用于厌氧消化反应器的富集的生物制品、制备该生物制品的方法及利用所述制品进行生物强化的方法与流程

本发明涉及厌氧消化反应器，特别是涉及用于改善或修复所述反应器的性能的方法。

本发明还涉及用于所述厌氧消化反应器的富集的生物制品，并且涉及制备这种生物制品的方法。

背景技术：

用于沼气(特别是甲烷)生产的厌氧消化反应器的酸化(也称为酸中毒)是可以发生在许多消化器中最常见的工艺失效，并且针对上述情况，沼气领域寻求快速并且有效地恢复消化工艺的解决方案。

在酸化的厌氧消化反应器中经常被报道诸如乙酸和丙酸之类的挥发性脂肪酸(vfas)浓度增加，其特征为甲烷产量少。作为结果，酸中毒会导致巨大收益损失，因此一方面重要的是防止酸中毒，另一方面，一旦发生酸中毒则要快速地重新开始该工艺。

到目前为止，已经提出了两种处理酸中毒问题的解决方案。

第一种解决方案是化学处理，其中将诸如生石灰(cao)、氢氧化钠(naoh)或氢氧化钙(ca(oh)2)之类的碱性试剂添加到反应器培养基中。这仅暂时地解决ph，并且包含在碱中的金属可能会引起反应器中的工艺抑制，或者当工艺废弃物(沼气消化物)作为有机肥料扩散时，可能会在农业土壤中不知不觉地积聚。

另一种解决方案是添加一种或多种有益微生物来改善或恢复厌氧消化反应器的性能：这是生物强化的基础，目的是提高反应器培养基的工艺效率。这些生物强化技术使用包含一种微生物菌株或几种微生物菌株的人工混合物的特定的合成组合物来降解特定的底物，其中所述微生物菌株已预先获得并维持隔离培养、富集。例如，添加可以将乙酸盐和丙酸盐转化为甲烷的利用丙酸盐的富集培养物可获得提高的消化作用。

tale等人(waterresearch,70:138-147,2015)描述了这样的生物强化技术，该技术由来自处理每天都富集丙酸盐的啤酒厂废水的厌氧消化器的样品开始。随后使用这些富集的培养物对有机超负荷的消化器进行生物强化。然而，用可培养的微生物的单个菌株或几种菌株的人工混合物实现的生物强化通常得到短暂的或微弱的改善。

技术实现要素：

发明目的

因此，本发明的第一个目的是提供这样一种组合物或制品，将该组合物或制品添加到厌氧消化反应器中以减少厌氧消化反应器中的酸中毒，从而改善或恢复所述反应器的性能(沼气或甲烷产量)，而无需添加碱性物质。

本发明的另一个目的是提供一种也防止厌氧消化反应器中的酸中毒从而改善所述反应器的性能(沼气或甲烷产量)的组合物或制品。

本发明的再一个目的是提供一种提高厌氧消化反应器的生产率的组合物或制品。

本发明的再一个目的是提供一种降低管理和维持厌氧消化反应器的工作成本的方法。

发明内容

在发明人的研究工作中，令人惊讶地发现了特定微生物的存在将有助于获得所需的以上结果。

因此，本发明涉及用于厌氧消化反应器(被命名为第一厌氧消化反应器)的生物强化的生物制品，其包含微生物的混合物，该混合物包含的独特的cloacimonetessp.的丰度为所述混合物中总微生物丰度的至少10％，优选至少25％，更优选30％至50％，该独特的cloacimonetessp.具有包含以下特定序列的16srrna基因标签：

aaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacccggtcttgacatccgagggatccctcagagatgggggagtgccggctagccggaacttcgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctgcttccagttaccatcattaagttggggactctggaaggaccgctgcggtaacaacgcagaggaagatggggacgatgtcaagtcatcatggtccttatgaccggggctacacacgtgctacaatggtagttacagagggatgcgaaggggtgacctggagctaatctcttaaaagctgccacagttcggattgaggtctgcaactcgacctcatgaagcaggaatcgctagtaatcgcgcaacatcatggcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgt(seqidno：1)。

令人惊讶的是，发明人已经发现了具有包含以上序列(seqidno：1)的16srrna基因标签的所述cloacimonetessp.可以在非常短时间内恢复酸中毒后的厌氧消化反应器的沼气生产，如说明书的实施例部分所示。

