本发明涉及一种水溶性紫杉醇抗癌药物的制备方法，属于医药领域。
背景技术：
癌症严重危胁着人类的健康与生命，目前癌症的致死率逐年上升。因此肿瘤的预防和治疗任务艰巨，目前化疗药物是治疗肿瘤的最有效的手段。
紫杉醇别名红豆杉醇，泰素，紫素，特素(结构如式1)，是目前已发现的最优秀的天然抗癌药物，在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分头颈癌和肺癌的治疗。紫杉醇作为一个具有抗癌活性的二萜生物碱类化合物，其新颖复杂的化学结构、广泛而显著的生物活性、全新独特的作用机制、奇缺的自然资源使其受到了植物学家、化学家、药理学家、分子生物学家的极大青睐，使其成为20世纪下半叶举世瞩目的抗癌明星和研究重点。
紫杉醇是从太平洋红豆杉的树皮中提取的一种四坏二萜类化合物，是抗癌的首选药物之一。紫杉醇抗肿瘤的机制为：在细胞有丝分裂期促进微管聚合和抑制微管解聚，从而抑制细胞有丝分裂，使细胞停留在g2和m期，达到抑制肿瘤生长的目的。紫杉醇为水难溶性药物，限制了其临床的广泛应用，目前临床上使用的紫杉醇针剂为
以前所做的克服严重副作用的尝试包括在各种载体例如聚合物缀合物，脂质体，聚合物胶束，乳液和纳米球中配制紫杉醇。紫杉醇脂质体具有类细胞结构，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高治疗指数。但仍面临一些问题。如其稳定性并未得到解决，保质期较短，贮存要求高。白蛋白结合型紫杉醇是一种以人血白蛋白作为药物载体与稳定剂的新型紫杉醇白蛋白冻干剂，去除了与有机溶剂相关的不良反应，提高了使用紫杉醇化疗时的安全性及量效关系。但注射用白蛋白结合型紫杉醇昂贵的价格限制了其在临床的应用。药物-聚合物共轭物与常规聚合物纳米载体相比具有显着的优点，表现出高的药物含量，在水中溶解度好，增加人体药物半衰期，增强抗肿瘤作用。虽然各种水溶性合成聚合物已被广泛用于疏水性药物的缀合，但具有固有细胞特异性结合能力的天然存在的聚合物具有作为靶特异性药物载体的巨大潜力。
由n-乙酰基-d-葡糖胺和d-葡萄糖醛酸组成的天然多糖的透明质酸(ha)与细胞特异性表面标志物如cd44和rhamm具有很强的亲合力。ha在生物功能上起着重要作用，如稳定和组织ecm，调节细胞粘附和运动，以及介导细胞增殖和分化。ha在许多类型的肿瘤中也与血管发生密切相关，其中ha受体(cd44和rhamm)在表面上大量过表达。因此，具有高转移活性的恶性细胞通常表现出ha的增强的结合和摄取。ha及其衍生物已广泛用作各种治疗剂的靶向特异性药物递送载体。透明质酸作为药用高分子材料，可以与紫杉醇偶合，形成前药。现有报道的该药物前体与透明质酸的结合，大多集中于将透明质的cooh进行修饰后与药物前体相连，透明质酸的羧酸部分是透明质酸受体cd44的识别位点，但是该处的位阻较大，不易与紫杉醇连接。现有的对ha羟基改性的方法，多为与烷基琥珀酸酐或甲基丙烯酸酐进行酯化，但是反应条件不易控制。并且meha的取代度(ds)较低，ds的取值范围也较窄，在一定程度上，酯化不足是导致meha水凝胶机械性能不能满足的主要原因之一。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明将透明质酸与二酸酐反应，在透明质酸的羟基处对透明质酸进行修饰，修饰后的透明质酸既能与受体cd44结合，又能与紫杉醇药物偶联。并且本发明的二酸酐改性方法具有高取代度和高性能。
本发明的第一个目的是提供一种紫杉醇(ptx)药物前体的制备方法，所述方法是通过二酸酐修饰透明质酸的羟基，然后再与紫杉醇药物耦联。
在本发明的一种实施方式中，所述紫杉醇药物前体的结构式如下所示：
在本发明的一种实施方式中，所述方法的具体步骤为：
(1)在溶剂存在下，将透明质酸与二酸酐按照一定摩尔比，反应生成透明质酸衍生物；
(2)透明质酸衍生物在缩合剂的存在下，与紫杉醇发生酯化反应，生成紫杉醇药物前体。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的溶剂为甲酰胺、二甲基甲酰胺、n-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮或六甲基磷酰三胺中的一种或两种以上组合。
