一种重组人粒细胞集落刺激因子的复性及纯化方法与流程

本发明涉及生物医药及生物工程下游蛋白纯化领域，具体涉及一种重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF)的复性及纯化方法。

背景技术：

人粒细胞集落刺激因子(human granulocyte colony stimulating factor，hG-CSF)是一种在哺乳动物中调节粒细胞(尤其是中性粒细胞)成熟与生长的造血生长因子。它通过刺激粒细胞巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)向粒细胞集落形成单位(CFU-G)的分化和成熟，促进成熟中性粒细胞向外周血的释放，从而促进中性粒细胞的生长。在临床上用来治疗各种原因引起的中性粒细胞减少症，有很大的经济和社会意义。

1985年Welte.K成功的从人膀胱癌细胞株5637的培养上清液中纯化并精制出人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)，然后Welte.K与美国的AMGEN公司的Souza.L.M又进一步确定这种hG-CSF的N端氨基酸排列顺序，并将来源于5637细胞株的hG-CSF基因克隆化，采用基因工程技术将该基因插入大肠杆菌得到hG-CSF，开发出了重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)，商品名为Filgratin(惠尔血)。

由于hG-CSF的来源非常有限，因此大规模工业化生产均采用基因工程的方法获得。目前国内外制药企业大多采用应用广泛的大肠杆菌系统来表达rhG-CSF。由于大肠杆菌细胞内的还原环境不利于二硫键的形成，rhG-CSF折叠错误，容易聚集，基本以无生物活性的包涵体形式存在于细胞中，需要经过变性和复性才能获得有活性的rhG-CSF。由于复性后的样品中存在大量的宿主细胞蛋白及其他相关杂质，因此，复性后的蛋白纯化至关重要。

目前，专利技术对rhG-CSF的复性方法报道很多，但都不能保证纯化工艺操作简便、时间短的同时，复性率高、复性时包涵蛋白体浓度高、纯度高。

CN1718739A报道了采用SP Sepharose High Performance(SP HP)直接对rhG-CSF复性液纯化的方法，但包涵体复性液中除了目的蛋白外，还含有一定量的宿主蛋白、脂类和脱氧核糖核酸(DNA)。SP HP填料的粒径很小，不适合用于含有较多杂质、情况复杂的复性液，而且流速慢，工艺操作时间长。

CN107188952A报道了粗包涵体经变性溶解再经过超滤等置换步骤后进行复性，最后进行Capto MMC层析纯化。但该方法实施需要置换步骤，操作复杂、时间长，且复性时包涵蛋白体浓度低、复性率低。

针对上述存在的问题，开发一种rhG-CSF复性操作简便、时间短，并且复性时包涵蛋白体浓度高、纯度高、复性率高的复性纯化工艺是十分必要的。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决以上现有技术的不足而提供一种重组人粒细胞集落刺激因子的复性及纯化方法。

本发明的技术方案为：一种重组人粒细胞集落刺激因子的复性及纯化方法，包括：

1)将重组人粒细胞集落刺激因子包涵体用裂解液溶解，加入DTT，得到包涵体溶解液；

2)将包涵体溶解液加入到复性缓冲液中，加入胱氨酸和半胱氨酸，进行复性，得到重组人粒细胞集落刺激因子复性液；

3)将重组人粒细胞集落刺激因子复性液上样至复合配基的弱阳离子层析柱进行纯化。

步骤1)中所述的重组人粒细胞集落刺激因子包涵体与裂解液的固液比为1g：(5～10)mL。

步骤2)中所述的复性缓冲液由水、精氨酸、尿素、EDTA-2Na、Tris、pH调节剂组成；或者由水、精氨酸、尿素、EDTA-2Na、Tris、山梨醇、pH调节剂组成。

复性缓冲液中精氨酸的含量为5wt％～25wt％；优选地，精氨酸的含量为5wt％～10wt％或8wt％～13wt％或10wt％～15wt％或13wt％～18wt％或15wt％～20wt％或18wt％～23wt％或20wt％～25wt％。

