本发明属于发酵领域，涉及一种发酵制备巨藻抗氧化肽的方法。
背景技术：
：巨藻(Macrocystispyrifera(L.)Ag)为褐藻门海带目巨藻科巨藻属。巨藻是世界上生长最快的植物之一，在适宜的条件下，每棵巨藻一天内就可以生长30到60厘米，一年里一棵巨藻可以长到50多米。巨藻是藻类王国中最长的一族，大多数巨藻可以长到几十米，最长的甚至可以达到200米到300米，重达200公斤。海洋中巨藻资源丰富，开发和利用潜力大，是一种非常好的可再生生物资源。巨藻体内80％是水分，还含有粗蛋白、粗脂肪、碳水化合物、褐藻胶、钾、碘、氨基酸及微量元素，因此可以提取多种化工原料。专利201410608293.1涉及一种对于巨藻的综合利用深加工方法，能够从巨藻中提取分离出碘、甘露醇、岩藻糖、海藻酸钠。专利200810126715.6涉及一种采用巨藻制备海藻酸钠的方法。巨藻提取物中含有多种矿物质、糖类和氨基酸，进行强化皮肤“表层锁水”的水养作用，专利201310109432.1涉及护肤品中的补水保湿技术—24全时水润三层水养修护系统以巨藻提取物、深层海泉水、三色堇提取物以及“捕水因子”构成三层水养修护系统。现阶段，制备抗氧化活性肽的方法主要有以下几种：生物提取法，化学降解法，化学合成法，重组DNA法，酶法生产，微生物发酵法。①生物提取法：使用各种溶剂提取存在于生物体中的各类天然抗氧化活性肽；②化学降解法：将需要降解的蛋白质置于适宜浓度的强酸或强碱溶液中，在密闭的容器里，加热至适宜的温度并保持一段时间，使蛋白质中的肽键裂解至一定程度，然后终止反应，再对生成的多肽产物进行分离纯化。该方法操作简便，成本低廉，但是酸水解会导致L-型氨基酸的构象发生变化生成D-型氨基酸和一些有毒产物，而碱水解的产生的多肽产物有异味，并且水解的程度难以控制，因此该方法应用较少；③化学合成法：使用化学缩合剂使氨基酸之间发生缩合反应生成需要的目标生物活性肽，但是该方法的生产成本高，产物中的副反应物及残留化合物多，并且使用的试剂大多是有毒有害的。④DNA重组法：采用分子生物手段，使某些合成抗氧化活性肽的基因片段在工程微生物或动植物中得到大量表达，从而达到大规模工业化化生产的目的；⑤酶法生产：使用商品酶试剂对蛋白质进行适度的水解，是当前大规模制备抗氧化活性肽的主要手段。⑥微生物发酵法：以底物蛋白作为发酵培养基的组成成分之一，选择优良的发酵菌种，利用微生物在生长过程中产生的蛋白酶水解底物蛋白，发酵结束后对发酵产物进行分离纯化，最后得到抗氧化活性肽。巨藻可以通过厌氧发酵生产燃气，期刊《环境科学》2015年第1期报道的利用巨藻发酵联产氢气与挥发性有机酸的研究，通过巨藻生物质厌氧发酵联产氢气、乙酸和丁酸。巨藻还可以通过发酵生产饲料，专利201610293353.4提供了一种含有巨藻的海参饲料配方，其特征在于该海参饲料以巨藻粉、鱼粉、贝壳粉、豆粕和海泥组成的基础饲料，添加微生物制剂混合物纳豆芽孢杆菌、热带假丝酵母菌和绿色木霉菌，有利于海参进行消化吸收，增强海参免疫力。现有技术中，制备藻类中肽的技术方向主要为酶解法，如专利CN104120160A，其加入复合蛋白酶、复合风味蛋白酶、中性蛋白酶或碱性蛋白酶多种蛋白进行酶解。由于不同的蛋白适宜的酶解条件不同，因此很难发挥各种酶的最佳酶解效果。此外植物蛋白酶(如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等)效率低，受外界环境因素影响大，成本高，不适合工业化生产；动物蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶等)，虽然酶解效果好，但是价格太高，副反应多，同样也不适合工业化生产；微生物蛋白酶酶解效果好，副反应少，但是价格相对较高，酶解产物在很大程度上存在着苦味问题。随着生物发酵技术的不断进步，现在也有使用微生物发酵法制备肽的研究。如花生发酵制备多肽、玉米发酵制备多肽、豆粕发酵制备多肽。然而，从未有报道将巨藻发酵制备抗氧化肽。