烯丙基焦磷酸(dmapp)的碳通量和/或提高ipp和dmapp向香叶基香叶基二磷酸(ggpp)的转化。
通往ipp和dmapp的碳通量可以通过增强2-c-甲基-d-赤藓糖醇4-磷酸/1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸(mep/dxp)途径来提高。当在本文中使用时,术语“mep途径”或“mep/dxp途径”是指从丙酮酸和d-甘油醛3-磷酸缩合成1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸(dxp)开始的导致ipp和dmapp形成的生物合成途径。该途径涉及下述酶:1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸合酶(ec2.2.1.7),1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸还原异构酶(ec1.1.1.267),2-c-甲基-d-赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶(ec2.7.7.60),4-二磷酸胞苷基-2-c-甲基-d-赤藓糖醇激酶(ec2.7.1.148),2-c-甲基-d-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(ec4.6.1.12),4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶(ec1.17.7.1),4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(ec1.17.1.2)和异戊烯二磷酸δ-异构酶(ec5.3.3.2)。
这个途径可以通过专业技术人员已知的任何方法,例如通过专利申请wo2015/189428中描述的方法来增强。具体来说,这个途径可以通过提高选自dxp合酶(dxs)、dxp还原异构酶(dxr)、ispd、ispe、ispf、ispg、isph和ipp异构酶活性(idi)的至少一种酶活性,优选地通过至少提高dxp合酶和ipp异构酶活性来增强。
酶活性(例如dxs、dxr、ispd、ispe、ispf、ispg、isph、idi或fpps活性)可以如上文为八氢番茄红素合酶活性所详述的来提高,即通过过表达内源基因或表达异源基因,和/或表达内源基因的改进的变体。
术语“dxs”或“dxp合酶”是指由dxs基因编码的酶1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸合酶(ec2.2.1.7),其催化丙酮酸和d-甘油醛3-磷酸缩合成1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸(dxp)。基因产物的名称“dxp合酶”、“dxs”或“dxps”在本申请中可互换使用。所述dxp合酶活性可以使用如lois等(1998)所述的放射性标记的底物或专业技术人员已知的任何其他方法来确定。术语“dxp还原异构酶”或“dxr”是指由dxr基因编码的酶1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸还原异构酶(ec1.1.1.267)。术语“ispd”是指由ispd基因编码的酶2-c-甲基-d-赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶(ec2.7.7.60)。术语“ispe”是指由ispe基因编码的酶4-二磷酸胞苷基-2-c-甲基-d-赤藓糖醇激酶(ec2.7.1.148)。术语“ispf”是指由ispf基因编码的酶2-c-甲基-d-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(ec4.6.1.12)。术语“ispg”是指由ispg基因编码的酶4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶(ec1.17.7.1)。术语“isph”是指由isph基因编码的酶4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶,也被称为羟甲基丁烯基焦磷酸还原酶(ec1.17.1.2)。术语“idi”、“ipp异构酶”或“异戊烯焦磷酸异构酶”是指由idi基因编码的酶异戊烯二磷酸δ-异构酶(ec5.3.3.2),其催化高烯丙基底物异戊烯基(ipp)1,3-烯丙基重排成其烯丙基异构体二甲基烯丙基二磷酸(dmapp)。根据生物体,上面鉴定的酶和编码基因的命名可以变化。然而,出于清楚的目的,在本说明书中,这些术语独立于酶或基因的起源来使用。
