类器官组织工程的制作方法
本发明涉及开发和维持类器官的方法和由此产生的类器官。
背景技术：
与干细胞密切相关的两个特性是它们自我更新和产生特异的后代的能力。过去二十年的研究还表明，干细胞及其后代具有自组织的先天倾向，从而在过程中产生复杂的结构，使人想到那些驱动组织和器官发育的过程。模拟早期胚胎发育和模式的各个方面的胚胎体、多能干细胞聚集体部分说明了干细胞的自组织能力。然而，这种自组织潜能可能最好通过上皮类器官、多能或成体干细胞衍生的三维(3d)结构展现，该结构以先前体外模型无法比拟的保真度捕获真实器官的多种组织学和功能方面。目前，已经建立了多种器官(包括肠、胃、结肠、胰腺、视网膜、脑和肾)的类器官模型。从成体的或诱导的多能人干细胞产生类器官的能力为人类发育和疾病的建模、药物发现和个性化医疗提供了先前难以想象的可能性。此外，通过用作用于修复受损或患病器官的高度组织化的和功能性组织的来源，类器官有望显著推进组织工程和基于细胞的疗法领域。
可通过在3d基质支架内组织特异性细胞的增殖和分化在体外形成类器官。已经尝试通过限制它们的生长来提高类器官作为体外组织模型的相关性。特别地，已经开发了模拟特定组织(例如肠绒毛)的几何结构的支架。这些支架内细胞的分化取得了各种各样的成功。
胃肠的类器官展示出特别高水平的多细胞组织和广泛的应用，包括作为肠干细胞(isc)生态位模型、肠发育和疾病模型、用于药物筛选和个性化医疗的平台及用于临床使用的可移植组织的来源。然而，肠的类器官形成的过程很大程度上是随机的，并且所得结构在多个方面与天然器官不同。值得注意的是，不能控制隐窝样结构域的位置、大小和数量，而绒毛结构完全不存在。此外，在没有间充质隔室下，构成这些结构的模式和自组织的机制尚不完全清楚。
如下所述，在支架内或支架上使反映体内组织结构的类器官生长已经进行了许多尝试。
costello等(costello等，2014)提供合成的3d水凝胶支架，用于支持肠上皮细胞系(caco-2细胞和ht29-mtx)以及来自小鼠小肠的分离的隐窝细胞的生长。使用绒毛阵列的琼脂糖模具，由多孔聚乳酸-共-羟基乙酸(plga)形成支架(costello等，图1)。接种到这些支架中的分离的隐窝细胞分化，以形成帕内特细胞、杯状细胞和肠上皮细胞的空间排列(第1230页，第1栏，第1段)。该方法依赖于含有存在于分离的隐窝中的多种细胞类型的起始培养物，或依赖于上皮细胞系的增殖和自发分化能力。
陈等(chen等，2015)描述了在基于丝的多孔支架的表面上的肠上皮细胞系caco-2细胞和ht29-mtx以及原代人肠肌成纤维细胞(h-inmyofib)的生长。支架是管状型，具有或不具有内螺旋模式。在h-inmyofib存在下在支架上生长的caco-2细胞和ht29-mtx细胞形成极化柱状结构。因此，该方法也依赖于上皮细胞系。
levin等(levin等，2013)描述了使用由聚l-乳酸密封并涂有胶原的非织物聚羟基乙酸圆柱形成的合成支架(第131页，第2段)。在该方法中，将从肠组织分离的类器官装载到支架上，并直接植入动物受试者中(第131页，第3段)。因此，levin没有提供在体外使类器官生长的方法。
finkbeiner等(finkbeiner等，2015)提供了由脱细胞小肠形成的支架(finkbeiner等，图1b)。用人肠类器官将这些天然支架重新接种，在体外培养，然后移植到免疫受损的小鼠中。finkbeiner还提供合成的聚羟基乙酸/胶原支架，在其上接种类器官，然后将支架立即植入小鼠中(finkbeiner等，图1c)。作者表明合成支架可以在体内支持类器官存活分化，但不支持体外，同时脱细胞小肠支架支持类器官存活，但不提供用于干细胞分化的必要诱因(finkbeiner等，图3c和3d)。因此，finkbeiner没有提供用于体外在支架上生长和维持类器官的方法。
jp2014/138605(mongens等，2014)描述了用于在具有限定的表面形貌(第[0018]段)的生物可相容的材料的结构中使干细胞生长的方法，例如覆盖在微突起中的表面。主要通过为细胞粘附提供更大的表面积而选择结构，以促进未分化干细胞的生长(第[0025]段)和/或干细胞的大规模和统一分化(第[0029]和[0051]段)。然后能够收获分化的细胞并用于各种应用。mongens公开的方法因此不适用于类器官领域，因为mongens的目的是避免形态发育，并且反而是促进统一的生长和分化。
最近的许多研究已经证明了在微孔内体外类器官的生长。然而，类器官的结构不受微孔的大小或形状的限制。
todhunter等(todhunter等，2015)描述了通过dna编程组装嵌入适当的位置的细胞阵列。首先通过将dna寡核苷酸掺入其细胞膜中使细胞功能化，然后通过这些寡核苷酸与固定在玻璃上的dna斑点内的互补序列的相互作用连接到载玻片上。多轮细胞粘附导致斑点周围形成3d微组织结构。在固定的细胞周围允许形成水凝胶，以便将它们嵌入适当的位置。
us2011/0171712(rivron等，2011)描述了在微阵列板的限制内细胞聚集体的生长。通过在微孔阵列顶部施加细胞悬浮液并使细胞沉淀至微阵列中以形成聚集体。当在孔中空间限制时，细胞自发聚集(第5栏，第4-5段)。聚集体的形状可以变化，并且可以例如形成球形、圆柱形、棒形或立方体(第2栏，第[0021]段)。然后从微孔中收集限制的聚集体，合并并转移至接种表面支架，以便组装为组织构建体(第4页，第[0037]段)，其中表面的形貌和模式可以控制该组装过程(第4页，第[0038]段)。然后诱导组织构建体经历形态发育，该过程可以由机械约束控制(第4页，第[0042]段)。特别地，生物材料可以用作提供机械支撑或有助于实现特定所需形状的支架(第5页，第[0048]段)。因此，rivron的方法需要产生预先形成的组织聚集体，必须将所述组织聚集体收获并组合以产生组织。
还描述了在微腔内上皮细胞的受限制的生长。nelson等(nelson等，2006)公开了从原代细胞或嵌入胶原凝胶的管状腔中的上皮细胞系的细胞产生工程化的上皮细胞管。当用生长因子(包括egf和hgf)刺激时，管延伸分支到周围的胶原基质中。管状腔不用于从干细胞产生具有特定形状的类器官。此外，在目前的工作中，没有显示微腔的形状来模拟干细胞的命运，这是类器官发育的关键。
wo2016/123474a1(在教堂山的北卡罗来纳大学)描述了使用几何结构作为支持物，并且通过可溶性因子的梯度进行干细胞模式化。此外，这项工作明确地提到多次，没有梯度时干细胞不会定位在微腔的底部，因此在所提出的系统中，形状不是类器官形态发育的驱动因素。
因此，本领域需要一种在体外从干细胞或肿瘤细胞产生类器官的可靠方法，所述类器官准确地反映体内组织形态学。
发明概要
发明人提供了用于获得具有预先确定形状的类器官的方法，该方法包含将一个或更多个自我更新细胞接种到具有3d结构的表面上，在自我更新条件下培养所述接种的细胞，使得细胞增殖以形成具有与表面的特征相同的3d形状的集落，并在分化条件下培养集落，使得集落经历形态发育以形成类器官。发明人惊奇地发现，增殖的上皮细胞集落的几何结构为细胞提供了足够的信息，以指导集落随后的形态发育成为类器官，该类器官具有代表体内组织的组织形状。该发现提供了从一个或更多个自我更新细胞使类器官在支架上原位生长的方法的基础。支架决定了集落的形状，进而决定了当集落经受分化条件时形成的所得类器官的形状和模式。因此，相同的支架结构可用于产生具有高度可再现的形状和模式的类器官(即，可以使用具有相同结构的支架重复产生相同的形状和模式)，其中类器官的形状和模式由支架结构预先确定。
值得注意的，本发明涉及在具有3d结构(例如孔、腔或其他培养容器)的表面上培养细胞，使得细胞形成具有预先确定的模式和组织形状的类器官。本发明人已经确定，几何结构本身的控制决定了细胞命运模式并从而决定了形态发育的诱导，其然后允许以可重复和可靠的方式形成类器官。
本工艺不同于3d基质中的细胞培养，尤其因为这种现有技术方法不代表在具有3d结构的表面上的培养，而是代表3d各向同性环境中的培养。3d基质本身并不将细胞和类器官生长限制为特定的、可重复的3d形状，而仅仅提供细胞能够在其内生长的适当环境。通过本文描述的一些方法产生的类器官不在3d支架或基质内生长(或者至少，不在没有额外空间限制的情况下仅在3d支架或基质内生长)，而是在具有3d结构的表面上生长。