复性缓冲液中尿素的浓度为1～3mol/L；优选地，尿素的浓度为1～2mol/L或1.5～2.5mol/L或2～3mol/L。

复性缓冲液中EDTA-2Na的浓度为1～3mmol/L；优选地，EDTA-2Na的浓度为1～2mmol/L或1.5～2.5mmol/L或2～3mmol/L。

复性缓冲液中Tris的浓度为0.05～0.15mol/L；优选地，Tris的浓度为0.05～0.08mol/L或0.07～0.10mol/L或0.09～0.12mol/L或0.11～0.14mol/L或0.13～0.15mol/L。

复性缓冲液pH调节剂选自HCl和/或NaOH。复性缓冲液的pH为8.0～9.5。当复性缓冲液中含有山梨醇时，山梨醇的含量不高于10wt％；优选地，山梨醇的含量不高于8wt％；更优选地，山梨醇的含量不高于5wt％；更进一步优选地，山梨醇的含量为0.01wt％～5wt％。

示例性地，复性缓冲液的组成可以为(水溶液)：

8wt％精氨酸，2mol/L尿素，2mmol/L EDTA-2Na，0.1mol/L Tris，pH9.0；或

15wt％精氨酸，5wt％山梨醇，1mol/L尿素，3mmol/L EDTA-2Na，0.05mol/L Tris，pH8.0；或

8.5wt％精氨酸，2mol/L尿素，2mmol/L EDTA-2Na，0.1mol/L Tris，pH为9.0；或

5wt％精氨酸，1mol/L尿素，2mmol/L EDTA-2Na，0.1mol/L Tris，pH9.0；或

8wt％精氨酸，3mol/L尿素，1mmol/L EDTA-2Na，0.15mol/L Tris，pH9.0；或

13wt％精氨酸，1mol/L尿素，3mmol/L EDTA-2Na，0.05mol/L Tris，pH9.0。

步骤2)所述的加入胱氨酸至终浓度为0.8～2mmol/L，加入半胱氨酸至终浓度为0.1～1mmol/L。

优选地，步骤2)中所述的加入胱氨酸至终浓度为0.9～1.5mmol/L，加入半胱氨酸至终浓度为0.2～0.7mmol/L。

步骤(2)中，将包涵体溶解液加入到复性缓冲液前，将复性缓冲液的温度调节至2～12℃；优选地，将复性缓冲液的温度调节至2～6℃或4～8℃或6～10℃或8～12℃。

步骤1)所述的裂解液由水、盐酸胍、Tris、pH调节剂组成。

裂解液中盐酸胍的浓度为4～8mol/L；优选地，盐酸胍的浓度为4～6mol/L或5～7mol/L或6～8mol/L。

裂解液中Tris的浓度为0.05～0.15mol/L；优选地，Tris的浓度为0.05～0.08mol/L或0.07～0.10mol/L或0.09～0.12mol/L或0.11～0.14mol/L或0.13～0.15mol/L。

裂解液中pH调节剂选自HCl和/或NaOH。裂解液的pH为7.0～9.5；优选地，pH值为7.0～8.0或7.5～8.5或8.0～9.0或8.5～9.5。

示例性地，裂解液的组成可以为(水溶液)：

6mol/L盐酸胍，0.15mol/L Tris，pH为8.0；或

5mol/L盐酸胍，0.1mol/L Tris，pH9.0；或

6mol/L盐酸胍，0.1mol/L Tris，pH8.0。

步骤1)中，加入DTT至终浓度为1～20mmol/L；优选地，加入DTT至终浓度为5～10mmol/L或9～14mmol/L。

步骤3)所述的复合配基的弱阳离子填料选自Capto MMC填料、Generic MC-CM填料或Eshmuno HCX填料；优选Capto MMC填料。

本发明所述方法还包括在层析上样前对重组人粒细胞集落刺激因子复性液进行pH调节，过滤步骤。所述的复性液pH调节至3～5；优选地，pH调节至3.5～4.5；更优选地，pH调节至3.6～4.0或3.8～4.2或4.0～4.4。

