本发明属于蛋白质分离纯化的技术领域，涉及一种人参茎叶蛋白的提取方法。
背景技术：
人参属于五加科人参属，为多年生宿根草本植物，古代人参的雅称为黄精、地精、神草。人参主要产于我国东北地区，是“关东三宝”之一，是驰名中外、老幼皆知的名贵药材和保健佳品，被称之为“百草之王”。
人参，包括根、茎、叶，全身是中药之宝。人参含有许多有效药用成分，包括人参多糖、皂苷、脂肪酸、甾醇、维生素、挥发油、蛋白质、多肽等多种成分。近年来，人们对于人参成分的分离纯化进行了很多的研究，并取得了很大的进展，但是对于人参中蛋白质的研究涉及较少。
蛋白质在生命活动的过程中起着十分重要的作用，存在于所有的动植物中。目前人们主要从人参根部提取人参蛋白，对于从人参茎叶中提取人参蛋白的研究较少。
技术实现要素：
本发明的目的是开发一种新的简便的、提取率高的提取人参蛋白的方法：以人参茎叶为原料，通过有机溶剂除杂、缓冲液浸提、冷丙酮静置、蒸馏水重溶、真空冷冻干燥等方法提取人参茎叶蛋白。
提取人参茎叶蛋白的具体技术方案如下。
一种人参茎叶蛋白的提取方法，有蛋白提取过程、冷丙酮静置及蒸馏水重溶过程和后处理过程；
所述的蛋白提取过程，是将人参茎叶粉末加入到pH＝7.4～7.8的磷酸盐缓冲液中浸提5～10小时，离心得到上清液和沉淀，其中人参茎叶粉末与磷酸盐缓冲液的质量体积比(g/mL)为1:10～20；再将沉淀加入到pH＝7.4～7.8的磷酸盐缓冲液中浸提5～10小时，离心收集上清液，其中沉淀与磷酸盐缓冲液的质量体积比(g/mL)为1:10～20；合并两次的上清液即为人参茎叶蛋白溶液；
所述的冷丙酮静置及蒸馏水重溶过程，是在人参茎叶蛋白溶液中加入5～10倍体积的冷丙酮，在-20℃下静置3～10小时，离心弃上清，将沉淀加入到蒸馏水中重新溶解，得到人参茎叶总蛋白溶液，其中蒸馏水用量为人参茎叶蛋白溶液体积的0.2～0.5倍；
所述的后处理过程，是将人参茎叶总蛋白溶液在-20℃下预冷5小时，再进行真空冷冻干燥，得到人参茎叶蛋白粉。
上述的磷酸盐缓冲液，可以是商品的1X PBS缓冲液，也可以自行配制。
在蛋白提取过程之前最好先进行除杂过程，所述的除杂过程，是将人参茎叶粉末加入到有机溶剂中，搅拌3～5小时，过滤保留滤渣，之后再将滤渣加入到pH＝7.4～7.8的磷酸盐缓冲液中浸提；所述的有机溶剂，是丙酮、无水乙醇或正己烷。
在除杂过程中，人参茎叶粉末与有机溶剂的质量体积比(g/mL)为1:10。优选的有机溶剂，是正己烷。
在冷丙酮静置及蒸馏水重溶过程中，所述的冷丙酮，可以是-20℃的丙酮。
所述的蛋白提取过程，优选的每次浸提时间均为10小时，优选的人参茎叶粉末、沉淀与磷酸盐缓冲液的质量体积比(g/mL)均为1:10；所述的冷丙酮静置及蒸馏水重溶过程，优选在人参茎叶蛋白溶液中加入5倍体积的冷丙酮在-20℃下静置3小时。
本发明方法可以得到人参茎叶蛋白粉；并且制备方法简便，提取率高，适用于工业化生产，可以用于功能食品的开发；人参茎叶价格比较低廉，利用人参茎叶提取人参蛋白能够降低生产成本，达到更高的经济效益。
附图说明
图1为本发明各实施例制备的人参蛋白SDS-PAGE图谱。
图1中，M为Marker；1为实施例1的图谱；2为实施例2的图谱；3为实施例3的图谱；4为实施例4的图谱。
具体实施方式
实施例1
1)将干燥的人参茎叶利用粉碎机粉碎得到人参粉末；
2)按照1:10的质量体积比(g/mL)加入丙酮，在室温下搅拌5小时，过滤得到滤液和滤渣；