此外，该工艺不同于现有技术方法，现有技术方法例如使用微腔和微孔作为聚集和/或容纳类器官的手段。在所讨论的现有技术方法中，使用3d支架仅作为用于3d细胞培养的固定支持物。这使得最终组织形状严格地由初始几何结构预先确定，而不是如在本发明中通过初始形状而允许空间的细胞模式，该初始形状然后引导随后的形态发育以形成具有可再现和可预测的形态特征的类器官。
本发明力图克服本领域的这些和其他缺点。
使用本发明的方法，发明人还确定了可能有助于体内肠发育的模式形成的基本机制。
缩略词
2d二维
3d三维
96u96孔u-底部平板
cftr囊性纤维化跨膜电导调节子
dhm数字全息显微镜
ecm胞外基质
egfp增强的绿色荧光蛋白
gfp绿色荧光蛋白
isc肠干细胞
mw微孔
neaa非必需氨基酸
pdms聚二甲基硅氧烷
roi目的区
rt-qpcr实时定量聚合酶链式反应
详细描述
附图简述
图1微型肠组织阵列
(a)通过光刻和微模塑的组合，产生限制在受控制的几何结构的水凝胶腔内的离散的isc阵列。(b)离散的isc的自组织进入受控制的几何结构的腔内(lumenized)肠小管中。(c)相同的过程可用于产生不同长度的管状组织，以及其他几何结构(例如圆形)的组织。(d)通过在扩增培养基中培养isc两天形成的组织内的lgr5-egfp。(e)通过在扩增培养基中培养isc两天，并在类器官形成培养基中再培养2天形成的组织内的lgr5-egfp。针对(f)溶菌酶和(g)粘蛋白-2染色的工程化的肠组织形成的类器官。比例尺50μm。
图2肠组织模式的几何控制
(a)单个组织内的lgr5-egfp和(b)在isc扩增条件下培养的管状肠组织内lgr5-egfp的平均分布。(c)单个组织内的lgr5-egfp和(d)在类器官形成条件下培养的管状肠组织内lgr5-egfp的平均分布。(e)单个环形组织内的lgr5-egfp和(f)在isc扩增条件下培养的环状肠组织内lgr5-egfp的平均分布。(g)单个环状组织内的lgr5-egfp和(h)在类器官形成条件下培养的环状肠组织内lgr5-egfp的平均分布。(i)从管状几何结构的工程化的肠组织形成的肠的类器官的阵列和(j)放大。(k)管状肠组织内每个位置的平均芽数的定量。(l)单个管状肠组织内表达溶菌酶的帕内特细胞，和(m)管状肠组织内平均帕内特细胞分布。(n)单个管状肠组织内表达粘蛋白的杯状细胞，和(o)管状肠组织内平均杯状细胞分布。比例尺50μm。
图3肠管微装置
这展示了用于器官型肠管的培养的3d微装置(“类器官芯片”)。(a)微装置由五个隔室组成：中心的基质室，其两侧有两个外部培养基储液器和两个用于培养基灌注的储液器(入口和出口)。覆盖基质隔室整个长度的3d微轨道通过激光烧蚀产生。右上角：详细的顶视图。右下角：详细的侧视图。(b)培养基储液器用作扩散信号的来源。在将40kdafitc-葡聚糖加入其中一个储液器后1和20小时，用激光烧蚀的基质微轨道对基质隔室进行明视野和荧光图像。底部：在1小时和20小时穿过基质室(1200μm)关于源的荧光分布的定量。储液器中的培养基没有得到补充。(c)填充有2000kdafitc-葡聚糖的激光烧蚀基质微轨道的明视野和共聚焦图像。xy对应于210μmz-stack的最大投影，xz和yz对应于210μmz-stack的正交投影。比例尺100μm。
图4培养isc作为肠管
(a-b)在肠管中生长的isc的可视化：(b)明视野和(c)f-肌动蛋白/细胞核染色。(d)溶菌酶、粘蛋白-2和嗜铬粒蛋白a的表达。
图5肠表面的工程化
(a)当以高密度接种到基质胶表面时肠干细胞形成连续层，其由明视野成像和(b)lgr5-gfp表达展示。(c)该方法可用于在具有肠样微观形貌的凝胶上形成连续的细胞层。(d)表面设计示意图。(e)来自pdms模具的复制品的横截面视图(扫描电子显微镜)。(f，g)在分化条件下培养细胞层后，维持isc，鬼笔环肽＝f-肌动蛋白染色。(h)生长的肠上皮层中的细胞类型。(i)制造的隐窝的形态学。(j)层中帕内特细胞的定位。(k)微孔的直径控制隐窝的形成。在接种misc后72小时，在水凝胶(左栏)和相应的细胞层中的微孔的明视野图像。
图6微流体芯片设计
(a)标准transwell的示意图。(b)动态微流体芯片设计的示意图。
图7几何引导的misc自组织转变成管状类器官
(a)在类器官芯片微装置的基质微轨道中培养的misc的明视野时间进程。(b)生长5天的lgr5-egfpmisc的明视野和荧光共聚焦图像(在自我更新条件下2天+在分化条件下3天)。(c)在微装置中生长5天(在自我更新条件下2天+在分化条件下3天)的肠管的荧光共聚焦图像。细胞用dapi标记细胞核(蓝色)和用鬼笔环肽标记f-肌动蛋白(绿色)，以及sox9(红色，干/祖细胞)、溶菌酶(红色，帕内特细胞)和l-fabp(红色，肠上皮细胞)。图像对应于80μmz-stack的最大投影。
图8在“类器官芯片”微装置的管状基质微轨道中培养的人ips细胞的明视野时间进程。
定义
本文使用的“阵列”被定义为相似或相同物体的有序排列。通常，阵列中的物体可以分为行和列。类器官的阵列是类器官的有序排列。在生物学中，样品阵列或生物材料(微阵列)用于高通量分析。
“软骨凝胶(cartigel)”是软骨的细胞外基质提取物。
“通过细胞相容性反应可交联”包含基于以下的反应：(i)永久共价键形成，所述永久共价键形成选自由a)酶促催化反应，优选取决于活化的转谷氨酰胺酶(如因子xiiia)；和b)非酶促催化和/或非催化反应，优选迈克尔加成反应所组成的组；和/或ii)可逆共价键形成，所述可逆共价键形成选自由席夫碱(亚胺)键、可逆腙键、肟键、二硫键和通过可逆狄尔斯-阿尔德(diels-alder)反应形成的键所组成的组；和/或iii)非共价(即物理)键形成(例如基于疏水相互作用，氢键、范德华力、静电相互作用、主客体相互作用、生物识别(结构域/蛋白质-配体相互作用)；自发的或由温度变化或缓冲液的离子强度变化引起的)。
“焦平面”是通过焦点垂直于例如显微镜的透镜轴的平面或平直表面。在特定焦点处，视图中的所有对象在同一焦平面内。
“生物功能水凝胶”是含有生物活性(或生物粘附)分子的水凝胶，和/或与活细胞相互作用以促进细胞活力和所需细胞表型的细胞信号分子。生物功能水凝胶也可指生物活性的。生物粘附分子的实例包括但不限于纤连蛋白、玻连蛋白、骨涎蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白。这些分子含有细胞粘附肽，所述细胞粘附肽控制它们与细胞的相互作用。细胞粘附肽序列的实例包括但不限于来源于纤连蛋白的rgd、kqagdv、redv和phsrn，来源于层粘连蛋白的yigsr、lgtipg、ikvav、pdgsr、lre、lrgdn和iklli，来源于胶原的dgea和gfoger，以及来源于弹性蛋白的vapg。稀释的水凝胶或3d基质是不聚合的水凝胶，非稀释的水凝胶或3d基质形成凝胶。
“生物活性”(或生物粘附或生物功能)分子是与细胞相互作用以促进细胞活力的分子，并且先前已针对多种细胞类型进行了描述。提供水凝胶生物功能的生物粘附分子包括但不限于纤连蛋白或其功能变体，例如ffiii1-c片段、fniii9-10片段和fniii12-14，或含rgd的肽(例如rgd、rgds、rgdsp、rgdspk、rgdtp和rgdspasskp)。生物活性分子的功能变体是具有相同或相似生物或生物化学功能和相似序列或组成的分子，例如截短分子或此类分子的片段。
“生物相容性水凝胶”是对活组织和/或细胞没有显著毒性的聚合物网状物，并且在健康个体中不引起免疫病原体应答。生物相容性活性机制是对特定细胞或组织无毒的过程，例如在组织的生理温度范围内的温度升高，或者施加足够短时间以免引起显著毒性的过程。
“腔”是凹痕、孔、倒相(inverse)3d结构或部分封闭空间。腔可以是任何形状或尺寸。包含腔倒相的模具具有由腔包围的空间的3d结构，和/或腔的外表面的倒相。
“集落”是两个或更多个同种细胞的群体，它们彼此密切相关或相互连接。
“培养细胞”是指将细胞保持在适于维持和/或生长的条件下的过程，其中条件是指例如温度、养分可得性、大气co2含量和保持细胞的细胞密度。细胞可以在体内或体外培养。用于维持、增殖、扩增和分化不同类型细胞的适当培养条件是众所周知的并且有文献记载。适合于类器官形成的条件是便于或允许细胞分化和多细胞结构形成的条件。有关适用于实施例中所用细胞的培养条件的详细信息，参见材料和方法。
“高通量筛选和试验”是那些自动化实现可重复数据采集的筛选和试验，其使用手动方法难以实现。
“水凝胶(凝胶)”是包含亲水聚合物链的网状物的3d基质。
“原位”是用于培养细胞或组织而不移动其位置的生物学术语，即保持它们在其自然场所或位置。