本发明所述方法还包括在层析上样前将层析柱经平衡液平衡步骤。本发明所述方法还包括在层析上样后用平衡液进行第一次淋洗，用淋洗液进行第二次淋洗，用洗脱液进行洗脱步骤。步骤3)中平衡液是由水、氯化钠、磷酸盐、pH调节剂组成。平衡液中氯化钠浓度为100～300mmol/L；优选地，氯化钠浓度为100～200mmol/L或150～250mmol/L或200～300mmol/L。平衡液中磷酸盐浓度为0.05～0.15mol/L；优选地，磷酸盐浓度为0.05～0.10mol/L或0.08～0.12mol/L。平衡液中pH调节剂选自HCl和/或NaOH。平衡液的pH为3.5～4.5；优选地，pH为3.5～4或3.8～4.3或4～4.5。

步骤3)中淋洗液是由水、氯化钠、磷酸盐、pH调节剂组成。淋洗液中氯化钠浓度为180～200mmol/L；优选地，氯化钠浓度为200mmol/L。淋洗液中磷酸盐浓度为0.08～0.12mol/L；优选地，磷酸盐浓度为0.1mol/L。淋洗液中pH调节剂选自HCl和/或NaOH。淋洗液的pH为5～6；优选地，pH为5～5.5或5.2～5.8或5.5～6。

步骤3)中洗脱液是由水、氯化钠、磷酸盐、pH调节剂组成。洗脱液中氯化钠浓度为280～320mmol/L；优选地，氯化钠浓度为300mmol/L。洗脱液中磷酸盐浓度为0.08～0.12mol/L；优选地，磷酸盐浓度为0.1mol/L。洗脱液中pH调节剂选自HCl和/或NaOH。洗脱液的pH为6～7；优选地，pH为6～6.5或6.2～6.8或6.5～7.0。

本发明中，磷酸盐为磷酸的钠盐或磷酸的钾盐；优选地，磷酸盐为磷酸的钠盐。磷酸的钠盐选自磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或多种；磷酸的钾盐选自磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或多种。

具体而言，本发明提供了一种重组人粒细胞集落刺激因子的复性及纯化方法，包括：

a)将重组人粒细胞集落刺激因子包涵体用裂解液溶解，加入DTT至终浓度为1～20mmol/L，得到包涵体溶解液；

b)将包涵体溶解液加入到预冷至2℃～12℃的复性缓冲液中，加入胱氨酸至终浓度为0.8～2mmol/L，加入半胱氨酸至终浓度为0.1～1mmol/L，进行复性，得到重组人粒细胞集落刺激因子复性液；

c)将重组人粒细胞集落刺激因子复性液进行pH调节，过滤；

d)用平衡液平衡层析柱；

e)将步骤c)得到的过滤后的重组人粒细胞集落刺激因子复性液上样至复合配基的弱阳离子层析柱进行纯化；

f)再进行第一次淋洗和第二次淋洗，最后洗脱、收集洗脱峰；

其中，步骤b)中的复性缓冲液为：5wt％～25wt％精氨酸，1～3mol/L尿素，1～3mmol/L EDTA-2Na，0.05～0.15mol/L Tris，pH为8.0～9.5。

步骤a)中所述的裂解液为：5～7mol/L盐酸胍，0.05～0.15mol/L Tris，pH为7.0～9.5。

步骤a)中所述的重组人粒细胞集落刺激因子包涵体与裂解液的固液比为1g：(5～10)mL。

所述的复合配基的弱阳离子填料选自Capto MMC填料、Generic MC-CM填料或Eshmuno HCX填料；优选Capto MMC填料。

步骤f)中所述的第一次淋洗为用平衡液淋洗层析柱，第二次淋洗为用淋洗液淋洗层析柱。

所述的平衡液为150～250mmol/L氯化钠，0.08～0.12mol/L磷酸氢二钠，pH为3.5～4.5，所述的淋洗液为180～200mmol/L氯化钠，0.08～0.12mol/L磷酸盐，pH为5～6，所述的洗脱液为280～320mol/L氯化钠，0.08～0.12mol/L磷酸盐，pH为6～7。

