本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及一种用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒。
背景技术：
人嗜T淋巴细胞病毒1型与多种疾病有关，主要与成人T细胞白血病有密切关系，其传播途径主要是输血、性传播、静脉吸毒和家庭内传播，广泛分布与全世界，主要流行于日本西南部、加勒比海地区、非洲中部和中国东南沿海，严重威胁公共卫生安全。目前对人嗜T淋巴细胞病毒1型的检测主要采用传统的酶联免疫吸附法、明胶颗粒凝集法和间接荧光法，存在窗口期长、操作繁琐、假阳性和假阴性等问题。PCR技术由于其灵敏度高、特异性好和操作简便等优点，已经越来越广泛的应用于病毒检测，但目前尚未有将PCR技术应用于人嗜T淋巴细胞病毒1型检测方面。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种采用PCR技术检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的用于检测人嗜T淋巴细胞病毒1型的试剂盒，包括由红细胞裂解液、反应液1、反应液2、阴性质控品和阳性质控品构成的反应体系；所述反应液1中包括根据人嗜T淋巴细胞病毒1型gap区的特异性设计的2条特异性引物和1条特异性探针，依据人基因组β珠蛋白的特异性设计的2条引物和1条特异性探针：
引物1：5’- AGCCTTACCACACCTTCGTAG -3’（SEQ ID No.1）；
引物2：5’- TGGCATTCTTTGTTTGCATTGGAG -3’（SEQ ID No.2）；
引物3：5’- TGGAACATATTTGACGGCTTT -3’（SEQ ID No.3）；
引物4：5’- GATCTTAGCTACTACTGCCAA -3’（SEQ ID No.4）；
探针1：FAM- ACGTAGCCCTTGACAACGGACT –BHQ1（SEQ ID No.5）；
探针2：ROX- AAACCCACTGCATCACTCT –BHQ2（SEQ ID No.6）。
所述反应液2中含有20~30mM MgCl2和0.09%叠氮化钠。
所述阴性质控品中仅含人β珠蛋白基因质粒；所述阳性质控品中含有人嗜T淋巴细胞病毒1型RNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒。
所述红细胞裂解液中包含0.1~0.2M NH4Cl，0.1~0.2mM EDTA和10~20mM NaHCO3。
本发明的优点在于利用聚合酶链式反应技术，在50℃ 2min，94℃ 2min，（94℃ 5s， 55℃ 30s）40循环扩增条件下，使用实时荧光定量PCR仪进行荧光检测，依据Ct值对人嗜T淋巴细胞病毒1型进行定性检测，使用内部对照（β珠蛋白）、阴性质控品和阳性质控品对检测结果进行监控。
使用本发明试剂盒，能在较短的时间内定性检测人嗜T淋巴细胞病毒1型；灵敏度高，最低检出限为100 Copies/ml；特异性好，本发明根据gap区基因序列设计1对引物，与其他病原体无交叉干扰，具有较高的特异性。本发明对于人嗜T淋巴细胞病毒1型的输血诊断与临床检测具有较高的参考价值，适于推广应用。
附图说明
图1是采用本发明试剂盒对20份最低检出限样本进行检测的扩增曲线图。
具体实施方式
实施例1 试剂盒反应体系（聚合酶链式反应）的准备：
1、红细胞裂解液：H2O 200ul，其中包含0.1~0.2M NH4Cl，0.1~0.2mM EDTA和10~20mM NaHCO3。
2、反应液1：pH8.0的 0.1M Tris-HCl 30ul，其中包括4pmol/µl引物1、4 pmol/µl引物2、4pmol/µl引物3、4 pmol/µl引物4、1 pmol/µl探针1、1 pmol/µl探针2、10U Taq酶、5U MMLV、0.1U UNG和10×PCR反应缓冲液，四条引物及两条探针分别为：
引物1：5’- AGCCTTACCACACCTTCGTAG -3’（SEQ ID No.1）；
引物2：5’- TGGCATTCTTTGTTTGCATTGGAG -3’（SEQ ID No.2）；
引物3：5’- TGGAACATATTTGACGGCTTT -3’（SEQ ID No.3）；
引物4：5’- GATCTTAGCTACTACTGCCAA -3’（SEQ ID No.4）；
探针1：FAM- ACGTAGCCCTTGACAACGGACT –BHQ1（SEQ ID No.5）；
探针2：ROX- AAACCCACTGCATCACTCT –BHQ2（SEQ ID No.6）。
3、反应液2：H2O 10ul，其中包含20~30mM MgCl2和0.09%叠氮化钠。
4、阴性质控品：TE 50ul，含人β珠蛋白基因质粒，浓度为103 Copies/ml。
5、阳性质控品：TE 50ul，含人嗜T淋巴细胞病毒1型RNA片段的质粒和人β珠蛋白基因质粒，浓度均为103 Copies/ml。
实施例2 用实施例1的反应体系按以下方法对人嗜T淋巴细胞病毒1型进行定性检测
待测样品为含有100copies/ml人嗜T淋巴细胞病毒1型的人全血样本，当然，也可以为其他可能含有人嗜T淋巴细胞病毒1型的样本类型。
1、全血前处理
将全血样本与红细胞裂解液以1:3的体积比加入离心管中混合，上下颠倒混匀10次后，12000r/min离心5min；去上清，用1ml的生理盐水重悬沉淀。
2、模板RNA提取（可使用商用提取试剂盒提取模板RNA，以备后续PCR反应使用，如可使用芯超生物--全血基因组DNA/RNA提取试剂盒）：
1）添加10ul磁珠混悬液到上述处理后的待检样本中（磁珠混悬液的基础液是H2O，包含直径为0.5nm~1nm的超纯磁性氧化硅纳米磁珠）；
2）再添加1ml裂解液到待检样本中，室温裂解3min（裂解液的基础液是H2O，包含3~5M的异硫氰酸胍和0.5%的Tween-20）；
3）使用磁板对待检样本靠磁30s，去上清液；
4）在上述离心管中添加2ml洗液A，吹打混匀（洗液A的基础液是H2O，包含1~3M的高氯酸钠，0.1~0.5M 乙酸钾和25%的乙醇）；
5）使用磁板对待检样本靠磁30s，去上清液；
6）上述离心管中添加2ml洗液B，吹打混匀（洗液B的基础液是H2O，包含70~85%的乙醇）；
7）使用磁板对待检样本靠磁30s，去上清液；
8）在离心管中添加0.2ml洗脱液，吹打混匀（洗脱液：pH8.0 TE）；
9）70℃解离后靠磁取出上清液备用。
3、聚合酶链式反应：在100µl PCR管配制反应体系：PCR反应液1 10µl，PCR反应液2 10µl，模板RNA 20~50µl（阴阳性质控按照模板加样量直接添加），将上述反应管于50℃ 2min，94℃ 2min，（94℃ 5s， 55℃ 30s）40循环扩增条件下反应。
4、结果判定：阴性质控品应ROX显示Ct值≤40，FAM显示No Ct；阳性质控品应ROX显示Ct值≤40，FAM显示Ct值≤35。在以上2个条件下，仪器ROX显示Ct值≤40，FAM显示No Ct表示待检样品为阴性；仪器ROX显示Ct值≤40，FAM显示Ct值≤45表示待检样品为阴性。
按照上述方法对20份最低检出限样本进行检测，得到的扩增曲线如图1所示，数据如表1所示：
结论：采用本发明试剂盒对上述20例100 Copies/ml的阳性临床样本进行检测，结果均为阳性，证明本发明试剂盒的检测限可以达到100 Copies/ml。