“层粘连蛋白”是细胞外基质糖蛋白家族，其具有由α、β和γ链组成的异源三聚体结构。层粘连蛋白-111与层粘连蛋白-1同义。层粘连蛋白-111由lama1基因编码。
“基质胶”是广泛用于细胞培养的2d和3d模型的商业产品。它包含从富含ecm的小鼠肿瘤中提取的溶解的基底膜制剂。
“微孔”是能够容纳液体的腔，包含开口、空心轴和底部。微孔也可以称为孔、微腔或腔。微孔板包含等效微孔阵列。这些微孔可以在形成板的基板中形成模式，例如以形成模式化的水凝胶。微孔可以是平底的，弧形(u)-底的，v形底的或圆锥形平底的。微孔的轴通常是圆柱形的。微孔的深度是指从嘴到底部的最低部分的距离。微孔可以具有任何形状，包括圆形、椭圆形、杆状、矩形等。
“肌质胶(myogel)”是从骨骼肌中提取的细胞外基质(abberton等，2008)。
“类器官”是器官特异性细胞类型的三维培养系统，其从干细胞或肿瘤细胞发展，并通过细胞分选和空间限制的谱系定型以类似于体内情况的方式自组织(或自模仿)。如本文所用，将类器官定义为干细胞或肿瘤细胞及其分化后代的3d培养物，其从单个干细胞或具有至少一个干细胞的细胞的多细胞聚集体开始。干细胞可以从组织或类器官片段中分离。从分离的肠隐窝或干细胞生长的类器官在本领域中也可称为“类肠”或“类结肠”。从癌细胞生长或含有癌细胞的类器官是“类肿瘤”。
“器官芯片”是微流体细胞培养装置，其含有由活细胞占据的连续灌注室，所述活细胞被布置成模拟组织水平和器官水平的生理学(bhatia和ingber，2014)。
“预先确定的”在本文中用于描述可预测和可再现的结果。具有预先确定的细胞形状和模式的类器官具有可以通过已知方法可靠地和重复地产生的细胞形状和模式，即通过选择这种可重复的方法以产生它，以确定类器官的形状和模式。
术语“rgd”或“rgd序列”是指最小的生物活性rgd序列，其是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)序列，并且是足以模拟细胞与纤连蛋白结合和/或促进锚着依存性细胞的粘附的最小的(最小的)来源于纤连蛋白的氨基酸序列，。
“接种细胞”是指通过重力或离心使悬浮细胞沉降到表面上的过程。
“类器官的组织形状和模式”可以依据形成类器官结构的细胞和组织的类型和/或相对位置来定义。类器官的组织形状和模式也可以依据类器官内的子结构(例如内腔)的数量、类型和/或相对位置来定义。组织形状和模式包括例如3d上皮组织内形态发育结构或芽的存在和位置以及分化的空间模式的结果。
“水凝胶的剪切模量”等于水凝胶的刚性模量，g，弹性模量或弹性。剪切模量定义为剪切应力与剪切应变的比率。可以使用流变仪测量水凝胶的剪切模量(实施例1，1.4材料和方法)。
本文使用的“表面”描述了细胞可以在其上生长的结构或基板。表面可以被模式化，例如具有腔或微孔。
“圆环管状形状”通过围绕位于同一平面但不与其相交的线旋转闭合曲线形成。r是从管中心到环形中心的距离，r是管的半径。比率r除以r被称为纵横比。
“管”是具有纵向轴线的空腔，该纵向轴线可具有圆形、椭圆形和/或矩形横截面。与腔相反，管具有两个允许用液体灌注的开口端，即管是可灌注的腔。
描述
用于获得具有预先确定的组织形状和模式的类器官的方法，包括：
i.接种一个或更多个自我更新细胞，所述自我更新细胞能够在具有3d结构的表面上分化以形成类器官，
ii.在自我更新条件下培养所述接种的细胞，使得所述细胞增殖并模式化以形成具有与所述表面相同的3d结构的集落，和
iii.在分化条件下培养所述集落，使得所述集落经历形态发育以形成类器官。
步骤iii的类器官形成可包括所述集落经历细胞命运的变化，和随后的形态发育以形成类器官，其中所述细胞命运的变化是通过初始几何结构(即所述集落的初始几何结构，其反过来由所述表面的3d结构限定)在空间上模式化。所述类器官具有可再现和可预测的形态特征(例如，隐窝和/或芽)。
在一个实施方案中，所述自我更新细胞是干细胞或肿瘤细胞，优选胚胎干细胞、诱导多能干细胞、小肠干细胞、胃干细胞、结肠干细胞、胰腺干细胞、肝干细胞、肺干细胞、前列腺干细胞、乳腺干细胞、角膜干细胞、毛囊干细胞、表皮干细胞或肾干细胞或这些细胞的祖细胞。
在另一个实施方案中，所述3d结构可以是任何所需的形状或尺寸，优选地其中在表面上和/或表面内制造所述结构，其中所述表面可以是宏观的水凝胶块。
优选地，所述表面上的3d结构可包含微孔、微柱或两者的组合，优选其中所述表面是水凝胶。更优选地，所述3d结构具有最小厚度，所述最小厚度相当于至少3层自我更新细胞或其他细胞类型，并且最大受限于所述表面3d水凝胶的尺寸。更优选地，所述结构可包含排列成阵列的腔。
所述3d结构也可以由所述表面内的空腔形成，优选地，其中所述表面是宏观的水凝胶块。优选地，所述腔是管，更优选地，其中所述管是开放的并且可灌注。
所述腔在外形上可以是管状的，其中所述管具有矩形横截面，优选地，其中所述矩形具有长度为10μm至5mm之间的边。备选地或此外，所述管可具有椭圆形横截面，优选地，其中所述椭圆形具有长度为10μm至5mm之间的两个主轴线，更优选地，其中一个主轴线比另一个主轴线长。所述管可以具有穿过其纵向轴线的一个截面的矩形横截面和穿过其纵向轴线的另一个截面或多个截面的椭圆形横截面。
腔还可以或可选地具有包含圆柱体的3d结构，优选地，其中所述圆柱体具有10μm至5mm的直径，更优选地，其中所述圆柱体具有在10μm至50mm之间的总长度。
所述腔可以具有包含圆环的3d结构，优选地，其中所述圆环具有在100μm至5mm之间的r值，更优选地，其中所述圆环具有在10μm至1mm之间的r值。
在另一个实施方案中，本发明的方法通过复制模塑、软压花、注塑、3d打印、生物打印、激光加工、显微机械加工、表面蚀刻、光刻、增材制造、电化学定向交联软蚀刻和/或聚二甲基硅氧烷(pdms)复制模塑获得所述预先确定的3d结构。
本发明的基板可以是水凝胶。本发明的水凝胶可以由天然来源的大分子形成，并且选自包含以下的组：多糖、凝胶状蛋白质、琼脂糖、藻酸盐、壳聚糖、葡聚糖、层粘连蛋白、胶原、透明质酸、纤维蛋白或其混合物，或者选自：由基质胶、肌质胶和软骨凝胶组成的来源于复杂组织的基质的组。
优选地，所述水凝胶包含i型胶原和基质胶的混合物，优选地，其中在所述凝胶中，所述胶原的浓度为0.4mg/ml和约3.6mg/ml之间，更优选地，其中所述基质胶处于90％(v/v)和10％(v/v)之间的百分比。备选地，所述水凝胶可以由合成的或重组的大分子形成，优选地用来源于细胞外基质(ecm)的蛋白质或肽功能化的交联的合成亲水聚合物，优选地其中所述亲水聚合物选自包含以下的组：聚(乙二醇)、聚噁唑啉、聚脂肪族聚氨酯、聚醚聚氨酯、聚酯聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚(环氧乙烷)、聚环氧丙烷、聚丙二醇、聚四氢呋喃、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚(丙烯酸羟乙酯)、聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)及其混合物或共聚物。所述水凝胶也可以是基质胶和合成凝胶的混合物。
在一个实施方案中，通过交联水凝胶前体分子获得的所用水凝胶优选由亲水性聚合物组成，例如基于聚(乙二醇)(peg)的聚合物，最优选地基于多臂(即分支的)peg的聚合物，所述亲水性聚合物通过细胞相容性交联反应交联。水凝胶前体可选自包含线性peg分子或多臂peg水凝胶前体分子的组，优选为具有4-或8-臂的那些peg水凝胶前体。水凝胶前体可以进一步选自包含分子量为10-40kda的peg水凝胶前体分子的组。
在本发明的另一个实施方案中，来源于ecm的蛋白质或肽选自包含以下的组：层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-511、层粘连蛋白-521、层粘连蛋白-421、层粘连蛋白-411、层粘连蛋白-332、层粘连蛋白-221、层粘连蛋白-211、纤连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白i、胶原蛋白iv、基底膜聚糖、肌腱蛋白、透明质酸、rgd、rgds、rgdsp、rgdspk、rgdtp、rgdspasskp、cyclo(rgdsp)、cyclo(rgdfk)、cyclo(rgdyk)、cyclo(rgdfc)、iii1-c片段、fniii9-10片段和fniii12-14片段、ikvav、yigsr和ag73。