本发明中EDTA-2Na中文名为乙二胺四乙酸二钠，Tris中文名为三(羟甲基)氨基甲烷，DTT中文名为二硫苏糖醇。

有益效果：

1、本发明方法的实施无需置换等其他步骤，操作简便、工艺用时短，同时设备要求不高，节约成本，适合放大的生产规模；

2、复性时包涵蛋白体浓度高，将包涵体溶解液加入复性缓冲液中，可以使包涵蛋白体浓度达到1.2～1.5g/L，是现有方法包涵蛋白体浓度的4～5倍；

3、本发明方法层析纯化后蛋白纯度高，SEC-HPLC法测得rhG-CSF原液纯度达99.7％以上；

4、本发明方法重组人粒细胞集落刺激因子包涵体复性率高，复性率高于45％，可以达到复性率为65％～85％。

附图说明

图1为实施例一制备的pET-9a-G-CSF的质粒图谱；

图2为实施例一纯化后的rhG-CSF的生物学活性图，其中RS为标准品。

具体实施方式

以下实施例用于详细描述本发明的内容，而不是对本发明保护范围的限制。实际应用中rhG-CSF工程菌株较多，构建方法可参考《G-CSF-pJGW1/pGP1-2/DH5α工程菌的系统稳定性研究》(解放军广州医高专学报，黄树其等，1997.12.25)、《G-CSF工程菌在IPTG和乳糖诱导下表达结果比较》(黑龙江医药，李郑武等，1998.4.30)等报道。本发明使用的rhG-CSF工程菌株为申请人构建菌株。

实施例一：pET-9a-G-CSF原核表达菌株的构建

人G-CSF基因序列如SEQ ID No.1所示。按照常规分子克隆方法合成序列如SEQ ID No.1所示的人G-CSF基因并引入终止子TAA及目的基因两端NdeI和BamHI酶切位点；用NdeI和BamHI对原核表达质粒载体pET-9a和人G-CSF基因片段分别双酶切，将双酶切后的pET-9a和人G-CSF基因片段连接，得到pET-9a-G-CSF重组质粒(如图1)后转化入E.coli DH5α菌株中。

将含有pET-9a-G-CSF重组质粒的E.coli DH5α菌株以1％的接种量接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在37℃下摇床(180rpm)培养过夜，使用质粒无内毒素中提试剂盒(购自Biomega公司)提取纯化质粒，纯化后的质粒按照《分子克隆》中的转化方法导入E.coli BL21(DE3)(购自Invitrogen公司)，再使用含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板筛选阳性克隆。选择10个阳性克隆单菌落，标记后分别接种于SuperBroth培养基(含有50μg/mL卡那霉素，4.1％SuperBroth，1g/L乳糖)中，在37℃下摇床(180rpm)培养20～24小时。取500μL菌液于3500rpm离心弃上清后收集菌泥，用1mL PBS重悬菌泥，取重悬后的菌悬液15μL，加入15μL 2×上样缓冲液(Loading Buffer)，置沸水浴5min，于10000rpm离心5min，取上清15μL进行SDS-PAGE整菌电泳，电泳条件为：4.5％浓缩胶100v电泳10min，15％分离胶120v电泳至溴酚蓝到凝胶底部，停止电泳。结束后，用考马斯亮蓝染色30min，再脱色3h，上BIO-RAD凝胶成像系统检测G-CSF表达量。选择表达量最大为40％的菌种进行PCR及测序鉴定，并将其命名为E.coliBL21(DE3)-pET-9a-G-CSF。

实施例二：

1、制备rhG-CSF复性液

工艺所用菌株为实施例一中pET9a/G-CSF质粒转化的大肠杆菌DH5α菌株。经发酵后，收集菌体，利用高压均质机进行细胞破碎，离心获得粗包涵体，再对粗包涵体进行洗涤、离心获得初步纯化的包涵体。

取初步纯化的包涵体60g，按固液比1:10(g/mL)的比例用包涵体裂解液(6mol/L盐酸胍，0.15mol/L Tris，pH8.0)进行变性溶解，室温搅拌至澄清透明后加入DTT(二硫苏糖醇)至终浓度为7mmol/L，继续搅拌30min以上，经0.22μm滤器过滤后，获得包涵体溶解液。