由于不同原料来源以及原料内部的分子结构差异，适用于其他物种，如花生、豆粕的发酵方法，难以挪用到其他物种中。巨藻作为一种资源非常丰富的可再生原材料，其提取物在多个领域包括化妆品都有应用，其中的抗氧化肽在化妆品领域具有良好护肤效果，因此，十分有必要发展一种有效的巨藻抗氧化肽的制备方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种通过液体发酵制备巨藻抗氧化肽的方法，该方法制备得到的巨藻抗氧化肽应用到化妆品中清除自由基，提高皮肤抗氧化能力，达到抗衰老效果。本发明的目的还在于提供一种抗氧化肽产率高的制备方法。本发明的上述目的通过以下技术手段实现：通过液态发酵工艺，巨藻经处理后用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、米曲霉混合菌种发酵，协同增效，提纯制得巨藻抗氧化肽，应用于化妆品中提高皮肤抗氧化能力，清除自由基，达到抗衰老效果。芽孢杆菌对外界有害因子抵抗力强，在自然界分布非常广泛,生理特性丰富多样,是土壤和植物微生态优势种群之一。它可产生多种抗生素,包括脂肽类、肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸类、核酸类物质,对多种动、植物及人类病原菌起到很好的抑制作用。本发明采用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，并配合米曲霉进行发酵。枯草芽孢杆菌在芽孢状态下稳定性好，能耐氧化、耐挤压、耐高温、耐酸碱，能产生多种酶类(如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶)及营养物质(如多种氨基酸、多肽和维生素类物质)。枯草芽孢杆菌是一种重要的生物发酵剂，很多国家和地区用它来制作发酵豆类食品，如中国的豆豉，日本的纳豆，枯草芽孢杆菌发酵蛋白被大规模的水解成氨基酸、多肽和氨类化合物，提高抗氧化活性。地衣芽孢杆菌是一种在土壤中常见的革兰氏阳性嗜热细菌。酶分泌的最适温度为37℃，它可能以孢子形式存在，有很强的生命活力、具备产生各种酶的能力，而且有耐高温、耐酸碱、耐挤压等特性，从而加工过程损失小。米曲霉属半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，从梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸。具体地，本发明的巨藻抗氧化肽的制备方法包含以下步骤：(1)巨藻水溶液的制备：采摘巨藻后清洗干净，将巨藻破碎成粉，加入蒸馏水混匀，所述蒸馏水的体积用量以巨藻干粉质量计为20-30mL/g；然后分散溶解，优选采用超声波分散溶剂，超声波功率为250-350w，超声波频率为25-30kHz，温度为20-30℃，时间为10-20min；分散溶解后，使用0.22-0.3μm规格的滤膜过滤除去杂物；再在不断搅拌下向巨藻水溶液中加入1-6％的NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5，用高压灭菌锅121℃灭菌10-20min，冷却至25℃，制得巨藻水溶液。(2)菌种种子液的制备：用浓度均为1×108～1×109CFU/g的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和米曲霉的液体菌种液共同接种到培养液中，其中，接种所用的枯草芽孢杆菌菌种液、地衣芽孢杆菌菌种液和米曲霉菌种液的质量比为10:1～10:1～10；优选地，培养后菌种种子液的菌种总浓度1×107～1×1011CFU/g。其中，用于培养混合菌的培养液组成为牛肉膏0.2～0.8％，蛋白胨0.5～1.5％，葡萄糖0.5-1.5％，氯化钠0.1～1％，余量为蒸馏水，pH值为6.5～7.5。进一步地，菌种种子液的培养条件为在约37℃培养约36h。