该生物制品还可以包含其他选自以下门类的微生物：拟杆菌门(bacteroidetes)、厚壁菌门(firmicutes)、变形菌门(proteobacteria)、绿弯菌门(chloroflexi)、互养菌门(synergistetes)和/或microgenomates(op11)。

所述独特的cloacimonetessp.是厌氧生物，并且以上微生物也主要是厌氧微生物。

本发明的所述制品可为液体或冷冻状态的水基组合物或冻干组合物的形式。水基组合物(新鲜的或冷冻的)具有以下优势：包含独特的cloacimonetessp.的所述混合物具有直接活性并且与现有的微生物竞争的问题少，因此将稳定地并且迅速地建立在反应器中。

必要时可以添加防腐化合物，但本发明的生物制品可以在不添加任何其他成分或活性物质时单独使用。

本发明还涉及制备上述生物制品/组合物的方法，包括以下步骤：

i)鉴定包含独特的cloacimonetessp.的合适的生物样品，所述独特的cloacimonetessp.具有包含以上序列(seqidno：1)的16srrna基因标签，独特的cloacimonetessp.的相对丰度为样品的总微生物丰度的至少0.01％，优选为0.05％，

ii)用已鉴定的包含所述独特的cloacimonetessp.的生物样品接种第二厌氧消化反应器的反应器培养基，

iii)在高有机负荷率(olr)下将富含碳水化合物(优选富含果胶/纤维素/木质纤维素)的底物供给所述厌氧消化反应器培养基，并且任选地补充一种或多种有机酸，优选为乙酸和/或丙酸或它们的盐，

iv)以有规律的时间间隔混合所述反应器并且注入含氧气体，

v)监测反应器培养基中在所述独特的cloacimonetessp.的富集，直至cloacimonetessp.的丰度达到所述反应器培养基的混合物中总微生物丰度的至少10％，优选为25％，更优选为30％至50％，以获得水基生物制品/组合物，以及

vi)任选地冷冻、浓缩或冻干水基生物组合物以保存所述生物制品/组合物。

因此，初始生物样品富集了具有包含seqidno：1的16srrna基因标签的独特的cloacimonetessp.。

初始生物样品可以是由废水处理厂产生的污泥或泥浆，或是由环境(例如沉积物、土壤、湖泊、海洋等)产生的样品，或可由供给有废水污泥或农业废弃物的厌氧消化反应器产生，初始生物样品包含的所述独特的cloacimonetessp.的相对丰度为至少0.01％，优选为0.05％。

有利地，所述生物样品是水基样品。

供给底物是富含碳水化合物的底物，优选为富含纤维素或富含果胶或富含木质纤维素的底物，例如选自有机的家庭和/或工业食品废弃物中的植物废弃物，如甜菜渣、果浆、谷物残渣、马铃薯。该列表不是限制性的。

在这里所说的高有机率是指高于所述第二厌氧消化反应器的起始负荷率的有机负荷。例如该第二厌氧消化反应器的高有机负荷率(olr)在4kg挥发性固体vs.m^-3.d^-1至10kg挥发性固体vs.m^-3.d^-1的范围内，优选在6kg挥发性固体vs.m^-3.d^-1至8kg挥发性固体vs.m^-3.d^-1的范围内。

补充一种或多种有机酸仅是任选的：在供给底物中不添加一种或多种有机酸也可以获得样品在所述独特的cloacimonetessp.方面的富集。

在反应器中以时间间隔注入的含氧气体可以是富含氧气的沼气、纯氧、或空气、或富含氧气的空气。虽然存在于生物初始样品中的微生物(包括所述独特的cloacimonetessp.)主要是厌氧微生物，但含氧气体的注入有助于生物样品在所述独特的cloacimonetessp.方面的富集。反应器培养基中在所述独特的cloacimonetessp.方面的富集可达到在该反应器培养基的混合物中cloacimonetessp.的相对丰度为总微生物丰度的30％至50％。

任选地，可将防腐剂添加到步骤v)获得的水基组合物中。

本发明还涉及用于防止或减少诸如产生甲烷的厌氧消化反应器之类的厌氧消化反应器中的酸中毒的方法，该方法能够改善或恢复所述反应器的性能(例如甲烷产量)，该方法包括利用根据以上方法制备的本发明的生物制品对所述反应器进行生物强化。