优选地,选自dxs、dxr、ispd、ispe、ispf、ispg、isph和idi基因的至少一个基因被过表达,更优选地至少dxs和/或idi基因、甚至更优选地至少dxs和idi基因被过表达。这些基因可以是内源或异源的,优选为内源的。本发明的重组奇异球菌属细菌的dxs、dxr、ispd、ispe、ispf、ispg、isph和idi基因可以如专利申请wo2015/189428中所述容易地鉴定。
在特定实施方式中,本发明的重组奇异球菌属细菌被遗传修饰成过表达内源dxs基因或表达异源dxs基因,并且过表达内源idi基因或表达异源idi基因。
在优选实施方式中,过表达的内源dxs基因或表达的异源dxs基因来自于奇异球菌属细菌。来自于奇异球菌属细菌的dxs基因的实例包括但不限于来自于d.geothermalis(seqidno:24;uniprot登记号:q1izp0)、d.yunweiensis(seqidno:25)、d.deserti(ncbi登记号:wp_012692944.1;genbank:aco45821.1;uniprot登记号:c1d1u7)、d.radiodurans(uniprot登记号:q9rub5;ncbi登记号:wp_010888114.1)和d.radiopugnans(seqidno:26)的dxs基因。优选地,所述dxs基因选自来自于d.geothermalis、d.yunweiensi和d.radiopugnans的dxs基因。更优选地,所述dxs基因来自于d.yunweiensis或d.radiopugnans。与这些基因编码的任何多肽、优选地与seqidno:24、25或26编码的多肽具有至少70%、优选地80%、更优选地90%的序列同一性并具有dxs活性的任何多肽,优选为来自于奇异球菌属细菌的多肽,也可在本发明中使用。
在优选实施方式中,过表达的内源idi基因或表达的异源idi基因来自于奇异球菌属细菌。来自于奇异球菌属细菌的idi基因的实例包括但不限于来自于d.geothermalis(seqidno:27)、d.yunweiensis(seqidno:28)、d.deserti(ncbi登记号:wp_012692934.1)、d.radiodurans(uniprot登记号:q9rve2.3)或d.radiopugnans(seqidno:29)的idi基因。优选地,所述idi基因选自来自于d.geothermalis和d.yunweiensis的idi基因。更优选地,所述idi基因来自于d.yunweiensis。与那些基因编码的任何多肽、优选地与seqidno:27、28或29编码的多肽具有至少70%、优选地80%、更优选地90%的序列同一性并具有idi活性的任何多肽,优选为来自于奇异球菌属细菌的多肽,也可在本发明中使用。
此外或可选地,本发明的重组细菌也可以表达奇异球菌dxp合酶的变体,其与野生型酶相比表现出提高的活性。这些改进的dxp合酶被描述在国际专利申请wo2015/189428和wo2012/052171中。
具体来说,本发明的重组细菌可以表达编码来自于d.radiopugnans的dxp合酶的r244c突变体(seqidno:30)的基因、编码来自于d.yunweiensis的dxp合酶的r238c突变体(seqidno:31)的基因和/或编码来自于d.geothermalis的dxp合酶的r241c突变体(seqidno:32)的基因。
此外或可选地,所述八氢番茄红素生产也可以通过增加ipp和dmapp向ggpp的转化来提高。优选地,在本发明的重组细菌中,与野生型细菌相比fpp合酶活性提高。
当在本文中使用时,术语“ispa”、“fdps”、“fpps”或“fpp合酶”是指由fdps(或crte)基因编码并表现出法呢基二磷酸合酶活性(ec2.5.1.10)、二甲基烯丙基转移酶活性(ec2.5.1.1)和香叶基香叶基二磷酸合酶活性(ec2.5.1.29)的酶。
优选地,所述fpp合酶活性通过过表达内源基因或表达异源fdps基因来提高。具体来说,本发明的重组奇异球菌属细菌可以包含编码表现出fpp合酶活性的多肽的异源核酸和/或可以过表达编码表现出fpp合酶活性的多肽的内源核酸。
所述表现出fpp合酶活性的多肽可以是任何已知的fpp合酶,优选为来自于奇异球菌属细菌的任何fpp合酶。