在另一个实施方案中，水凝胶可以是非均相的，并且可包含具有局部不同的物理化学性质和成分的区域。优选地，这种水凝胶能够包括在胶表面上以及在凝胶内部具有不同化学成分或不同物理性质的区域。
在本发明的另一个实施方案中，可以在水凝胶内培养不同类型的支持细胞。优选地，这些细胞是间充质型细胞，更优选选自包含成纤维细胞、成肌细胞、肌成纤维细胞和脂肪细胞的组。可选地，内皮细胞和免疫细胞(如淋巴细胞、b细胞、巨噬细胞和树突细胞)可以在水凝胶中共培养。
干细胞可以是多能干细胞或成体干细胞，优选小肠干细胞、胃干细胞、结肠干细胞、胰腺干细胞、肝干细胞、肺干细胞、前列腺干细胞、乳腺干细胞、角膜干细胞、毛囊干细胞、表皮干细胞或肾干细胞，或这些细胞的祖细胞，所述细胞来源于组织活检和/或在体外扩增。更优选地，所述干细胞是肠干细胞，使得组织样集落包含上皮样组织，更优选其中所述上皮样组织包含腔内(lumenized)多细胞结构。
在另一方面，本发明涉及通过本发明的任何方法产生的类器官。所述类器官可以是类肿瘤。
在另一方面，本发明涉及具有预先确定的3d形状/几何结构的类器官，其中所述类器官来源于由干细胞群体原位形成的组织样集落，并且所述预先确定的细胞形状和模式是由干细胞群体的3d结构决定的。
在一个实施方案中，所述类器官是上皮类器官，并且所述预先确定的细胞形状和模式包含囊状结构、中心腔和外部细胞层，所述外部细胞层包含在所述初始结构内的高凸曲率区域出现的芽。
在另一方面，本发明涉及所述类器官在2d平面内的阵列，优选地其中所述类器官在阵列内等间隔，优选地其中在所述阵列内相邻类器官之间的空间等于或大于所述阵列的平面内的任何所述相邻类器官的长度。
所述阵列的尺寸在宽度和/或长度上可以是10μm至100mm之间。可折叠以形成3d形状，优选为管。所述阵列的腔可以是任何形状，但优选是管状和/或矩形。
在另一方面，本发明涉及本发明的任何方法用于筛选药理学化合物、生物分子或细胞对类器官形成的效果的用途，所述用途包含在所述待测药理学化合物、生物分子或细胞存在下接种细胞，并监测所述药理学化合物、生物分子或细胞对器官形成的效果。
另一方面，本发明涉及本发明的类器官用于筛选药理学化合物、生物分子或细胞对治疗上皮组织疾病的效果的用途，其中所述类器官是上皮细胞类器官或上皮肿瘤细胞类器官，优选地其中所述干细胞是或者源自从组织活检样本中分离的干细胞，所述用途包含在待测药理学化合物或生物分子的存在下，培养所述类器官，并监测细胞和干细胞损伤或死亡的减少，上皮连接完整性、炎症和/或经上皮转运的恢复。所述上皮组织疾病可以是遗传性、获得性、多因素、恶性或感染性疾病，优选地其中所述疾病选自包含囊性纤维化、簇绒肠病、溃疡性结肠炎和克罗恩病的组。在一个实施方案中，所述用途可以应用于类器官阵列，优选地其中所述用途以高通量进行。
本发明还涉及如本文所述的类器官(优选例如工程化的肠管)作为模拟肠上皮损伤和再生的手段的用途。以葡聚糖硫酸钠(dss)灌注或暴露于辐射已经常规用于模拟天然小鼠肠道中的炎症和损伤，并研究随后的体内再生过程(chassaing等，currprotocimmunol2014；metcalfe等，cellstemcell2014)。虽然该领域将大大受益于人体肠道损伤和修复的体外模型，但是经典的类器官模型不适用于此目的，因为它们的小尺寸和封闭的内外结构使它们对dss和辐射诱导损伤过度敏感，导致完全破坏和再生失败。本文描述的方法可以包含：
1.使用来源于活检或ipsc的人isc创建工程化的肠管；
2.用dss灌注或暴露于辐射以诱导肠上皮损伤；
3.监测和研究内源性伤口愈合和上皮修复过程；
4.筛选支持和增强再生和修复的药理学化合物。
除了开发用于产生临床级isc和类器官的方法之外，在人类基于细胞的疗法中，使用类器官的主要障碍是递送和移植策略的优化。我们提出如本文所述的工程化的上皮管可用于模拟基于类器官的方法以治疗上皮损伤。该方法可以包含：
1.使用来源于活检或ipsc的人isc，创建工程化的肠管；
2.用dss灌注或暴露于辐射以诱导肠上皮损伤；
3.在肠损伤或疾病的基于细胞的疗法的情况下，引入isc或肠类器官以优化递送和移植。
在另一方面，本发明涉及用于制备适于本发明方法的3d结构的试剂盒，包含i)含有所述3d腔的倒相的模具，和ii)本发明方法的水凝胶。所述试剂盒还可包含干细胞。
在另一方面，本发明涉及用于制备基于类器官的器官芯片系统的试剂盒，其包含i)包含本发明任何方法的3d结构的微装置表面；ii)提供适于培养干细胞的自我更新条件和/或分化条件的培养基；iii)干细胞，优选上皮干细胞。
在一个实施方案中，所述集落在结构上类似于上皮组织(即上皮组织样)。
在一个方面，本发明涉及上皮干细胞类器官，其包含囊状结构、中心腔，以及位于外侧的细胞层，所述细胞层具有至少一个在所述初始结构内的高凸曲率区域出现的芽。
在另一方面，本发明涉及类器官的阵列用于定量上皮干细胞或肿瘤细胞类器官形成的用途，所述方法包括：
1.将多个自组织上皮干细胞或肿瘤细胞接种到根据本发明的类器官阵列上；
2.在药理学化合物、生物分子或细胞存在下，在合适的条件下培养所述细胞，和；
3.通过定量，高含量成像方法，监测所述细胞自组织形成类器官。
在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的类器官的阵列用于筛选药理学化合物、生物分子的候选物或文库或评估基于细胞的疗法在治疗上皮组织疾病中的功效的用途，该方法包括：
1.提供来自患者的组织活检样本；
2.在本发明的类器官阵列中，使从活检样本中分离的上皮干细胞生长，并在待测药理学化合物或生物分子的存在下在合适的条件下培养排列的类器官，和；
3.监测细胞和干细胞损伤或死亡的成功减少，上皮连接完整性、炎症和经上皮转运的恢复。
在某些实施方案中，上皮组织疾病是先天性遗传疾病，例如囊性纤维化、簇绒肠病或获得性或多因子疾病，例如溃疡性结肠炎或克罗恩病。
在另一方面，本发明涉及本发明的类器官的阵列用于筛选药理学化合物、生物分子的文库或评估基于细胞的疗法诱导上皮肿瘤细胞死亡或生长停滞的功效的用途，该方法包括：
1.在本发明的阵列中使肿瘤类器官生长，并在所述待测药理学化合物、生物分子或细胞的存在下，在合适的条件下培养它们，和
2.监测细胞死亡和/或生长停滞。
上皮肿瘤包括上皮性卵巢癌(ramalingam，2016)、甲状腺上皮肿瘤(eszlinger等，2008)、肾上皮肿瘤(hagenkord等，2011)、包括实体的胰腺肿瘤和乳头状上皮胰腺肿瘤(madan等，2004)和任何组织类型的上皮肿瘤和癌。
在另一方面，本发明涉及本发明的类器官的阵列用于量化微生物组和/或病原体与上皮干细胞及其分化后代之间的相互作用的用途，该方法包括：
1.接种一个或多个自组织上皮干细胞以形成本发明的类器官阵列，其中所述类器官包含可接近的上皮组织；
2.在药理学化合物、生物分子或细胞存在下，在合适的条件下培养所述细胞，和；
3.将微生物的多种混合物接种到所述可接近的上皮组织上；
4.通过定量、高含量成像和跨上皮转运测量方法，监测上皮修饰以及微生物群体与所述上皮组织的相互作用。
与微生物组和/或病原体与上皮组织的相互作用相关或有关的上皮组织疾病包括溃疡性结肠炎、克罗恩病、腹泻、炎症性结肠炎、坏死性小肠结肠炎、增生、炎症性肠病和微腐蚀。
在另一方面，本发明涉及用于制备根据本发明的水凝胶的试剂盒部件，包含以下组分：
1.具有本发明的3d腔的倒相的模具；
2.适于形成本发明表面的基板的前体或多个前体，其中所述前体包括在形成后与基板连接的组分。
在一个实施方案中，所述试剂盒可包含容纳在培养容器内优选在多孔板的一个孔或多个孔内的模具，含有所述前体或多个前体的一个管或多个管，和包含所述模具的单独容器。优选在容器中提供或预供应所述试剂盒部件，优选将所述试剂盒部件安装在模塑支架上。一个或多个前体优选以基本上未反应的形式提供，优选以干燥或脱水的形式提供。
在另一方面，本发明涉及用于制备具有预先确定的3d形状的来源于干细胞的类器官的试剂盒部件，包含在所述基板或表面之上或之内的空间预定义的3d腔，其中所述试剂盒包含以下组分：
1.压印在基板或表面上的根据本发明的3d腔的限定模式；
2.所述基板或表面；
3.包含组织特异性因子、营养物和形态发育素的培养基；和
4.干细胞。
所述基板可以用腔预模式化并在培养容器中提供。培养基组分可以在单独的容器中提供，优选管或瓶。干细胞可以在另一个单独的容器中提供，优选管，优选冷冻管。