(3)发酵：步骤(1)制备得到的巨藻水溶液接种步骤(2)制备得到的菌种种子液，菌种种子液的接种质量为巨藻水溶液重量的2～10％，接种后，在30-35℃、转速100-150r/min下摇床发酵培养36-96h，制得发酵液。(4)提纯：将发酵液100℃高温灭菌15min，再进行离心分离，离心转速为2000-8000r/min，时间为10-30min，取上层清用双层滤纸过滤，再用0.22μm规格的滤膜过滤，滤液浓缩，冷冻干燥，制得巨藻抗氧化肽。作为优选的实施方式，本发明巨藻抗氧化肽的制备方法为：(1)巨藻水溶液的制备：采摘巨藻后清洗干净，将巨藻破碎成粉，加入蒸馏水混匀，所述蒸馏水的体积用量与巨藻粉末质量计为26mL/g；然后超声波分散溶解，超声波功率为290w，超声波频率为27kHz，温度为25℃，时间为14min；溶解后，使用0.22μm规格的滤膜过滤除去杂物；再在不断搅拌下向巨藻水溶液中加入4％的NaOH溶液调节pH值至7.1，用高压灭菌锅121℃灭菌15min，冷却至25℃，制得巨藻水溶液。(2)菌种种子液的制备：用浓度均为1×108～1×109CFU/g的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和米曲霉的液体菌种液共同接种到培养液中，其中，接种所用的枯草芽孢杆菌菌种液、地衣芽孢杆菌菌种液和米曲霉菌种液的质量比为5:1:3；培养后菌种种子液的菌种总浓度1×108～1×109CFU/g，用于培养混合菌的培养液组成为牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，葡萄糖1.0％，氯化钠0.5％，余量为蒸馏水，pH值为7.0。(3)发酵：步骤(1)制备得到的巨藻水溶液接种步骤(2)制备得到菌种种子液，菌种种子液的接种质量为巨藻水溶液重量的6％，菌种种子液的菌种浓度1×108～1×109CFU/ml，接种后在33℃、转速130r/min下摇床发酵培养72h，制得发酵液。(4)提纯：将发酵液100℃高温灭菌15min，再进行离心分离，离心转速为6000r/min，时间为20min，取上层清液用双层滤纸过滤，再用0.22μm规格的滤膜过滤，滤液浓缩，冷冻干燥，制得巨藻抗氧化肽。本发明的有益效果：1.本发明首次将液态发酵应用到海洋巨藻抗氧化肽的制备中制成抗氧化肽，开发了巨藻的新功能；现有技术中，巨藻提取物一般作为保湿成分，而海洋中巨藻资源丰富，本发明利用巨藻制备抗氧化肽，可有效取到抗氧化作用，为化妆品中的抗氧化剂提供了一种新的原料来源，且该抗氧化剂天然、安全、不刺激。2.特定比例的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和米曲霉发酵的组合，抗氧化肽具有显著的自由基清除率，同时，结合特定的方法和步骤，制备得到的巨藻抗氧化肽应用于化妆品中，能够起到优异的抗氧化和抗晒老的效果。3.本发明制备的巨藻抗氧化肽，能够有效清除自由基，提高皮肤抗氧化能力，达到抗衰老效果。具体实施方式以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。本发明中，采用的巨藻为褐藻门海带目巨藻科巨藻属，采摘自大西洋阿根廷附近海域，优选长度为30-50米的巨藻，含有丰富的蛋白质、褐藻胶、甘露醇、粗纤维，本发明的巨藻抗氧化肽的制备放方法同样适应于其它地区的巨藻。本发明所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本发明的菌种编号：枯草芽孢杆菌(编号GIM1.784)、地衣芽孢杆菌(编号GIM1.626)、米曲霉(编号GIM3.487)。本发明的菌种购买于广东省微生物菌种保藏中心。需要说明的是，相同的菌种由于不同的供应商可能具有不同的编号，因此本申请中所采用的微生物并不限于上述编号的菌种。