在本发明的一种实施方式中，所述透明质酸与溶剂的比例为1:70～100(m/v)。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中二酸酐为马来酸酐、邻苯二甲酸酐、丁二酸酐或二甘醇酸酐。
在本发明的一种实施方式中，所述透明质酸与二酸酐的摩尔比为1:4～4:1。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)的反应条件为反应温度为40～60℃，反应时间为4～6h，反应结束后冷却至室温，用溶剂清洗后离心冻干。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中缩合剂为n,n’-二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基、三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐、4-二甲氨基吡啶、1-羟基苯并三唑、o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯或o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸中的一种或两种以上组合。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的反应条件为反应温度为30～50℃，反应时间为1～3天。
本发明的第二个目的是提供所述方法制备得到的紫杉醇药物前体。
本发明的第三个目的是提供所述的紫杉醇药物前体在制备前列腺药物中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述的紫杉醇药物前体由亲水基团与紫杉醇药物通过可断裂的酯键连接，利于前提药物在体内通过水解的方式直接释放抗肿瘤成分。
本发明提供的紫杉醇药物前体既能溶解于吐温等两亲性表面活性剂又可以溶解于水，这大大增加了紫杉醇药物的应用范围。
本发明提供的紫杉醇药物抗癌药物化合物，具有高抗癌活性且毒性更低，所述的化合物不仅可以溶于水，而且在水溶液中能够形成纳米颗粒，具有药物缓释功能。
本发明的水溶性紫杉醇药物化合物，含有抗癌药物活性部分和亲水部分，抗癌药物活性部分是具有抗癌活性的药物化合物分子紫杉醇，亲水部分是水溶性透明质酸衍生物。它们以酯键共价结合形成本发明的抗癌药物化合物。
本发明的有益效果：
(1)本发明的ptx药物前体比临床药物ptx具有相类似的抗肿瘤活性，在体内可缓慢水解，有效减少了体内毒性。
(2)本发明的ptx药物前体在水中有较好的溶解性。
(3)本发明的ptx药物前体靶向性有所增加。
(4)本发明以酸酐修饰透明质酸，再接于紫杉醇，该聚合物表现出良好的注射安全性、自聚集特性和载药能力。
具体实施方案
实施例1：
马来酸—透明质酸衍生物的制备
将1.0g透明质酸加入到80ml的甲酰胺中，50℃下强烈搅拌；将马来酸(透明质酸：马来酸摩尔比＝0.4：1.6、0.6：1.4、0.8：1.2、1：1、1.2：0.8、1.4：0.6、1.6：0.4)溶解于20ml甲酰胺中，加入到透明质酸溶液中，反应5h后将溶液冷却至室温。将冷却后的溶液溶解在无水乙醇下，强烈搅拌，沉淀。用无水乙醇反复清洗沉淀，11000r/min条件下离心3h。倾析，并用蒸馏水溶解。用2molnaoh溶液将上述溶液ph值调至8～9。用去离子水透析24小时。-63℃下冷冻24h，-112℃真空干燥48h。产率：75～90％。
紫杉醇药物前体1的制备
将马来酸—透明质酸衍生物粉末600mg溶解在5ml无水dmso中，加入不同摩尔比的dcc和dmap。将溶液搅拌1小时以激活马来酸—透明质酸衍生物的羧基。将不同量紫杉醇(10和20mg)溶解在1ml无水dmso中，并使用注射器在干燥的n2下缓慢加入到上述溶液中。然后将混合物在40℃下搅拌2天。使用透析膜(mwco：3500da)将所得溶液用dmso透析1天，用去离子水透析去离子水，以除去未反应的紫杉醇。收集紫杉醇药物前体1并冻干3天并进行分析。产率：65％～88％。