3)收集滤渣，按照1:10的质量体积比(g/mL)加入pH＝7.4～7.8的1X PBS缓冲液，在室温下浸提10小时，离心得到上清液和沉淀；收集沉淀，按照1:20的质量体积比(g/mL)加入pH＝7.4～7.8的1X PBS缓冲液，进行第二次浸提5小时，离心收集上清液，合并两次的上清液即为人参茎叶蛋白溶液；
4)将得到的人参茎叶蛋白溶液加入5倍体积的-20℃的冷丙酮在-20℃下静置3小时，高速离心后，弃上清，沉淀加入适量蒸馏水(体积为人参茎叶蛋白溶液的0.2～0.5倍)重新溶解，得到人参茎叶总蛋白溶液。
5)先将人参茎叶总蛋白溶液在-20℃下预冷5小时，然后进行真空冷冻干燥即可得到人参茎叶蛋白粉。
利用Bradford法，可以测出人参茎叶蛋白的提取率为0.236％。
实施例2
本实施例是本发明的最佳实施例。
1)将干燥的人参茎叶利用粉碎机粉碎得到人参粉末；
2)按照1:10的质量体积比(g/mL)加入正己烷，在室温下搅拌3小时，过滤得到滤液和滤渣；
3)收集滤渣，按照1:10的质量体积比(g/mL)加入pH＝7.4～7.8的1X PBS缓冲液，在室温下浸提10小时，过滤得到上清液和沉淀；收集沉淀，按照1:10的质量体积比(g/mL)加入pH＝7.4～7.8的1X PBS缓冲液，进行第二次浸提10小时，离心收集上清液，合并两次的上清液即为人参茎叶蛋白溶液；
4)将得到的人参茎叶蛋白溶液加入5倍体积的-20℃的冷丙酮在-20℃下静置3小时，高速离心后，弃上清，沉淀加入适量蒸馏水(体积为人参茎叶蛋白溶液的0.2～0.5倍)重新溶解，得到人参茎叶总蛋白溶液。
5)先将人参茎叶总蛋白溶液在-20℃下预冷5小时，然后进行真空冷冻干燥即可得到人参茎叶蛋白粉。
利用Bradford法，可以测出人参茎叶蛋白的提取率为1.068％。
实施例3
1)将干燥的人参茎叶利用粉碎机粉碎得到人参粉末；
2)按照1:10的质量体积比(g/mL)加入无水乙醇，在室温下搅拌5小时，过滤得到滤液和滤渣；
3)收集滤渣，按照1:20的质量体积比(g/mL)加入pH＝7.4～7.8的1X PBS缓冲液，在室温下浸提5小时，过滤得到上清液和沉淀；收集沉淀，按照1:10的质量体积比(g/mL)加入pH＝7.4～7.8的1X PBS缓冲液，进行第二次浸提10小时，离心收集上清液，合并两次的上清液即为人参茎叶蛋白溶液；
4)将得到的人参茎叶蛋白溶液加入5倍体积的-20℃的冷丙酮在-20℃下静置10小时，高速离心后，弃上清，沉淀加入适量蒸馏水(体积为人参茎叶蛋白溶液的0.2～0.5倍)重新溶解，得到人参茎叶总蛋白溶液。
5)得到的人参茎叶总蛋白溶液先在-20℃下预冷5小时，然后进行真空冷冻干燥即可得到人参茎叶蛋白粉。
利用Bradford法，可以测出人参茎叶蛋白的提取率为0.248％。
实施例4
1)将干燥的人参茎叶利用粉碎机粉碎得到人参粉末；
2)按照1:10的质量体积比(g/mL)加入pH＝7.4～7.8的1X PBS缓冲液，在室温下浸提10小时，离心得到上清液和沉淀；收集沉淀，按照1:10的质量体积比(g/mL)加入pH＝7.4～7.8的1X PBS缓冲液，进行第二次浸提10小时，离心收集上清液，合并两次的上清液即为人参茎叶蛋白溶液；
3)将得到的人参茎叶蛋白溶液加入5倍体积的-20℃的冷丙酮在-20℃下静置10小时，高速离心后，弃上清，沉淀加入适量蒸馏水(体积为人参茎叶蛋白溶液的0.2～0.5倍)重新溶解，得到人参茎叶总蛋白溶液。
4)先将人参茎叶总蛋白溶液在-20℃下预冷5小时，然后进行真空冷冻干燥即可得到人参茎叶蛋白粉。
利用Bradford法，可以测出人参茎叶蛋白的提取率为0.836％。