可选地，可以在容器中提供或预供应形成基板的组分，优选以预先反应形式在多孔板的孔中，优选浸入液体中。
培养基可以在多于一个的即用型混合(ready-to-mix)瓶和管中提供，优选多于两个，更优选多于三个，且优选处于低温。
干细胞可以在冷冻管中提供，优选于非常低的温度提供。
干细胞可以是上皮来源的，包括但不限于胃肠道、乳腺、肝脏，前列腺、角膜、胰腺以及胚胎和诱导的多能来源。
根据本发明的自我更新条件可以包含先前描述的用于培养与细胞外基质接触的不同来源的干细胞集落所必需的因子，例如bmp抑制剂、wnt激动剂和表皮生长因子，将其添加到基础培养基中以用于动物或人细胞培养。
根据本发明的分化条件可以包含先前描述的用于培养和获得与细胞外基质接触的不同来源的干细胞类器官所必需的因子，不包含bmp抑制剂或wnt激动剂，将所述因子添加到基础培养基中以用于动物或人细胞培养。
在另一方面，本发明涉及通过软蚀刻技术和聚二甲基硅氧烷(pdms)复制模塑制造的微装置。微装置可以由多个模块组成：连接用于细胞装载的入口/出口对的一个或多个水凝胶隔室的两侧是开放式培养基储液器和空气冲洗通道。隔室部分地由水凝胶装载时引导相的阻碍特征限定，而互相连接允许溶解分子的自由交换。培养基储存在开放的储液器中，并且不同的培养基组合物允许产生生物分子的渐进的空间分布。空气冲洗通道允许在水凝胶完全聚合后回收残余空气。通过装载入口将细胞注入腔中。
本发明还涉及这种微装置用于发育和生理学研究的用途，包括干细胞及其分化后代与间质的相互作用，以及干细胞及其分化后代与不同物种细胞(如细菌)的生理学相关的协同相互作用。微装置可选地可用于上皮组织疾病研究，包括但不限于上皮遗传、吸收、感染和恶性疾病的研究。微装置还可用于药物发现筛选、药物代谢研究和毒性试验。
在另一方面，本发明涉及试剂盒组件，所述试剂盒组件用于在微装置内在本发明的表面或基板内制造具有开放的、宏观的、可灌注的、预定义的3d形状的腔，所述试剂盒包含：
1.根据本发明的微装置；
2.根据本发明的限定的基板或表面；
3.存储设备，以创建所述3d腔。
存储设备可以包含路径文件或计算机可读指令，所述存储设备在被执行时控制设备以创建3d腔。
微装置和基板可以如上述试剂盒中那样提供。存储装置优选为记忆棒。
实施例
实施例1.受控几何结构的肠类器官的形成和表征
1.1.介绍
通过建立生化和机械信号的区域差异，已经显示了器官(例如乳腺)的宏观上皮几何结构有助于其模式化和形态发育(gjorevski和nelson，2010；shyer等，2015)。肠粘膜的上皮-间充质几何结构同样有助于改善最终使隐窝和绒毛区分离的旁分泌信号的空间梯度。然而，高度模式化的肠类器官的存在强烈表明即使在没有间充质形态发育中心的情况下上皮细胞本身也能够自组织。
发明人已经观察到，在由均匀表达lgr5的先前球形isc集落形成类器官时，lgr5首先在整体下调，并且仅在形成隐窝样芽之后强烈地和局部地重新表达。通过机械限制集落防止芽的形成，阻止了lgr5的重新表达和局部干细胞区的建立，最终导致集落破坏。因此，发明人假设隐窝的形状代表isc生态位的组成部分，有助于限制isc区域并建立隐窝-绒毛轴。为了验证这一假设，他们着手建立预定义大小和几何结构的肠组织，所述大小和几何结构模仿隐窝的组织，并监测初始形状如何影响isc和组织内各种分化的细胞类型的空间分布。
1.2.结果
1.2.1.受控几何结构的肠类器官的形成
为了产生所需几何结构的肠组织，使用微加工方法。简言之，将包含i型胶原和基质胶的混合凝胶用弹性印模微结构化，以产生受控形状和大小的腔。随后用离散的lgr5-egfp表达小鼠isc填充腔(图1a)。最初随机分散，干细胞开始形成与彼此和周围基质的接触，并在48小时内自组织成符合预先存在的腔的形状的腔内上皮组织(图1b)。该方法用于形成任意大小和形状的肠组织(图1c)。通过在自我更新条件下培养细胞形成的隐窝样小管遍及表达lgr5-egfp(图1d)。在切换到分化条件后，lgr5-egfp信号被限制在离散位置(图1e)，并且分化的肠细胞(帕内特和杯状细胞)出现在组织内(图1f，g)。因此，成功地形成了具有受控几何结构的肠类器官。
1.2.2.受控几何结构的工程化肠组织的分化模式
接下来，发明人试图确定工程化肠组织的分化是否遵循模式或随机发生。上述方法产生数百个相同大小和形状的有规律间隔的组织，这允许通过免疫荧光分析可视化的荧光标记物或蛋白质的快速成像。以高统计置信度，在登记中堆叠大量(>30)个体组织的图像，提供了关于目的分子的平均分布的信息。
使用该方法，发现lgr5-egfp信号在自我更新条件下均匀分布在由isc形成的肠组织中(图2a，b)。然而，当切换到分化和类器官形成条件时，lgr5-egfp信号变得局限于组织的弯曲末端(图2c，d)，表明isc局限于这些区域，这种模式使人想到天然隐窝中观察到的模式。重要的是，lgr5表达的空间模式对于非等轴的、非圆形几何结构的组织是特异性的：在自我更新或分化条件下，在环状组织中没有观察到isc定位的空间偏差(图2e-h)。在类器官形成条件下培养的肠组织继续延伸隐窝样芽，如先前在经典肠类器官培养中所观察到的(sato等，2009)。隐窝样组织内芽形成的模式反映了lgr5的表达：组织的弯曲末端比平坦侧面显著地更可能延伸芽(图2i-k)。对帕内特和杯状细胞的免疫荧光分析显示，前者优先定位于与isc相同的末端位置(图2l，m)，而后者平均从末端排除并限制在组织的中间(图2n，o)。因此，工程化组织内的isc和分化细胞的空间分布反映了体内沿隐窝-绒毛轴观察到的空间模式。
1.3.讨论
干细胞衍生的类器官是优越的组织和器官模拟物，干细胞衍生的类器官有望作为人体器官发育和疾病的模型，用于药物发现和个性化疗法设计的平台，以及作为在临床中修复患病和受损组织的手段。然而，虽然驱动其形成的自组织原则赋予它们高度复杂性和对真实器官的保真度，但是通过外在调节补充自组织可以更好地控制类器官形成过程，从而扩大它们在基础和临床研究中的效用。这里，本发明人表明微加工方法可用于形成所需几何结构的类器官，并且这些结构的初始几何结构决定了它们随后的形态发育。
一般而言，离散的上皮干细胞和上皮细胞的自组织和组织遗传特性被长期识别(lancaster和knoblich，2014；sasai等，2012)。然而，发明人在此证明，当isc的自组织队列的自由边界被物理的和生物功能性的(粘附呈现)障碍取代时，可以控制所得组织的形状。此外，令人惊讶地发现，如此工程化的组织的形状可以作为其模式化和进一步发育的模板。具体地，发现可以复制肠隐窝的细胞模式，并且通过简单地将离散的isc的最初均匀的群体限制为隐窝类几何结构来控制隐窝-绒毛轴的各方面。这些原则提供了一种强有力的方法，该方法为将类器官的自组织性质及其组织学复杂性与外在控制水平相结合，使得其他随机发育过程更具确定性和指导性。虽然这里使用该方法来使具有所需形状的肠组织工程化，并控制其模式化和随后的出芽，该方法很容易适应于控制来源于干细胞的类器官的其他类型的发育。管状组织，包括神经管、肺、肾、乳腺和胰腺，似乎尤其适合。
除了提供用于指导基于干细胞的类器官形成的工具之外，该工作揭示了肠组织模式化和形态发育的新机制，该机制可能潜在地参与体内隐窝-绒毛系统的建立。最近的一项研究表明，肠绒毛的形状导致上皮shh信号的局部浓度。然后shh诱导bmp4的间充质产生，反过来局部抑制上皮内的wnt信号传导，从而将干细胞限制在每个绒毛的基部14。这里，发明人证明了在没有绒毛和间质的情况下，发生了isc限制于隐窝样工程化组织的末端，表明肠道区域化的另外一种机制，其中上皮几何结构允许上皮的自主模式化。
1.4.材料和方法
1.4.1.小鼠
根据epfl和felasa规定的动物实验方案，从5-10周龄的杂合lgr5-egfp-ires-creert2小鼠(jackson实验室)中提取肠隐窝。
1.4.2.肠隐窝分离
按照先前建立的试验方案分离小鼠肠隐窝(wang等，gastroenterology2013)。简而言之，收获肠的近端部分，径向打开并用经冰冷的pbs洗涤。用玻璃载玻片刮下肠的腔侧以去除绒毛，并将肠切成4mm的片，用经冰冷的pbs洗涤5-10次。为了释放隐窝，将肠片段在20mmedta/pbs中温育(在冰上20分钟)。除去edta，将片段重新悬浮于加入的10ml冷pbs中，并手动摇动5分钟以将隐窝释放到悬浮液中。收集上清液并通过70μm过滤器(bdbiosciences)过滤。将得到的富含隐窝的悬浮液以800rpm离心5分钟。将沉淀重悬于10ml冷的advanceddmem/f12(invitrogen)中，并以700rpm离心以除去单个细胞和组织碎片。得到的沉淀富含隐窝，随后将其离散或直接包埋在peg或matrigeltm(bdbiosciences；生长因子减少，无酚红的制剂)中。为了产生单细胞悬浮液，通过在37℃下在1mltrypleexpress(lifetechnologies)中温育8分钟来酶解隐窝或isc集落，所述trypleexpress补充有dnasei(2000u/ml；roche)，0.5mmn-乙酰半胱氨酸(sigma)和10μmy27632(stemgent)。使用40μm过滤器过滤消化后的悬浮液，以除去细胞团块和未消化的隐窝片段。