奇异球菌fpp合酶的实例包括但不限于来自于d.geothermalis(ncbi登记号:abf45913;seqidno:33)、d.radiodurans(ncbi登记号:np_295118;seqidno:34)和d.deserti(ncbi登记号:aco46371;seqidno:35)的fpp合酶。所述表现出fpp合酶活性的多肽也可以是表现出fpp合酶活性并且与上面列出的任何fpp合酶具有至少60%、优选地65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%同一性的任何多肽。
在特定实施方式中,所述表现出fpp合酶活性的多肽选自:
a)包含选自seqidno:33至35的氨基酸序列或由所述氨基酸序列构成的多肽;和
b)表现出fpp合酶活性并具有与seqidno:33、34或35具有至少60%、优选地65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%同一性的氨基酸序列的多肽。
在特定实施方式中,本发明的重组细菌被遗传修饰,以便提高通往异戊烯焦磷酸(ipp)和二甲基烯丙基焦磷酸(dmapp)的碳通量并提高ipp和dmapp向香叶基香叶基二磷酸(ggpp)的转化。
优选地,本发明的重组细菌与野生型细菌相比表现出提高的fpp合酶、dxp合酶和/或ipp异构酶活性。更优选地,本发明的重组细菌与野生型细菌相比表现出提高的fpp合酶、dxp合酶和ipp异构酶活性。
在更特定实施方式中,本发明的重组细菌、优选为d.geothermalis细菌被遗传修饰成
-表现出提高的八氢番茄红素合酶活性,优选地通过过表达本源crtb基因,
-表现出降低的八氢番茄红素去饱和酶活性,优选地通过缺失编码八氢番茄红素去饱和酶的crti基因的全部或一部分,
-表现出提高的fpp合酶活性,优选地通过过表达本源fpp合酶基因;
-表现出提高的dxp合酶活性,优选地通过表达奇异球菌dxp合酶的变体,更优选为由seqidno:31编码的变体,并且
-表现出提高的ipp异构酶活性,优选地通过过表达本源idi基因或表达异源idi基因,更优选地表达由seqidno:28编码的酶。
在优选实施方式中,当在好氧生活中并在作为碳源的葡萄糖存在下培养时,本发明的重组细菌、优选为deinococcusgeothermalis、更优选为前面段落中定义的重组细菌能够生产至少5mg/gdcw的八氢番茄红素、优选地至少10mg/gdcw的八氢番茄红素、更优选地至少15mg/gdcw的八氢番茄红素、甚至更优选地至少20mg/gdcw的八氢番茄红素。优选地,本发明的重组细菌仅生产八氢番茄红素的一种异构体即15-顺式八氢番茄红素,并且不生产六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素或番茄红素。
另一方面,本发明还涉及本发明的重组奇异球菌属细菌的细胞提取物。当在本文中使用时,术语“细胞提取物”是指从宿主细胞获得的任何级分,例如细胞上清液、细胞碎片、细胞壁、dna或rna提取物、酶或酶制备物,或通过化学、物理和/或酶处理从宿主细胞衍生的任何制备物,其本质上或主要不含活细胞。
在特定实施方式中,所述细胞提取物包含八氢番茄红素,并且优选为包含细胞膜的级分。具体来说,所述细胞提取物可以包含八氢番茄红素和脂质例如膜脂质。
在优选实施方式中,所述细胞提取物包含八氢番茄红素并且不包含任何可检测量的六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素或番茄红素。
在更特定实施方式中,所述细胞提取物只包含一种类胡萝卜素化合物,所述化合物是八氢番茄红素。
在优选实施方式中,所述提取物只包含八氢番茄红素的一种异构体即15-顺式八氢番茄红素,并且不包含六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素或番茄红素。
本发明还涉及所述细胞提取物用于生产八氢番茄红素的用途。
另一方面,本发明涉及本发明的重组奇异球菌属细菌用于生产八氢番茄红素的用途。
具体来说,本发明涉及一种生产八氢番茄红素、优选为15-顺式八氢番茄红素的方法,所述方法包括(i)将本发明的重组奇异球菌属细菌在适合于生产八氢番茄红素的条件下培养,并任选地(ii)回收所述八氢番茄红素。
所述方法还可以包括分离或纯化所述八氢番茄红素。
优选地,所述重组奇异球菌属细菌不生产显著或可检测量的六氢番茄红素或来自于八氢番茄红素到番茄红素的任何其他中间体分子。
因此,在特定实施方式中,通过本发明的方法生产或符合本发明的用途的八氢番茄红素不含六氢番茄红素或来自于八氢番茄红素到番茄红素的任何其他中间体分子(即ζ-胡萝卜素、链孢红素)或番茄红素。