实施例1-24巨藻抗氧化肽的制备方法(1)巨藻水溶液的制备：采摘巨藻后清洗干净，将巨藻破碎成粉，加入蒸馏水混匀，所述蒸馏水的体积用量以巨藻粉末质量计为20-30mL/g；然后超声波分散溶解，超声波功率为250-350w，超声波频率为25-30kHz，温度为20-30℃，时间为10-20min；使用0.22μm规格的滤膜过滤除去杂物；再在不断搅拌下向巨藻溶液中加入1-6％NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5，用高压灭菌锅121℃灭菌10-20min，冷却至25℃，制得巨藻水溶液。(2)菌种种子液的制备：用浓度均为1×108～1×109CFU/g的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和米曲霉的液体菌种液共同接种到培养液中，其中，接种所用的枯草芽孢杆菌菌种液、地衣芽孢杆菌菌种液和米曲霉菌种液的体积比为10:1～10:1～10；用于培养混合菌的培养液组成为牛肉膏0.2～0.8％，蛋白胨0.5～1.5％，葡萄糖0.5-1.5％，氯化钠0.1～1％，余量为蒸馏水，pH值为6.5～7.5，菌种种子液的培养条件为在37℃培养36h。培养后菌种种子液的菌种总浓度1×107～1×1011CFU/g。(3)发酵：步骤(1)制备得到的巨藻水溶液接种步骤(2)制备得到的菌种种子液，菌种种子液的接种质量为巨藻水溶液重量的2～10％，在30-35℃、转速100-150r/min下摇床发酵培养36-96h，制得发酵液。(4)提纯：将发酵液100℃高温灭菌15min，再进行离心分离，离心转速为6000r/min，时间为20min，取上层清夜双层滤纸过滤，再用0.22μm规格的滤膜过滤，滤液浓缩，冷冻干燥，制得巨藻抗氧化肽。具体的制备参数参照下表1～4。表1表2表3表4清除自由基能力评估(体外DPPH法)巨藻抗氧化肽对自由基有较好的清除作用，本发明采用DPPH法测定巨藻抗氧化肽的抗氧化能力。准确称取DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)试剂3.5mg，用无水乙醇溶解，并定量转入10mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，取2mL至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0178mmol/LDPPH溶液，置于冰箱中冷藏备用。分别准确称取上述实施例1到24制备的2mg干燥的巨藻抗氧化肽，用无水乙醇溶解，并定量转入50ml容量瓶中，用无水乙醇定量至刻度，取10ml至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为4mg/L巨藻抗氧化肽试液。在10mL比色管中依次加入4.0mLDPPH溶液和4.0mL巨藻抗氧化肽试液，再加入无水乙醇至刻度，混匀立即用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值(A)，吸光值记为Ai，再在温室避光保存30min后测吸光值，记为Aj，对照试验为只加DPPH的乙醇溶液，其吸光值记为Ac。按下式计算自由基清除率(K)：K(％)＝[1-(Ai-Aj)/Ac]*100％。结果如下表5：表5结果表明，虽然均采用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、米曲霉作为发酵菌种，但是不同的制备参数，尤其是菌种的比例，对最终制备的巨藻抗氧化肽的DPPH自由基清除效果有显著的影响，上述实验结构显示了不同方法制备得到的巨藻抗氧化肽的DPPH的自由基清除率从最低11％跨度到最高78％。其中，实施例16制得的巨藻抗氧化肽对DPPH自由基清除效果最好DPPH的自由基清除率高达78％，具有十分突出的优势。对比例1-6由优选的实施例16为基础，仅更换不同菌种搭配比例，其它条件与实施例16保持不变。具体的制备方法中的参照下表6。