1.4.3.工程化的肠微组织
含有确定特征的弹性pdms印模用1％bsa处理以防止蛋白质粘附。通过在印模周围聚合含有3mg/ml胶原(koken)和25％基质胶(v/v)(corning)的液体溶液，产生微结构胶原-基质胶凝胶。去除印模后，将lgr5-egfp表达小鼠isc的浓缩悬浮液置于凝胶表面上。使细胞进入腔，用经冰冷的advanceddmem/f12(invitrogen)轻轻洗涤过量的细胞。用第二层胶原-基质胶凝胶从顶部密封细胞，并用isc扩增培养基覆盖。
1.4.4.细胞培养
通过在补充有生长因子(包括egf(50ng/ml；r&d)，noggin(100ng/ml；内部生产)和r-spondin(500ng/ml；内部生产))和小分子(包括chir99021(3μm；millipore)，丙戊酸(1mm；sigma)和thiazovivin(2.5μm；stemgent))的isc扩增培养基(含有glutamax、hepes、青霉素-链霉素、b27、n2(invitrogen)和
1.4.5.免疫荧光分析
用pbs中的4％多聚甲醛(30min，rt)固定微加工的肠组织，用pbs洗涤一次，用pbs中的0.2％tritonx-100透化(1小时，rt)并封闭(含有0.01％tritonx-100的pbs中的10％山羊血清)至少3h。将样品与针对溶菌酶(1:50；thermoscientificpa1-29680)、粘蛋白-2(1:50；santacruzsc-15334)的一抗在封闭液中稀释4℃温育过夜。用pbs洗涤至少3h后，将样品与第二抗体alexa647山羊抗兔(封闭液中1:1000；invitrogen)在4℃下一起温育过夜。用pbs多次洗涤后，在辐射荧光(zeissaxioobserverz1)或共聚焦(zeisslsm710)模式下对染色的微组织进行成像。
1.4.6.频率图
为了产生显示分子平均分布的频率图，对其中荧光可视化分子的多个(>30个)组织进行成像，使用imagej软件将图像二值化并堆叠。生成的灰度图在adobephotoshopcs6中转换为热图。
实施例2.肠管
2.1.结果
2.1.1.肠管微装置设计
尽管已经描述了多种培养系统，但尚未建立维持基本肠生理结构的发育相关的长期培养系统。设计肠管微装置，以在体外器官型系统中产生具有管状生理几何结构的肠组织。
肠管系统由三个隔室组成：两侧有两个培养基储液器的基质隔室(图3a)。中心基质隔室包含主要由基质胶组成的3decm，基质胶是富含层粘连蛋白的天然来源的基质，其支持肠上皮生长和分化(barker等，2007；sato等，2009)。基于基质胶的培养物已成功用于来自干细胞的其他器官型模型的生长，如视杯(eiraku等，2011)和迷你脑(lancaster等，2013)。
为了从isc诱导形成与发育中的肠的生理几何结构匹配的管状肠上皮片(shyer等，2015)，通过激光烧蚀在基质内产生3d平行六面体微轨道(图3b)。由于基质胶的低刚度(弹性模量约为450pa(soofi等，2009))，添加至少10％(v/v)i型胶原含量(基质ecm的主要成分)到基质胶，以使激光烧蚀微轨道的结构稳定。在没有胶原或存在较少量的情况下，激光烧蚀的微轨道在几分钟内崩溃。
另一方面，高于15％的胶原含量与isc的隐窝形成或分化不相容。从基质隔室的一个末端到另一个末端的连续平行线的激光烧蚀矩形模式导致产生没有连接腔室入口和出口的基质的微轨道。线的数量定义了微轨道宽度(通常在70和100μm之间)。激光焦点体积设置在微装置玻璃底部上方100μm处。然而，由于激光束的双锥形状，基质也在激光焦平面下方和上方被烧蚀几微米。该深度与所使用的激光功率成比例。产生的微轨道覆盖了基质隔间的整个长度，形成了穿过3decm的通道(图3b)。
为了有效地检查通道的几何结构和大小，将荧光标记的葡聚糖(2000kda)添加到细胞的入口，并允许通过重力诱导的流动进入100μm宽的激光烧蚀微轨道。荧光染料的共聚焦成像显示矩形棱柱形中空管，宽度为155μm(xy视图)，深度为140μm(xz视图)(图3c)。激光烧蚀宽度与有效宽度之间的差异是由于基质的粘弹性性能。然而，通道显示出精确的中-基质界面并且在腔内基本上没有碎片(图3b)，因此代表了在生理基板内形成3d微轨道的确定的模型，作为支持细胞粘附和几何引导发育的边界。
将培养基储液器用作营养物和扩散信号的来源。分子通过3d基质隔室扩散，导致梯度浓度分布的被动形成。使用荧光标记的40kda葡聚糖来观察梯度并在2天内追踪其稳定性，同时不补充储液器(图3c-e)。在一天内达到平衡分布，在基质室的两个极端区域之间具有约2倍的差异。将荧光强度归一化至源，并且腔室内的分子浓度为相对于源浓度从20％至60％的范围。高基线浓度可能是由于葡聚糖与胶原凝胶的非特异性相互作用。一旦达到平衡，就能保证良好的分布稳定性。梯度分布强烈依赖于分子通过凝胶的多孔结构的扩散性。实际上，储液器的开放区域不直接与腔室部分相邻：由于制造步骤的实际原因，必须在两个隔室之间确保约300μm的间隙。间隙导致了限制梯度有效范围的不可利用的梯度区域。这种间隙效应影响更多小分子，所述小分子在水相和凝胶相中具有与较大分子相似的扩散性。
2.1.2.培养isc作为肠管
将源自lgr5-egfp-ires-creert2小鼠并在自我更新条件下作为isc集落体外培养的lgr5-gfp+isc，作为高密度单细胞悬浮液添加到微装置细胞的入口，并通过重力诱导的流动进入微通道。在自我更新条件下的最初24小时(enrcv培养基)期间，粘附在激光烧蚀微通道壁上的isc增殖并开始自组织成几个连续的囊样结构，上皮单层围绕管腔，类似于肠类器官(图4a，24小时)。2天后，在自我更新条件下强烈诱导isc增殖，上皮片开始向外朝向ecm形成囊腔(图4a，48小时)。随着时间的推移，囊样结构彼此融合，形成围绕中心腔排列的连续肠管状上皮(图4a，72小时)。
为了诱导构成上皮细胞管的isc的分化，通过用分化培养基(enr培养基)替换培养基储液器中的自我更新培养基，将细胞暴露于分化条件。切换到分化条件促使多个隐窝样结构从肠管状上皮径向延伸(图4a，72小时)。在分化条件下3天后，向ecm延伸的隐窝的数量和大小已经大大增加并覆盖了肠管的整个长度(图4c)。发现多个lgr5-egfp细胞限制性地定位于隐窝底部(图4b)，如已在肠类器官(sato等，2009)和体内(barker等，2007；shyer等，2015)所描述的。通过对于分化的肠细胞的三种类型以特异性标记物免疫染色证实了isc的多能性：帕内特细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞(barker等，2007)(图5)。帕内特细胞(溶菌酶染色)大部分定位于隐窝底部，而杯状细胞(粘蛋白2染色)和肠内分泌细胞(嗜铬粒蛋白a)分散在整个肠管中并从隐窝底部排出。总而言之，这些结果表明，在具有预先定义的管状几何结构的工程化的3d基质中生长的isc能够自组织成管状肠上皮细胞，并且产生具有与在体内发现的相同的空间分布的肠分化细胞。
2.1.3.用几何学引导misc自组织成管状类器官
以前我们证实了在凝胶装载的微装置内的激光烧蚀管中通过小鼠肠干细胞自组织的管状类器官的发育。在这里，使用激光烧蚀在水凝胶基质中产生具有额外腔的管，我们进一步开发这一概念并证实干细胞可被诱导形成具有确定形状和大小的隐窝。