将包涵体溶解液缓慢泵入10L预冷至8℃的复性缓冲液(8wt％精氨酸，2mol/L尿素，2mmol/L EDTA-2Na，0.1mol/L Tris，pH9.0)中，(通过测定包涵体溶解液中包涵蛋白体浓度，计算加入包涵体溶解液的体积)使得包涵蛋白体浓度为1.2～1.5g/L，加入胱氨酸至终浓度为1.2mmol/L和半胱氨酸至终浓度为0.3mmol/L，于12℃、120rpm条件下搅拌，复性18h。2、rhG-CSF的Capto MMC层析

将复性后的rhG-CSF溶液用冰醋酸调节pH至4.0，静置30min后，经孔径为(8+1.2)μm滤器过滤；

消毒：用0.8mol/L氢氧化钠消毒层析介质30min以上，流速60cm/h；

平衡：用平衡液(200mmol/L氯化钠，0.1mol/L磷酸氢二钠，pH4.5)平衡层析柱，流速100～200cm/h，直至pH、电导平稳；

上样：将过滤后的复性液上样，流速100～200cm/h，保留时间≥4min；

第一次淋洗：上样完成后，用平衡液再次淋洗层析柱，至紫外平稳；

第二次淋洗：用淋洗液(200mmol/L氯化钠，0.1mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠，pH6)淋洗层析柱，至pH6；

洗脱：用洗脱液(300mol/L氯化钠，0.1mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠，pH6.5)洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，流速100～200cm/h。

3、样品检测

(1)SEC-HPLC

色谱柱：亲水硅胶分子筛柱(TSK-Gel G3000SWXL 7.8×300mm，5μm，250A)

流动相：磷酸盐缓冲液调节pH至6.9，用0.22μm滤膜过滤

波长：214nm；柱温：25℃；流速：0.5ml/min；样品池温度：2～8℃；上样量：30μg

采用SEC-HPLC法进行rhG-CSF原液纯度检测，分析检测结果，rhG-CSF原液的纯度为99.7％。

(2)活性测定

以重组人粒细胞集落刺激因子国家标准品为活性标准品，按照说明书溶解。

取标准品(RS)和本发明获得的rhG-CSF原液，在96孔培养板中，用基础培养液将标准品稀释至2000IU/mL，样品稀释至20000pg/mL，再进行3倍梯度稀释。取培养的M-NFS-60( CRL-1838^TM)细胞，用RPMI-1640培养基1200rpm离心7分钟，重复3遍，最后用基础培养基悬浮细胞并计数，并配制成2×10⁵个/mL的细胞悬液。在每孔50μL标准品/rhG-CSF原液中加入50μL细胞悬液，于37℃、5％CO2(c/c)条件下培养36～48h。然后每孔加入10μL CCK-8，于37℃、5％CO2(c/c)条件下继续培养4h。

设置酶标仪(BioTekSynergyH1)450nm为测定波长(参比波长630nm，根据酶标仪型号进行设置)测得吸收值，计算获得rhG-CSF原液的比活性。

采用M-NFS-60细胞/CCK-8测定法测定rhG-CSF原液的生物学活性，计算获得比活性为8×10⁷IU/mg。本发明测得的比活性高于《中华人民共和国药典2015版》第三部“重组人粒细胞刺激因子注射液”项下原液检定的要求。

实施例三：

1、制备rhG-CSF复性液

工艺所用菌株为pET9a/G-CSF质粒转化的大肠杆菌DH5α菌株。经发酵后，收集菌体，利用高压均质机进行细胞破碎，离心获得粗包涵体，再对粗包涵体进行洗涤、离心获得初步纯化的包涵体。

取初步纯化的包涵体60g，按固液比1:10(g/mL)的比例用包涵体裂解液(5mol/L盐酸胍，0.1mol/L Tris，pH9.0)进行变性溶解，室温搅拌至澄清透明后加入DTT(二硫苏糖醇)至终浓度为10mmol/L，继续搅拌30min以上，经0.22μm滤器过滤后，获得包涵体溶解液。

将包涵体溶解液缓慢泵入10L预冷至10℃的复性缓冲液(15wt％精氨酸，5wt％山梨醇，1mol/L尿素，3mmol/L EDTA-2Na，0.05mol/L Tris，pH8.0)中，使得包涵蛋白体浓度为1.2～1.5g/L，加入胱氨酸至终浓度为1.5mmol/L和半胱氨酸至终浓度为0.5mmol/L，于10℃、120rpm条件下搅拌，复性18h。