在乙腈/水(50:50，v/v)的混合溶液中，通过在227nm的uv吸光度测量缀合物上ptx的载药量(重量％)。最低载药量为10.2％，最高载药量为22.7％。载药量与水溶性之间存在矛盾，载药量越高，水溶性越低。和紫杉醇相比，紫杉醇药物前体1水溶性显着升高，溶解度从162mg/ml上升到275mg/ml。紫杉醇药物前体1的优异的水溶性归因于保持透明质酸的羧酸盐而没有任何修饰的透明质酸链的高度亲水性。由于其具有良好的水溶性，选择最高载药量22.7％的缀合物用于进一步实验。
用紫杉醇对照，游离紫杉醇处理48小时后，通过cck-8测定确定相对细胞活力。与游离紫杉醇相比，紫杉醇药物前体1对hepg2和a549细胞系显示出剂量依赖性的细胞毒性，并显示出优异的抗肿瘤效力。紫杉醇药物前体1的优异的细胞毒性可能归因于通过透明质酸-受体介导的内吞作用增强的细胞摄取，因为hepg2和a549细胞都过度表达ha可识别的cd44受体。此外，紫杉醇药物前体1的细胞毒性与药物负荷有关。例如，随着ptx负载的增加，观察到具有二酸酐修饰的紫杉醇药物前体1具有更高的细胞毒性。载药量高，水溶性好的紫杉醇药物前体1更有可能提高抗肿瘤药效。
实施例2：
邻苯二甲酸酐—透明质酸衍生物的制备
将1.0g透明质酸加入到80ml的二甲基亚砜中，50℃下强烈搅拌；将邻苯二甲酸酐(透明质酸：邻苯二甲酸酐摩尔比＝0.4：1.6、0.6：1.4、0.8：1.2、1：1、1.2：0.8、1.4：0.6、1.6：0.4)溶解于20ml二甲基亚砜中，加入到透明质酸溶液中，反应5h后将溶液冷却至室温。将冷却后的溶液溶解在无水甲醇下，强烈搅拌，沉淀。用无水甲醇反复清洗沉淀，11000r/min条件下离心3h。倾析，并用蒸馏水溶解。用2mol碳酸钾溶液将上述溶液ph值调至8～9。用去离子水透析24小时。-63℃下冷冻24h，-112℃真空干燥48h。产率：70～91％。
紫杉醇药物前体2的制备
将邻苯二甲酸酐—透明质酸衍生物粉末600mg溶解在5ml无水dmso中，加入不同摩尔比的dcc和dmap。将溶液搅拌1小时以激活邻苯二甲酸酐—透明质酸衍生物的羧基。将不同量紫杉醇(10和20mg)溶解在1ml无水dmso中，并使用注射器在干燥的n2下缓慢加入到上述溶液中。然后将混合物在40℃下搅拌2天。使用透析膜(mwco：3500da)将所得溶液用dmso透析1天，用去离子水透析去离子水，以除去未反应的紫杉醇和dmpeg。收集紫杉醇药物前体2并冻干3天并进行分析。产率：60～85％。
在乙腈/水(50:50，v/v)的混合溶液中，通过在227nm的uv吸光度测量缀合物上ptx的载药量(重量％)。最低载药量为10.1％，最高载药量为21.3％。载药量与水溶性之间存在矛盾，载药量越高，水溶性越低。和紫杉醇相比，紫杉醇药物前体2水溶性显着升高，溶解度从159mg/ml上升到268mg/ml。紫杉醇药物前体2的优异的水溶性归因于保持透明质酸的羧酸盐而没有任何修饰的透明质酸链的高度亲水性。由于其具有良好的水溶性，选择最高载药量21.3％的缀合物用于进一步实验。
用紫杉醇对照，游离紫杉醇处理48小时后，通过cck-8测定确定相对细胞活力。与游离紫杉醇相比，紫杉醇药物前体2对hepg2和a549细胞系显示出剂量依赖性的细胞毒性，并显示出优异的抗肿瘤效力。紫杉醇药物前体1的优异的细胞毒性可能归因于通过透明质酸-受体介导的内吞作用增强的细胞摄取，因为hepg2和a549细胞都过度表达ha可识别的cd44受体。此外，紫杉醇药物前体2的细胞毒性与药物负荷有关。例如，随着ptx负载的增加，观察到具有二酸酐修饰的紫杉醇药物前体2具有更高的细胞毒性。载药量高，水溶性好的紫杉醇药物前体2更有可能提高抗肿瘤药效。
实施例3:
丁二酸酐—透明质酸衍生物的制备
将1.0g透明质酸加入到80ml的甲酰胺中，50℃下强烈搅拌；将丁二酸酐(透明质酸：丁二酸酐摩尔比＝0.4：1.6、0.6：1.4、0.8：1.2、1：1、1.2：0.8、1.4：0.6、1.6：0.4)溶解于20ml甲酰胺中，加入到透明质酸溶液中，反应5h后将溶液冷却至室温。将冷却后的溶液溶解在无水乙醇下，强烈搅拌，沉淀。用无水乙醇反复清洗沉淀，11000r/min条件下离心3h。倾析，并用蒸馏水溶解。用2molnaoh溶液将上述溶液ph值调至8～9。用去离子水透析24小时。-63℃下冷冻24h,-112℃真空干燥48h。产率：70～85％。
紫杉醇药物前体3的制备