有利地，该方法仅包括根据以上方法制备的本发明的所述生物制品的生物强化。

因此，利用本发明的所述生物制品/组合物对这种厌氧消化反应器进行生物强化是一种用于改善消化并且防止酸中毒或者快速地重新开始消化工艺的非常有前途的解决方案。

本发明还涉及以上方法的几种不同的用途：

-提高厌氧消化反应器的有机负荷率(orl)，优选达到10kgvs.m^-3.d^-1至12kgvs.m^-3.d^-1；

-提高生产甲烷的厌氧消化反应器的有机负荷率(orl)，优选为在中温条件下；

-提高厌氧消化反应器的生产率；

-提高生产甲烷的厌氧消化反应器的甲烷生产率，优选达到2nlch4.l^-1.d^-1至3nlch4.l^-1.d^-1，优选为在中温条件下。

附图说明

将参照附图，在以下实施方案中进一步描述本发明，其中：

图1阐释了本发明的生物制品的一个实例，其示出了包含所述独特的cloacimonetessp.的微生物的相对丰度。

图2a和图2b是分别具有三个隔室或两个隔室的用于包含独特的cloacimonetessp.的生物样品的富集的反应器的图解实例；

图3示出了132天期间，与未利用生物强化的对照反应器(图a、图c和图e)相比，用包含独特的cloacimonetessp.的本发明的生物制品进行强化(箭头表示生物强化的开始)的厌氧消化反应器(图b、图d和图f)的行为(图a和图b：微生物的相对丰度，图c和图d：ph值和丙酸盐浓度，图e和图f：沼气中的ch4％和co2％)；

图4是示出了利用和未利用本发明的生物制品的强化的厌氧消化反应器的甲烷生产率的图(箭头表示生物强化的开始)；

图5示出了168天期间用包含独特的cloacimonetessp.的本发明的生物组合物进行强化的另一个厌氧消化反应器的行为(用箭头表示生物强化的起始)(图a：微生物的相对丰度，图b：ph值和丙酸盐浓度，图c：沼气中ch4％和co2％)；以及

图6是示出了图5的厌氧消化反应器的甲烷生产率的图，该反应器用包含独特的cloacimonetessp.的本发明的生物组合物进行强化(用箭头表示生物强化的起始)。

具体实施方式

实施例

材料和方法

-生物样品

生物制品来源于厌氧泥浆，该厌氧泥浆来源于供给有废水污泥的厌氧反应器，并且规格如下：ph范围为5至8，干物质含量在2质量％至5质量％的范围内，碱度在4000mgcaco3/l污泥至8000mgcaco3/l污泥的范围内。

-生物初始样品和本发明的生物制品中独特的cloacimonetessp.的测定。

可使用以下两种具体方法中的任一种进行检测：

方法1：如goux等人2016年(doi:10.1016/j.biortech.2016.04.040)所述的16srrna基因扩增子高通量测序。

使用通常可得的dna提取试剂盒从环境样品中提取dna之后，使用改良引物s-d-bact-0909-a-s-18和s-*-univ-1392-a-a-15(序列描述如下)，特别是靶向细菌的16srrna基因的改良引物来制备pcr反应混合物。作为改良方式，将nextera转座酶序列(illuminainc.,sandiego,usa)引入正向和反向引物的5′端，并且在正向引物中添加4个n(即4个随机的核苷酸)，以增加核苷酸多样性。

引物s-d-bact-0909-a-s-18(5→3)actcaaakgaatwgacgg(seqidno：2)

引物s-*-univ-1392-a-a-15(5→3)acgggcggtgtgtrc(seqidno：3)

这两种引物源于klindworth等人的研究(nuclacidsres(2012)41(1))。

然后在专用的热循环器中进行pcr反应，并且用常规可得的用于pcr产品纯化的定制试剂盒对产生的扩增子进行纯化。使用nexteraxtindex试剂盒(illuminainc.,sandiego,usa)，在有限循环pcr期间添加流式细胞杂化所需的nextera条形码和illumina接头。

然后，用常规可得的用于pcr产物纯化的定制试剂盒对产生的文库进行纯化，并且用kapafastuniversalqpcr试剂盒(kapabiosystems,wilmington,usa)进行定量。利用miseqreagent试剂盒v3-600循环(illuminainc.,sandiego,usa)在illuminamiseq系统中对文库进行测序。最后，用常规生物信息学管路进行数据分析，并且进行独特的cloacimonetessp.(16srrna基因拷贝数的相对丰度)的部分16srrna基因序列(segidno：1)的检测。