为了限制自发隐窝形成，选择20％基质胶/80％i型胶原凝胶(约1000pa)。在水凝胶中心的激光蚀刻微通道特征在于向外突出的特殊腔，模仿肠隐窝的几何结构。微通道的直径约为130μm，空腔深150μm，宽50μm(图7a)。将lgr5-egfp+isc作为高度浓缩的单细胞悬浮液移液到芯片的细胞入口中。1小时后，洗去非粘附细胞，在腔中仅留下小细胞集落。在最初的24小时内，细胞沉降在腔中并且连合地覆盖工程化的基板的表面。在接下来的12小时内，细胞覆盖具有连合单层的管的整个表面(图7a)。在最初的36小时内，我们在管内和储液器中保持自我更新培养基，并观察到lgr5-egfp+细胞沿着管随机分布。在管形成完成后，将芯片连接到微流体泵以允许连续灌注腔并去除死细胞。然后，为了诱导isc的分化，通过用分化培养基(enr培养基)替换培养基储液器中的自我更新培养基使细胞暴露于分化条件，这导致管腔中的上皮细胞与隐窝中的大多数细胞分化为lgr5-egfp阳性(图7b)。
5-6天后(自我更新条件下2-3天+分化条件下3天)，我们研究了肠管的细胞组成和结构。将样品固定并通过针对sox9、溶菌酶和l-fabp的抗体进行免疫染色，以分别可视化干/祖细胞、帕内特细胞和肠上皮细胞。
我们发现肠上皮细胞优先定位于腔中，而帕内特细胞优先定位于隐窝区(图7c)。隐窝区域中帕内特细胞的存在也与其维持干细胞和分泌微生物防御分子(例如防御素和溶菌酶)的生态位功能一致。
2.1.4.在管状基质微轨道中培养人ips细胞
我们指导肠干细胞自组织成预定形状的组织的方法可以扩展到不同来源的细胞。作为另外的例子，我们证明了来自人ips细胞的管状类器官的形成(图8)。
2.2.讨论
微加工允许研究人员以正确的规模顺序来构建空间，以根据体内有经验的结构定位单个细胞。微流体还提供了用于控制微米级生化信号传输和可用性的新工具。这里，发明人使用微加工结合3d基质微结构和微流体来创建源自isc的新的肠的类器官型培养系统。
在具有预定管状几何结构的工程化的3d基质中生长的isc能够自组织成管状肠上皮细胞，并产生具有与在体内发现的相同的空间分布的肠分化细胞。在明确定义的空间位置中来自isc的管状上皮片的产生，不仅与发育中的肠的生理片几何结构相匹配，而且还允许单个细胞的高分辨率延时成像，与分散的基质，高度流动的球状类器官相反。这将有助于阐明细胞在形状、极化和迁移方面的改变，以及肠发育过程中发生的潜在细胞机制。了解控制正常肠发育的机制至关重要，因为它可以提供洞察它们如何在肠系统病理学期间被破坏，包括结肠直肠癌。
此外，由于肠管覆盖基质隔室的整个长度，连接细胞的入口和出口，因此提供了通过微流体灌注进入肠腔的可能性。肠管的灌注将允许清除由正常肠再生引起的脱落的死细胞，并且更重要的是，将开启前所未有的机会以研究肠道药物吸收和代谢，以及与肠道细菌的共生或致病相互作用。最后，微流体的使用允许以低速率灌注，与体内观察到的灌注相匹配。生物分子从培养基储液器扩散到可渗透的ecm中，形成具有空间和时间分布的梯度，所述梯度可以通过改变储液器内的培养基组成来控制并用于指导培养中的肠形态发育和器官发生。
因此，该模型系统具有很高的生理意义，是解决与肠发育和体内平衡有关的问题的完美工具，可潜在用于再生医学、药物代谢和结肠直肠疾病治疗。
2.3.材料和方法
2.3.1.微装置设计和掩模制造
微装置由三个主要隔室组成：3d基质室和两个培养基储液器。800μm宽，2mm长的中心基质室夹在两个4mm宽的开放式培养基储液器中。基质室连接到一对用于细胞装载的入口/出口和一个额外的入口，基质从该额外的入口装载。隔室由120μm宽的相位导向功能隔开，可以使用专用材料单独装载隔室而不会溢出。相位导向功能由屏蔽顶部240μm高度的半壁，以及覆盖整个高度的柱子组成。在基质室和培养基储液器之间放置另外的120宽通道，以在3d基质完全聚合后除去残余空气。
设备布局使用专用软件(clewin，phoenixsoftware)绘制，并通过高分辨率基于激光的方法在玻璃掩模上打印。简而言之，使用专用自动化系统(vpg200，heidelberg仪器)将设计的布局用具有2000nm分辨率的二极管激光器写入涂有铬和正性光致抗蚀剂(nanofilm)的玻璃板上。然后用显影剂(dv10，süssmicrotec)除去未曝光的光致抗蚀剂，然后用高氯酸、硝酸铈铵和水的酸/氧化剂溶液蚀刻下面的铬层。最后，用technistripp1316(microchemicals)显影所得的掩模，以除去残留的抗蚀剂并用超纯水彻底洗涤。
2.3.2.软光刻和pdms模塑
使用常规的软光刻方法和聚(二甲基硅氧烷)(pdms)模塑制造微加工平台。模具由多层环氧基负性光致抗蚀剂su8制成，具有以下段落中描述的专用设计(图1a)。使用负性抗蚀剂涂布机(lms200，sawatec)，将240μm厚的su8gm1075(gerlteltec)光致抗蚀剂层浇铸到脱水硅晶片上。然后将晶片校准并通过第一掩模(ma6/ba6，süssmicrotec)暴露于uv。在95℃下烘烤后，如前所述旋涂第二层su8gm1075并通过第二掩模暴露于uv，使用专用校准标记仔细校准。在曝光后烘烤之后，用丙二醇甲醚醋酸酯(sigma)使晶片显影并在135℃下再次烘烤过夜。用表面光度仪(dektakxt，bruker)确认总su8层的厚度。然后将晶片等离子体活化并用蒸发的三氯(1h，1h，2h，2h-全氟辛基)硅烷(sigma)硅烷化过夜。
然后将微结构晶片用于模塑pdms(sylgard184，dowcornging)。将10重量份的弹性体基料与1份固化剂剧烈混合并倒在模具上。在真空下脱气后，将pdms在烘箱中70℃烘烤24小时。切割所得的pdms复制物，并用适当大小的活检穿孔机打孔(kaimedical)。然后将pdms芯片浸泡在一系列有机溶剂中以除去未反应的pdms大分子单体。随后将pdms芯片在搅拌下在三甲胺(millipore)中浸泡4小时，在乙酸乙酯(sigma)中浸泡4小时，然后在丙酮(vwrchemicals)中浸泡48小时，同时每12小时更新浴液。将得到的pdms芯片短暂暴露于氧等离子体并不可逆地粘合到玻璃基板上。将芯片用uv灭菌并在使用前保持在37℃和加湿的培养箱中。
2.3.3.细胞培养
将从lgr5-egfp-ires-creert25小鼠中提取并使用流式细胞术纯化获得单个gfphi细胞的lgr5-gfp+isc作为嵌入基质胶(bdbioscience)的isc集落进行常规培养，并处于自我更新条件下(enrcvmedia8：advanceddmem/f12培养基(invitrogen)补充1×谷氨酰胺，10mmhepes，100单位/ml青霉素+100μg/ml链霉素(gibco)，2％(v/v)b27补充剂(gibco)，1％(v/v)n2补充剂(gibco)，1μmn-乙酰半胱氨酸(sigma-aldrich)，含有生长因子50ng/mlegf，100ng/mlnoggin，1μg/mlr-脊椎蛋白1(epflproteinexpressioncorefacility)和小分子3μmchir99021(stemgent)和1mm丙戊酸(sigma-aldrich))。每隔一天添加生长因子和小分子，并且每4天更换整个培养基。为了传代，从基质胶中移除isc集落并机械离散成较小的集落，然后转移到新的基质胶中。每周进行一次传代，分流比为1：4。在培养期间，将isc维持在37℃，5％co2湿润空气中。
2.3.4.基质和基质激光微结构
将含有10％(v/v)天然牛真皮胶原i型溶液(根据制造商的试验方案(kouken)，将5mg/ml物料浓度用advanceddmem/f12培养基中和并重构为4％溶液)和90％(v/v)基质胶的ecm溶液通过基质上样入口注入到微装置的基质隔室中，并在37℃下温育5分钟，然后用enrcv培养基充满细胞上样入口和出口。
使用配备有10×/0.25na物镜的纳秒激光系统(1ns脉冲，100hz频率，355nm；palmmicrobeam激光显微切割系统(zeiss))，在10％胶原蛋白/90％基质胶3decm中烧蚀产生微轨道。在
2.3.5.肠管
对于单细胞离散，从基质胶中移除isc集落，并用含有2,000u/mldnasei(roche)，1mmn-乙酰半胱氨酸和10μmy27632的tryple表达溶液(invitrogen)在37℃下离散8分钟。离散细胞通过40μm细胞过滤器(falcon)并以106个细胞/ml的密度重悬于含有2.5μmthiazovivin(stemgent)的enrcv培养基中。从微装置的细胞入口和出口移除培养基后，向细胞的入口添加5μl细胞悬液，并允许细胞通过重力驱动的流动充满激光烧蚀微轨道。在第一分钟内，细胞流量最大，并且大多数细胞在此期间进入通道。随着细胞的入口和出口体积平衡，流量减少直至约10分钟后停止。此时，微通道中充满了大量的单个isc。然后用50μlenrcv培养基+2.5μmthiazovivin充满微装置培养基储液器，并置于37℃，5％co2湿润空气中。2小时后，用enrcv培养基+2.5μmthiazovivin将未连接的isc从微装置细胞入口和出口洗出，并再次置于37℃，5％co2湿润空气中。