将丁二酸酐—透明质酸衍生物粉末600mg溶解在5ml无水dmso中，加入不同摩尔比的dcc和dmap。将溶液搅拌1小时以激活丁二酸酐—透明质酸衍生物的羧基。将不同量紫杉醇(10和20mg)溶解在1ml无水dmso中，并使用注射器在干燥的n2下缓慢加入到上述溶液中。然后将混合物在40℃下搅拌2天。使用透析膜(mwco：3500da)将所得溶液用dmso透析1天，用去离子水透析去离子水，以除去未反应的紫杉醇。收集紫杉醇药物前体3并冻干3天并进行分析。产率：60～85％。
在乙腈/水(50:50，v/v)的混合溶液中，通过在227nm的uv吸光度测量缀合物上ptx的载药量(重量％)。最低载药量为11.2％，最高载药量为21.7％。载药量与水溶性之间存在矛盾，载药量越高，水溶性越低。和紫杉醇相比，紫杉醇药物前体3水溶性显着升高，溶解度从168mg/ml上升到270mg/ml。紫杉醇药物前体3的优异的水溶性归因于保持透明质酸的羧酸盐而没有任何修饰的透明质酸链的高度亲水性。由于其具有良好的水溶性，选择最高载药量21.7％的缀合物用于进一步实验。
用紫杉醇对照，游离紫杉醇处理48小时后，通过cck-8测定确定相对细胞活力。与游离紫杉醇相比，紫杉醇药物前体3对hepg2和a549细胞系显示出剂量依赖性的细胞毒性，并显示出优异的抗肿瘤效力。紫杉醇药物前体1的优异的细胞毒性可能归因于通过透明质酸-受体介导的内吞作用增强的细胞摄取，因为hepg2和a549细胞都过度表达ha可识别的cd44受体。此外，紫杉醇药物前体3的细胞毒性与药物负荷有关。例如，随着ptx负载的增加，观察到具有二酸酐修饰的紫杉醇药物前体3具有更高的细胞毒性。载药量高，水溶性好的紫杉醇药物前体3更有可能提高抗肿瘤药效。
实施例4:
二甘醇酸酐—透明质酸衍生物的制备
将1.0g透明质酸加入到80ml的甲酰胺中，50℃下强烈搅拌；将二甘醇酸酐(透明质酸：丁二酸酐摩尔比＝0.4：1.6、0.6：1.4、0.8：1.2、1：1、1.2：0.8、1.4：0.6、1.6：0.4)溶解于20ml甲酰胺中，加入到透明质酸溶液中，反应5h后将溶液冷却至室温。将冷却后的溶液溶解在无水乙醇下，强烈搅拌，沉淀。用无水乙醇反复清洗沉淀，11000r/min条件下离心3h。倾析，并用蒸馏水溶解。用2molnaoh溶液将上述溶液ph值调至8～9。用去离子水透析24小时。-63℃下冷冻24h，-112℃真空干燥48h。产率：72～84％。
紫杉醇药物前体4的制备
将二甘醇酸酐—透明质酸衍生物粉末600mg溶解在5ml无水dmso中，加入不同摩尔比的dcc和dmap。将溶液搅拌1小时以激活二甘醇酸酐—透明质酸衍生物的羧基。将不同量紫杉醇(10和20mg)溶解在1ml无水dmso中，并使用注射器在干燥的n2下缓慢加入到上述溶液中。然后将混合物在40℃下搅拌2天。使用透析膜(mwco：3500da)将所得溶液用dmso透析1天，用去离子水透析去离子水，以除去未反应的紫杉醇。收集紫杉醇药物前体4并冻干3天并进行分析。产率：63～82％。
在乙腈/水(50:50，v/v)的混合溶液中，通过在227nm的uv吸光度测量缀合物上ptx的载药量(重量％)。最低载药量为11.3％，最高载药量为22.5％。载药量与水溶性之间存在矛盾，载药量越高，水溶性越低。和紫杉醇相比，紫杉醇药物前体4水溶性显着升高，溶解度从167mg/ml上升到272mg/ml。紫杉醇药物前体4的优异的水溶性归因于保持透明质酸的羧酸盐而没有任何修饰的透明质酸链的高度亲水性。由于其具有良好的水溶性，选择最高载药量22.5％的缀合物用于进一步实验。
用紫杉醇对照，游离紫杉醇处理48小时后，通过cck-8测定确定相对细胞活力。与游离紫杉醇相比，紫杉醇药物前体4对hepg2和a549细胞系显示出剂量依赖性的细胞毒性，并显示出优异的抗肿瘤效力。紫杉醇药物前体1的优异的细胞毒性可能归因于通过透明质酸-受体介导的内吞作用增强的细胞摄取，因为hepg2和a549细胞都过度表达ha可识别的cd44受体。此外，紫杉醇药物前体4的细胞毒性与药物负荷有关。例如，随着ptx负载的增加，观察到具有二酸酐修饰的紫杉醇药物前体1具有更高的细胞毒性。载药量高，水溶性好的紫杉醇药物前体4更有可能提高抗肿瘤药效。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。