当在本文中使用时,术语“不含”意味着八氢番茄红素不含有任何可检测量的六氢番茄红素或来自于八氢番茄红素到番茄红素的任何其他中间体分子,优选为六氢番茄红素。六氢番茄红素或任何其他中间体分子的存在可以通过专业技术人员已知的任何方法例如hplc分析来评估。
在这一方面中也考虑到了上面为本发明的重组奇异球菌属细菌描述的所有实施方式。
适合于生产八氢番茄红素的条件可以根据使用的重组奇异球菌属细菌由专业技术人员容易地确定。
具体来说,碳源可以选自c5糖例如木糖和阿拉伯糖、c6糖例如葡萄糖、纤维二糖、蔗糖和淀粉。在优选实施方式中,所述碳源是葡萄糖。
优选地,本发明的重组细菌在好氧生活中并在作为碳源的葡萄糖存在下培养。
可选地,八氢番茄红素从可再生的、生物来源的碳源例如纤维素生物质生产。当在本文中使用时,术语“纤维素生物质”是指包含纤维素、半纤维素和/或木质纤维素,优选地包含纤维素和半纤维素的任何生物质材料,优选为植物生物质。纤维素生物质包括但不限于植物材料例如林业产品、木质原料(软木和硬木)、农业废料和植物残留物(例如玉米秸、高粱、甘蔗渣、牧草、稻草、麦秸、来自于油棕榈和枣椰的空果串、来自于龙舌兰酒业的龙舌兰渣)、多年生草本植物(柳枝稷、芒草、金丝雀草、斑茅、象草、芦竹和苜蓿)、市政固体废物(msw)、水产品例如藻类和海草、废纸、毛皮、棉、麻、天然橡胶产品和食品加工副产物。
优选地,如果所述纤维素生物质包含木质纤维素,这种生物质在水解之前进行预处理。这种预处理旨在打开木质纤维素的束以便接近纤维素和半纤维素的聚合物链。预处理方法是专业技术人员公知的,并且可以包括物理预处理(例如高压蒸气、挤出、热解或辐射)、物理化学和化学预处理(例如氨纤维爆炸、用碱性、酸性、溶剂或氧化剂处理)和/或生物预处理。
温度条件也可以根据使用的中温或嗜热奇异球菌属细菌来调整。
在一个实施方式中,所述奇异球菌属细菌是嗜热奇异球菌例如d.geothermalis或d.murrayi,并且所述重组奇异球菌属细菌在适合于生产八氢番茄红素的条件下的培养在30℃至55℃之间、优选地35至50℃之间、更优选地40℃至50℃之间、甚至更优选地45至48℃之间的温度下进行。
在另一个实施方式中,所述奇异球菌属细菌是中温奇异球菌例如d.grandis、d.aquaticus、d.indicus、d.cellulosilyticus或d.depolymerans,并且所述重组奇异球菌属细菌在适合于生产八氢番茄红素的条件下的培养在20℃至40℃之间、优选地28至35℃之间、更优选地约30℃的温度下进行。
在优选实施方式中,使用本发明的方法生产和/或回收至少5mg/gdcw的八氢番茄红素,优选地至少10mg/gdcw的八氢番茄红素,更优选地至少15mg/gdcw的八氢番茄红素,甚至更优选地至少20mg/gdcw的八氢番茄红素。
任选地,所述方法还可以包括将生产或回收的八氢番茄红素提交到例如使用异构酶的异构化步骤,以生产另一种八氢番茄红素异构体。
本发明的方法可以在反应器、特别是生物质转化反应器中进行。“反应器”意味着常规的发酵罐或用于生物质转化的任何装置或系统,通常选自生物反应器、生物过滤器、旋转式生物接触器和其他气相和/或液相生物反应器。可以按照本发明使用的装置可以连续或分批装料使用。取决于所使用的细胞,所述方法可以在好氧生活、厌氧生活或微好氧生活下进行。
本发明还涉及一种反应器,其包含本发明的重组奇异球菌属细菌或其细胞提取物。优选地,所述反应器还包含碳源,更优选为生物来源的碳源例如纤维素生物质。本发明还涉及所述反应器用于生产八氢番茄红素的用途。
本发明还涉及一种组合物,其包含本发明的重组奇异球菌属细菌或其提取物,以及所述组合物用于生产八氢番茄红素的用途。优选地,所述组合物还包含碳源,更优选为生物来源的碳源例如纤维素生物质。
本发明还涉及通过本发明的方法获得的八氢番茄红素,优选为分离或纯化的八氢番茄红素。分离的八氢番茄红素通常至少不含细胞的在正常情况下与其结合或正常情况下与其混合或在溶液中的某些蛋白质或其他组成成分。纯化的八氢番茄红素通常基本上不含所述细胞的其他组成成分。
本发明还涉及一种组合物,其包含通过本发明的方法获得的八氢番茄红素。
在一个实施方式中,所述组合物是美容或药物组合物。
在另一个实施方式中,所述组合物是营养保健或营养美容组合物或者食品或饲料添加剂。
当在本文中使用时,术语“营养保健组合物”是指包含从食品分离或纯化的营养物并对消费者的健康具有有益效果的组合物。当在本文中使用时,术语“营养美容组合物”是指包含营养性口服成分并且被特别配制并销售用于美容目的的组合物。