2、rhG-CSF的Capto MMC层析

将复性后的rhG-CSF溶液用冰醋酸调节pH至4.0，静置30min后，经孔径为(8+1.2)μm滤器过滤；

消毒：用1mol/L氢氧化钠消毒层析介质30min以上，流速60cm/h；

平衡：用平衡液(180mmol/L氯化钠，0.08mol/L磷酸氢二钠，pH4)平衡层析柱，流速100～200cm/h，直至pH、电导平稳；

上样：将过滤后的复性液上样，流速100～200cm/h，保留时间≥4min；

第一次淋洗：上样完成后，用平衡液再次淋洗层析柱，至紫外平稳；

第二次淋洗：用淋洗液(180mmol/L氯化钠，0.12mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠，pH5.5)淋洗层析柱，至pH5.5；

洗脱：用洗脱液(280mol/L氯化钠，0.1mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠，pH7)洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，流速100～200cm/h。

3、样品检测

(1)SEC-HPLC

检测方法同实施例二，经检测rhG-CSF原液的纯度为99.8％。

(2)活性测定

测定方法同实施例二，经计算获得比活性为9×10⁷IU/mg。

实施例四：

1、工艺所用菌株为pET9a/G-CSF质粒转化的大肠杆菌DH5α菌株。经发酵后，收集菌体，利用高压均质机进行细胞破碎，离心获得粗包涵体，再对粗包涵体进行洗涤、离心获得初步纯化的包涵体，取初步纯化的包涵体60g，溶于600mL包涵体裂解液(6mol/L盐酸胍，0.1mol/L Tris，pH8.0)，置于磁力搅拌器上搅拌至澄清透明的黄色；取1mL溶液，用于包涵蛋白体纯度测定(即目的蛋白所占的比例，HPLC法)

2、取出1mL步骤1制备的包涵体溶解液，用于包涵蛋白体纯度测定，然后加入二硫苏糖醇(DTT)至终浓度为5mmol/L，继续搅拌至少30min；

3、经过0.22μm过滤后，测定包涵体溶解液蛋白浓度(即溶液中总蛋白的含量，UV法，λ＝280nm)，取出含有12g目的蛋白包涵体溶解液，泵入10L预冷的复性缓冲液(8.5wt％精氨酸，2mol/L尿素，2mmol/L EDTA-2Na，0.1mol/L Tris，pH9.0)中；

4、然后先加入24mL胱氨酸溶液，等待3min后加入3mL半胱氨酸溶液，再等待3min后加入5mL胱氨酸溶液，于转速120rpm、温度10～12℃条件下，开始复性；

5、复性18h后，将复性液从复性罐泵出，取出1mL复性液加入40μL冰醋酸，测定复性率(例如活性法、反相HPLC法)。

经检测：包涵蛋白体纯度为86％，包涵体复性率为80％。

实施例五：

本实施例研究了不同比例的复性缓冲液对重组人粒细胞集落刺激因子包涵体复性率的影响，复性率检测过程如实施例四。本实施例实验设计与结果见表1。

表1

本发明中复性率大于45％即视为合格。

本发明方法层析纯化后蛋白纯度高，SEC-HPLC法测得rhG-CSF原液纯度达99.7％以上，包涵体复性率高，同时操作简便、工艺用时短，设备要求不高，节约成本，适合放大的生产规模。

序列表

<110> 江苏奥赛康药业股份有限公司

<120> 一种重组人粒细胞集落刺激因子的复性及纯化方法

<141> 2018-01-16

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 525

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa 60

gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggaga agctgtgtgc cacctacaag 120

ctgtgccacc ccgaggagct ggtgctgctc ggacactctc tgggcatccc ctgggctccc 180

ctgagcagct gccccagcca ggccctgcag ctggcaggct gcttgagcca actccatagc 240

ggccttttcc tctaccaggg gctcctgcag gccctggaag ggatctcccc cgagttgggt 300

cccaccttgg acacactgca gctggacgtc gccgactttg ccaccaccat ctggcagcag 360

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ctggaggtgt cgtaccgcgt tctacgccac cttgcccagc cctga 525