2天后，微装置培养基储液器中和细胞的入口和出口中的培养基被分化培养基取代(enr培养基5，9：advanceddmem/f12培养基(invitrogen)，补充有1×谷氨酰胺，10mmhepes，100单位/ml青霉素+100μg/ml链霉素(gibco)，2％(v/v)b27补充剂(gibco)，1％(v/v)n2补充剂(gibco)，1μmn-乙酰半胱氨酸(sigma-aldrich)，并含有生长因子50ng/mlegf，100ng/mlnoggin，1μg/mlr-脊椎蛋白1(epflproteinexpressioncorefacility))，和使isc在37℃，5％co2湿润空气中分化3天。
2.3.6.3d免疫荧光染色
将肠管在室温下在4％pfa中固定30分钟。用pbs冲洗后，在室温下用0.2％tritonx-100+1％bsa在pbs中透析细胞1小时，同时搅拌。用pbs冲洗后，将细胞与在pbs中稀释的针对溶菌酶(pierce)、粘蛋白2(santacruz)和嗜铬粒蛋白a(santacruz)的一抗在4℃温育过夜。用0.05％tween20在pbs中洗涤细胞3×1小时，然后与在pbs中稀释的适当的alex缀合的二抗、alexa-缀合的鬼笔环肽和dapi(分子探针)在4℃温育过夜。在加入封固剂(prolongdiamond，分子探针)之前，在搅拌下用pbs中的0.05％吐温20进一步洗涤细胞3×1小时。
2.3.7.显微和成像处理
用配备有10×/0.30na和20×/0.80na空气物镜，405nm，488nm和555nm激光器并由zen2009成像软件(zeiss)控制的倒置共聚焦显微镜(invertzeissaxioobserverz1)对肠管成像。以10或4μm的间隔获得z切片。使用imagej(开放源)最大限度地投影zstack以创建2d图像，并使用photoshopcc(adobe)进一步处理，其中仅使用标准对比和强度级别调整。
2.3.8来源于人ips的肠类器官细胞培养
如前所述产生来源于人ips的肠的类器官(hannan，n.r.等，generationofmultipotentforegutstemcellsfromhumanpluripotentstemcells.stemcellreports1，293-306，doi：10.1016/j.stemcr.2013.09.003(2013))。简而言之，如下在完全扩增培养基(hio培养基)中维持和扩大类器官，所述培养基由含有谷氨酰胺、hepes、青霉素/链霉素、n2(lifetechnologies)、b27(lifetechnologies)、n-乙酰半胱氨酸(1mm；sigma)、egf(50ng/ml；r&d)、noggin(100ng/ml；内部生产)和r-脊椎蛋白(500ng/ml；内部生产)、烟酰胺(10mm，sigma)、a83-01(500nm，tocris)、前列腺素-e2(2.5μm；tocris)、wnt3a(100ng/ml；r&d)和y-27632(10μm，abmole)的advanceddmem/f12组成。每2-3天更换培养基，每7-10天传代细胞。
为了制备样品，从基质胶中移除人ipsc集落，并用含有2,000u/mldnasei(roche)、1mmn-乙酰半胱氨酸和10μmy27632的tryple表达溶液(invitrogen)在37℃离散成单细胞持续8分钟。将离散的细胞通过40μm细胞过滤器(falcon)，以1000rpm离心4分钟，然后以106细胞/ml的密度重悬于hio培养基中。从微装置细胞入口移除培养基后，向每个入口添加5μl细胞悬浮液，并允许细胞通过重力驱动的流动充满激光烧蚀的微轨道。在第一分钟内，细胞流量最大，并且大多数细胞在此期间进入微轨道。10分钟后，微轨道中充满了大量的单个细胞。然后用hio培养基充满培养基储液器，并将微装置置于37℃，5％co2湿润空气中。1小时后，通过流动的hio培养基将未附着的细胞从细胞入口和微轨道中洗脱，并将微装置再次置于37℃，5％co2湿润空气中。在最初的48小时期间，细胞沉淀在腔中并且连合地覆盖了经生物工程改造的生态位的表面。在接下来的几天内，细胞覆盖具有连合单层管的整个表面(图8)。
实施例3.工程肠表面
3.1.引言
通过肠上皮细胞和其他肠内驻留细胞(例如免疫细胞和微生物组的组分)之间的连续相互作用的适当模型来改善肠疾病的功能相关模型。这种相互作用的模型需要连续的单层上皮细胞。一项研究试图通过在transwell插入物的ecm包被的表面上培养isc来产生这种单层(wang等，2015)。然而，这些培养物中的细胞未能覆盖膜的整个表面以形成连续的单层。
3.2.结果
3.2.1.形成isc的连续层
发明人假设为了在表面上形成连续的单层，isc需要在接种到表面上的最初几小时内形成细胞-细胞接触，以避免细胞死亡和/或分化。因此，本发明人以非常高的密度将isc接种到基质胶表面上，使得相邻细胞在接种后立即建立接触。这产生了细胞层，该细胞层存活长达4-6天并且自发地开始形成零星的隐窝样内陷(图5a和5b)。
3.2.2.形成具有肠样微拓扑的连续细胞层
然后将该方法与实施例1和2中描述的形貌方法相组合。特别地，将isc以高密度接种到具有模拟肠的干细胞生态位的微观形貌的微孔中(图5c)。示例性形貌结构如图5d所示。将细胞以高密度接种到具有肠样微观形貌的水凝胶上(图5e)，并在增殖条件下培养1-2天，直至它们覆盖水凝胶的整个表面。然后将培养物转换为分化条件。在分化条件下培养2天后仍在隐窝内观察到lgr5-gfp表达，证明干细胞群体维持在层内(图5f，g)。与肠细胞组合物的体内研究一致，上皮层主要由肠上皮细胞组成，散布有少量的杯状细胞和肠内分泌细胞(图5g)。隐窝还表现出经典的肠隐窝形状(图5h-j)。
筛选不同的微孔直径以鉴定大小对misc自组织成隐窝的影响(图5k)。平均而言，对于微孔直径在45-55μm范围内发现隐窝形成的显著更高效率，isc在超过75％的所有微孔中形成隐窝。对于40μm微孔，我们观察到隐窝形成的效率仅为17％，而30μm仅为11％。大于60μm的微孔也不利于隐窝形成；只有在少量微孔中，细胞才能渗透到微孔底部并在基质内形成隐窝样结构。
干细胞能够在3d矩阵内自组织成捕获真实组织的几个方面的结构，但是这种能力限于微观水平。也就是说，在完全相同的培养条件下获得的类器官就其隐窝数、大小和形状而言是非常不均匀的。在成体器官中，以及在发育过程中，(定型的)干细胞与周围组织发生串扰，从而在宏观尺度上指导它们的自组织。通过信号分子的分泌，相邻细胞之间的生化交流已被广泛研究。除此之外，细胞之间的物理相互作用在调节器官发生中也扮演着重要的角色。实际上，干细胞需要外部物理指导才能自组织成适当组织化的、宏观的和功能性组织。这些发现与实施例1一起表明精确几何结构对指导干细胞自组织的重要影响。
3.2.3.微流体芯片上的工程化肠表面
已经设计了各种基于细胞的系统用于培养肠上皮细胞。特别是，transwell插入物已成为用于研究上皮细胞运输、吸收和分泌的黄金标准。在经典的transwell共培养装置中，在多孔膜上生长连合的上皮细胞层，形成transwell插入物的底部。将插入物置于6、12或24孔板的孔内(图6a)，并将培养基分离在装置的上部和下部隔室中。因此，插入物在单层细胞的顶侧和基底侧为培养基提供方便且独立的通道。
transwell提供一种多功能工具，可用于研究跨单层细胞的运输。然而，它们昂贵并且不适于对活的肠的动态活性微环境进行建模，因为它们不能用于复制对正常肠道生理学至关重要的正常动态过程，包括腔内流体流动和蠕动运动。transwell的静态性质还导致插入物中废物积累和ph漂移，从而防止细胞层表面上的活的微生物长时间培养。
微流体基于细胞的系统可以克服这些限制，并为快速有效的营养吸收试验提供更好的工具。然而，这些装置以前仅用于生长上皮细胞系，例如人结肠直肠腺癌细胞系caco-2。这些细胞缺乏肠粘膜中发现的异质性，限制了它们在肠疾病和功能的研究中的应用。因此，如实施例4(图6b)所述，发明人设计了用于使来自isc的工程化肠表面生长的微流体芯片。
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