在特定实施方式中,所述美容或药物组合物是皮肤增白、增亮或漂白组合物或预防老化、氧化或光氧化损伤的组合物。
也已知八氢番茄红素显示出抗癌和抗炎性质。因此,在一个实施方式中,所述组合物是用于治疗癌症或用于治疗炎性障碍的药物组合物。
优选地,本发明的组合物通过局部或口服途径给药。
优选地,所述组合物不包含任何可检测量的六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素和/或番茄红素。更优选地,所述组合物不包含任何可检测量的六氢番茄红素。
优选地,所述组合物只包含八氢番茄红素的一种异构体,即15-顺式八氢番茄红素。
所述组合物还可以包含本发明的重组奇异球菌属细菌或其提取物。
取决于用途,本发明的组合物显然还可以包含其他成分,例如可美容用或可药用载体、防腐剂、抗氧化剂例如类胡萝卜素,以及具有药物或美容活性的成分。
在优选实施方式中,所述组合物还包含疏水载体,其可以选自在美容、药物或食品工业中常用的油,例如植物油、矿物油或合成油。
本发明还涉及生产本发明的组合物、特别是美容、药物、营养保健、营养美容组合物或者食品或饲料添加剂的方法,所述方法包括(i)将本发明的重组奇异球菌属细菌在适合于生产八氢番茄红素的条件下培养,(ii)回收所述八氢番茄红素,和(iii)将所述八氢番茄红素与至少一种载体或所述美容、药物、营养保健、营养美容组合物或者食品或饲料添加剂的至少一种其他成分混合。
在这一方面中也考虑到了上面为本发明的重组奇异球菌属细菌、生产八氢番茄红素的方法和组合物描述的所有实施方式。
在下面的实施例中将描述本发明的其他方面和优点,所述实施例应该被认为是说明性而不是限制性的。
实施例
实施例1
将deinococcusgeothermalis菌株遗传工程化改造成生产八氢番茄红素。所述生产八氢番茄红素的重组d.geothermalis通过破坏类胡萝卜素途径的一部分,即敲除八氢番茄红素去饱和酶(e.c.1.3.99.26、1.3.99.28、1.3.99.29、1.3.99.31)(crti)基因来获得。得到的构建物通过测序进行检查。
为了制造种子培养物,挑取单菌落以接种25ml含有2%葡萄糖或右旋糖作为主要碳源的cmg2%培养基(蛋白胨2g/l;酵母提取物5g/l;葡萄糖55mm(20g/l);mops酸40mm;nh4cl20mm;naoh10mm;koh10mm;cacl2.2h2o0,5μm;na2so4.10h2o0.276mm;mgcl2.6h2o0.528mm;(nh4)6(mo7)o24.4h2o3nm;h3bo30.4μm;cocl2.6h2o30nm;cuso4.5h2o10nm;mncl20.25μm;znso4.7h2o10nm;d-生物素1μg/l;烟酸(尼克酸)1μg/l;b6维生素1μg/l;b1维生素;fecl320μm;柠檬酸钠.2h2o20μm;k2hpo45.7mm),并在45℃和250rpm下培养过夜。然后将来自于对数生长期的种子以0.4的初始600nm下光密度(od600)接种到25ml同样的新鲜培养基中。将该第二种子培养物在45℃和250rpm下培养过夜。用于八氢番茄红素生产的培养将来自于对数生长期的种子以0.4的初始600nm下光密度(od600)接种到25ml无机盐限定培养基((nh4)2so4<100mm;nah2po4.h2o<10mm;kcl<10mm;na2so4<10mm;柠檬酸<30mm;mgcl2.6h2o<10mm;cacl2.2h2o<10mm;zncl2<50mg/l;feso4.7h2o<50mg/l;mncl2.4h2o<50mg/l;cuso4<50mg/l;cocl2.6h2o<50mg/l;h3bo3<5mg/l;mes<200mm;(nh4)6mo7o24.4h2o<0,5mm;葡萄糖或右旋糖<30g/l(166mm))中,在45℃和250rpm下进行24h。
在培养24h后,将1ml培养物离心,并通过将1ml乙醇与沉淀物混合进行类胡萝卜素的提取。对乙醇相进行od285nm吸光度的分析并通过hplc进行分析(柱c18poroshellagilent150mm*2.1mm*2.7um,流动相乙腈/甲醇/乙酸乙酯)。
最后,通过将八氢番茄红素标准品稀释来确定以mg/g细胞干重(dcw)为单位的八氢番茄红素产率。所述重组d.geothermalis生产0.4mg/gdcw的八氢番茄红素,并且不生产任何可检测量的六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素或番茄红素。