方法2：用靶向16srrna基因的种特异的taqmanmgb(小沟结合剂)探针进行实时pcr。该技术由两个pcr引物(正向和反向，序列如下所示)和一个特异性地旨在靶向独特的cloacimonetes的部分16srrna基因的taqmanmbg探针(序列描述如下)构成。定制的taqmanmbg探针是根据应用生物系统的说明书设计的，并进行了双重标记。定制的探针结合了5'报道分子和3'非荧光淬灭剂(nfq)。根据用于试验的实时系统的说明书，可以从以下染料中选择5'报道分子：fam^tm、vic^tm、tet^tm和/或ned^tm。

特异性pcr引物的序列和mgb探针旨在通过靶向其部分16srrna基因序列(seqidno：1)来检测独特的cloacimonetessp.。

引物_f(5→3)ccttacccggtcttgacatc(seqidno：4)引物_r(5→3)gtaactggaagcaggggttg(seqidno：5)

mgb探针(5→3)cgagggatccctca(seqidno：6)

dna提取之后，用以上种特异性的引物和taqmanmgb探针进行实时pcr，并且确定目标样品中独特的cloacimonetessp.的相对丰度。根据常规实时pcr实践(如通过使用标准曲线法)进行目标环境样品中所述独特的cloacimonetessp.的相对丰度(16srrna基因拷贝数的相对丰度)的计算。独特的cloacimonetessp.的克隆部分16srrna基因序列可以用作模板。

可以使用标准细菌域特异性16srrna基因靶向pcr引物和/或探针计算环境样品中的总微生物丰度(即，使用靶向16srrna基因序列的具有上述序列的引物对s-d-bact-0909-a-s-18和s-*-univ-1392-a-a-15，或任何其他常用的通用细菌引物)。总微生物丰度(16srrna基因拷贝数的总丰度)可以用标准曲线法和任何包含已知数量的细菌源的一个或多个16srrna基因的模板dna来计算。

实施例1：生物样品的富集

该实施例的生物初始样品包含的所述独特的cloacimonetessp.的丰度为污泥来源中总微生物丰度的至少0.01％，优选为0.05％，通过利用种特异性taqmanmgb探针的实时pcr或通过16srrna基因扩增子高通量测序进行鉴定和确定。在如图2a所示设计的水平厌氧折流板反应器的一端(进口1)处的反应器培养基5中接种该生物样品，该反应器具有三个连通的相邻隔室c1、c2和c3。每个33l的隔室都装配有取样管2、在底部的用于注入含氧气体的气体进口4和在反应器顶部的气体出口3。在反应器的一端(进口1)引入底物并且在反应器的另一端(出口6)收集富集的污泥。该反应器在中温范围(30℃至40℃，优选37±3℃)内运行并且以高有机负荷率(olr；4kgvsm^-3.d^-1至10kgvsm^-3.d^-1，优选在6kgvsm^-3.d^-1至8kgvsm^-3.d^-1的范围内)供给富含果胶/纤维素/半纤维素的底物(例如有机的家庭或工业食品废弃物)，并且任选地补充丙酸盐(直到污泥中的最终浓度在1500mg丙酸盐/kg污泥至3000mg丙酸盐/kg污泥的范围内)。

在图2b所示的另一个实施方案中，反应器只有两个隔室c1和c2，导致污泥的停留时间较短并且富集的样品更少。

以有规律的时间间隔(如5min/2h)将反应器培养基5与注入的气体混合。所述气体是含氧沼气：比例为90:10v/v的沼气和空气的混合物。用适当的分子工具(如上所述)定期监测所述独特的cloacimonetessp.的富集，直到混合物中总微生物丰度为至少10％，优选为25％，更优选为30％至50％。然后得到本发明的水基生物制品/组合物(主要是富含cloacimonetes的培养物)。

所述制品的例子如图1所示：主要丰度(40％以上)是这种具有包含(seqidno：1)的16srrna基因标签的独特的cloacimonetessp.。这种细菌从未被分离为纯培养物，因此它之前从未包含在用于恢复厌氧消化反应器的工艺的任何微生物组合物(生物强化微生物混合物)中。该制品还包含已鉴定的微生物拟杆菌门、绿弯菌门、厚壁菌门和较小丰度的op11、变性菌门和互养菌门，它们是通常在厌氧消化反应器中描述的典型微生物。该制品的ph处于中性范围。

为了生物制品的长期保存，可将该生物制品/组合物冷冻(例如-20℃)或冻干。

实施例2：厌氧生物反应器的生物强化

如图3的图c和图d所示，将以上制备的生物制品用于发生酸中毒(ph低于5)的厌氧消化反应器的生物强化。在一个反应器中，在第70天(参见图d和图f上的箭头)进行生物强化(图3右侧的图)。

图b显示了所述独特的cloacimonetessp.的丰度和稳定沼气生产的恢复之间的关系，并且示出了与对照反应器(a，未用生物制品进行生物强化)相比，在富含cloacimonete的厌氧消化反应器(b，在第70天开始用生物制品进行生物强化)中相对于其他主要细菌类群而言，该独特的cloacimonetessp.的相对丰度。可以注意到，ph立刻开始增加(d)并且丙酸盐浓度降低。图e和图f的比较示出了在对照反应器(左)中的沼气组合物仅含有20％的甲烷，在生物强化(右)反应器中的沼气组合物含有超过50％的甲烷，并且长时间稳定，达到132天。

备注：独特的cloacimonetessp.在对照反应器中根本不存在，但在这个反应器中第1天时存在另一种代表cloacimonetes门的cloacimonetes。在对照反应器中没有观察到与生物制品中存在的独特的cloacimonetessp.所发现的有益性能类似的有益性能，从而表明在酸中毒后恢复稳定的沼气生产中该独特的cloacimonetessp.的重要性。

与之前使用160ml容量的小血清瓶进行的研究相反，本发明提出了在100l规模的反应器中的完成的微生物制品的有效规模扩大的制备方法。此外，向酸化的反应器中添加富集有独特的cloacimonetessp.(高达10％v/v)的生物制品示出了大约在10天内恢复ph(ph从大约4.5恢复到7至8)，并且在不到7天时恢复了失效的厌氧消化反应器的生产工艺(在ph完全恢复到中性水平之前，甲烷生产开始提高，图3d和f)。

图4显示了在供给有相同绝对量的富含果胶/纤维素底物的两个不同尺寸(100lvs.33l)的厌氧消化反应器中，产生的甲烷生产率的比较(在33l反应器中，所产生的olr大约高三倍)。在第60天时(箭头)，用以上制备的生物制品对33l容量的反应器进行生物强化。100l工作容积反应器未用所述生物组合物进行强化。

结果显示，在用该生物制品生物强化后仅7天内，33l工作容积反应器的甲烷生产率(nlch4l^-1.d^-1)增加。与运行时不添加本发明的生物制品的对照反应器相比，甲烷生产率高出53.38％±9.89％。

因此，由于生物制品中富集了独特的cloacimonetessp.的细菌聚生体是耐高有机负荷的，因而其可以应用于供给有非常高olr(在喜温的条件下，通常可实现6kgvsm^-3.d^-1至8kgvsm^-3.d^-1的高olr范围)的较小ad反应器，从而降低(与反应器结构、混合和加热有关的)运行成本。此外，由于完成的生物制品中的细菌聚生体在37℃±3℃下运行，(与在耐热温度下运行的厌氧消化反应器相反)在中温温度范围内运行反应器可进一步降低氨中毒的成本和风险。

实施例3：另一个厌氧消化反应器的生物强化

如图5的图b所示，还将实施例1中制备的生物组合物用于发生酸中毒(ph低于5)的另一个厌氧消化反应器的生物强化。在该反应器中，在第132天进行生物强化(参见图5的图a、b和c上的箭头)。

图5的图a显示了所述独特的cloacimonetessp.的丰度和稳定沼气生产的恢复之间的关系，并且示出了在富含cloacimonete的厌氧消化反应器(图5的图a，在第132天开始用生物制品进行生物强化)中相对于其他主要细菌类群而言，该独特的cloacimonetessp.的相对丰度。可以注意到，ph立刻开始增加(图5的图b)并且丙酸盐浓度降低。

图6显示了将供给有与图4中的33l反应器相同绝对量的富含果胶/纤维素底物的33l尺寸的所述厌氧消化反应器中的甲烷生产率。在第132天(箭头)，用以上制备的生物组合物对33l容量的反应器进行生物强化。

如实施例2中那样，生物强化的厌氧反应器的沼气中甲烷的量(起始为约20％；左)在生物强化后增加(50％以上；右)并且长期保持稳定，可达168天(图5的图c)。

序列表

<110>卢森堡理工学院

<120>用于厌氧消化反应器的富集的生物制品、制备该生物制品的方法及利用所述制品进行生物强化的方法

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