由所述重组d.geothermalis生产的八氢番茄红素异构体通过rmn进行分析,并被鉴定为15-顺式八氢番茄红素。
实施例2
通过在染色体中插入包含下述基因的表达盒,将实施例1的重组deinococcusgeothermalis菌株进一步修饰:
(i)编码来自于deinococcusyunweinensis的1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸合酶(e.c.2.2.1.7)(dxs)的r238c突变体的基因,和
(ii)编码来自于deinococcusyunweinensis的异戊烯二磷酸δ-异构酶(ec5.3.3.2)(idi)的基因。
将这些基因置于组成型启动子的控制之下,并将所述表达盒插入到染色体中替换淀粉酶(amy)基因。得到的构建物通过测序进行检查。
用于生产八氢番茄红素的种子培养物和培养如实施例1中所述来进行。
在培养24h后,将1ml培养物离心,并通过将1ml乙醇与沉淀物混合进行类胡萝卜素的提取。对乙醇相进行od285nm吸光度的分析并通过hplc进行分析(柱c18poroshellagilent150mm*2.1mm*2.7um,流动相乙腈/甲醇/乙酸乙酯)。
由此确定了所述重组d.geothermalis生产约1mg/gdcw(细胞干重)的八氢番茄红素,并且不生产任何可检测量的六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素或番茄红素。
实施例3
通过在染色体中插入包含下述基因的表达盒,将实施例1的重组deinococcusgeothermalis菌株进一步修饰:
(i)编码来自于deinococcusyunweinensis的1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸合酶(e.c.2.2.1.7)(dxs)的r238c突变体的基因,
(ii)编码来自于deinococcusyunweinensis的异戊烯二磷酸δ-异构酶(ec5.3.3.2)(idi)的基因,
(iii)编码来自于deinococcusgeothermalis的法呢基焦磷酸合酶(e.c.2.5.1.1、2.5.1.10、2.5.1.29)(fpps)的基因,和
(iv)编码来自于deinococcusgeothermalis的八氢番茄红素合酶(ec2.5.1.32)(crtb)的基因。
将这些基因置于组成型启动子的控制之下,并将所述表达盒插入到染色体中替换淀粉酶(amy)基因。得到的构建物通过测序进行检查。
用于生产八氢番茄红素的种子培养物和培养如实施例1中所述来进行。
在培养24h后,将1ml培养物离心,并通过将1ml乙醇与沉淀物混合进行类胡萝卜素的提取。对乙醇相进行od285nm吸光度的分析并通过hplc进行分析(柱c18poroshellagilent150mm*2.1mm*2.7um,流动相乙腈/甲醇/乙酸乙酯)。
由此确定了所述重组d.geothermalis生产约22mg/gdcw(细胞干重)的八氢番茄红素,并且不生产任何可检测量的六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素或番茄红素。
实施例4
通过在染色体中插入包含(i)和(ii)的第一表达盒以及包含(iii)和(iv)的第二表达盒,将实施例1的重组deinococcusgeothermalis菌株进一步修饰:
(i)编码来自于deinococcusyunweinensis的1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸合酶(e.c.2.2.1.7)(dxs)的r238c突变体的基因,和
(ii)编码来自于deinococcusyunweinensis的异戊烯二磷酸δ-异构酶(ec5.3.3.2)(idi)的基因,
(iii)编码来自于deinococcusgeothermalis的法呢基焦磷酸合酶(e.c.2.5.1.1、2.5.1.10、2.5.1.29)(fpps)的基因,和
(iv)编码来自于deinococcusgeothermalis的八氢番茄红素合酶(ec2.5.1.32)(crtb)的基因。
将这些基因置于组成型启动子的控制之下。将所述第一和第二表达盒插入到染色体中分别替换淀粉酶(amy)基因和内源fdps基因。得到的构建物通过测序进行检查。
用于生产八氢番茄红素的种子培养物和培养如实施例1中所述来进行。
在培养24h后,将1ml培养物离心,并通过将1ml乙醇与沉淀物混合进行类胡萝卜素的提取。对乙醇相进行od285nm吸光度的分析并通过hplc进行分析(柱c18poroshellagilent150mm*2.1mm*2.7um,流动相乙腈/甲醇/乙酸乙酯)。
由此确定了所述重组d.geothermalis生产23mg/gdcw(细胞干重)的八氢番茄红素,并且不生产任何可检测量的六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素或番茄红素。
实施例5
通过在染色体中插入包含下述基因的表达盒,将实施例1的重组deinococcusgeothermalis菌株进一步修饰:
(i)编码来自于deinococcusyunweinensis或deinococcusgeothermalis的1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸合酶(e.c.2.2.1.7)(dxs)的基因,
(ii)编码来自于deinococcusyunweinensis的异戊烯二磷酸δ-异构酶(ec5.3.3.2)(idi)的基因,
(iii)编码来自于deinococcusgeothermalis的法呢基焦磷酸合酶(e.c.2.5.1.1、2.5.1.10、2.5.1.29)(fpps)的基因,和
(iv)编码来自于deinococcusgeothermalis的八氢番茄红素合酶(ec2.5.1.32)(crtb)的基因。
将这些基因置于组成型启动子的控制之下,并将所述表达盒插入到染色体中替换淀粉酶(amy)基因。得到的构建物通过测序进行检查。
用于生产八氢番茄红素的种子培养物和培养如实施例1中所述来进行。在培养24h后,将1ml培养物离心,并通过将1ml乙醇与沉淀物混合进行类胡萝卜素的提取。对乙醇相进行od285nm吸光度的分析并通过hplc进行分析(柱c18poroshellagilent150mm*2.1mm*2.7um,流动相乙腈/甲醇/乙酸乙酯)。
实施例6
通过在染色体中插入包含(i)和(ii)的第一表达盒以及包含(iii)和(iv)的第二表达盒,将实施例1的重组deinococcusgeothermalis菌株进一步修饰:
(i)编码来自于deinococcusyunweinensis或deinococcusgeothermalis的1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸合酶(e.c.2.2.1.7)(dxs)的基因,和
(ii)编码来自于deinococcusyunweinensis的异戊烯二磷酸δ-异构酶(ec5.3.3.2)(idi)的基因,
(iii)编码来自于deinococcusgeothermalis的法呢基焦磷酸合酶(e.c.2.5.1.1、2.5.1.10、2.5.1.29)(fpps)的基因,和
(iv)编码来自于deinococcusgeothermalis的八氢番茄红素合酶(ec2.5.1.32)(crtb)的基因。
将这些基因置于组成型启动子的控制之下。将所述第一和第二表达盒插入到染色体中分别替换淀粉酶(amy)基因和内源fdps基因。得到的构建物通过测序进行检查。
用于生产八氢番茄红素的种子培养物和培养如实施例1中所述来进行。在培养24h后,将1ml培养物离心,并通过将1ml乙醇与沉淀物混合进行类胡萝卜素的提取。对乙醇相进行od285nm吸光度的分析并通过hplc进行分析(柱c18poroshellagilent150mm*2.1mm*2.7um,流动相乙腈/甲醇/乙酸乙酯)。
序列表
<110>德诺芙公司(deinove)
<120>生产八氢番茄红素的方法
<130>b2390pc
<160>35
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>296
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<213>成团泛菌(pantoeaagglomerans)
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<213>deinococcuspuniceus
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180185190
seralaphethrasnalaglyleualaleuglyseralapheglnile
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metargalaleualathrargaspala
325