表6按照上述方法清除自由基能力评估(体外DPPH法)，测定对比例的自由基清除率，如下表7所示：表7对比例123456DPPH自由基清除率(％)35.819.3310.2742.5839.1229.65由上可知，菌种的组合对于抗氧化肽的制备具有至关重要的意义，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、米曲霉对于发酵制备巨藻抗氧化肽来说三者缺一不可，虽然现有技术中已经报道了采用他们中的一种或者两种用于其他物种的发酵。本发明制备得到的巨藻抗氧化肽抗衰老能力评估(人体法)采用实施例16制备得到的巨藻抗氧化肽制备成含2％巨藻抗氧化肽的抗衰老眼霜(测试组)，分别对身体健康的30位年龄在35-50岁女性测试者进行测试评估，采用10分制，10分为抗皱效果最好，9分次之，1分抗皱效果最差。每天早晚各用一次，连续使用8周，对照组为不含巨藻抗氧化肽的眼霜，测试结果如下表9所示。眼霜的配方如下表8：表8对照组和测试组的眼霜配方制备方法：A.将序号1～6的配方成分加入水相锅混合，加热至80-85℃，搅拌至完全溶解，备用。B.将序号7～15的配方成分加入由相锅混合，加热至80-85℃，搅拌至完全溶解，备用。C.将A过滤加入乳化锅，再将B过滤加入乳化锅，乳化均质10分钟，加入序号16的配方成分。搅拌降温。D.降温至40-45℃，加入序号17的配方成分，乳化均质3分钟。再加入序号18的配方分，搅拌溶解完全，继续搅拌降温至28-32℃，结束。表9抗衰老效果结果表明，添加一定量巨藻抗氧化肽的化妆品对鱼尾纹和眼周皱纹具有明显的改善，其对抗衰老确实有效。不同的菌株发酵制备得到巨藻抗氧化肽对于清除自由基能力评估本发明还探讨了用单一菌种制备巨藻抗氧化肽，效果不如本发明所述混合菌种：枯草芽孢杆菌(编号GIM1.784)、地衣芽孢杆菌(编号GIM1.626)、米曲霉(编号GIM3.487)。巨藻抗氧化肽的制备方法与本发明所述方法相同，即：(1)巨藻水溶液的制备：采摘巨藻后清洗干净，将巨藻破碎成粉，加入蒸馏水混匀，所述蒸馏水的体积用量以巨藻粉末质量计为26mL/g；然后超声波分散溶解，超声波功率为290w，超声波频率为27kHz，温度为25℃，时间为14min；使用0.22μm规格的滤膜过滤除去杂物；再在不断搅拌下向巨藻溶液中加入4％NaOH溶液调节pH值至7.1，用高压灭菌锅121℃灭菌15min,冷却至25℃，制得巨藻水溶液。(2)菌种种子液的制备：分别用浓度为1×108～1×109CFU/g的表10中的液体菌种液接种到培养液中；培养液组成为牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，葡萄糖1.0％，氯化钠0.5％，余量为蒸馏水，pH值为7.0，培养后菌种种子液的菌种浓度1×108～1×109CFU/g。(3)发酵：步骤(1)制备得到的巨藻水溶液接种步骤(2)制备得到菌种种子液，菌种种子液的接种质量为巨藻水溶液重量的6％，菌种种子液的菌种浓度1×108～1×109CFU/g，在33℃、转速130r/min下摇床发酵培养72h，制得发酵液。(4)提纯：将发酵液100℃高温灭菌15min，再进行离心分离，离心转速为6000r/min，时间为20min，取上层清夜双层滤纸过滤，再用0.22μm规格的滤膜过滤，滤液浓缩，冷冻干燥，制得巨藻抗氧化肽。采用DPPH法测定巨藻抗氧化肽的抗氧化能力。准确称取DPPH试剂3.5mg，用无水乙醇溶解，并定量转入10mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，取2mL至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0178mmol/LDPPH溶液，置于冰箱中冷藏备用。准确称取2mg干燥的巨藻抗氧化肽，用无水乙醇溶解，并定量转入50ml容量瓶中，用无水乙醇定量至刻度，取10ml至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为4mg/L巨藻抗氧化肽试液。在10mL比色管中依次加入4.0mLDPPH溶液和4.0mL巨藻抗氧化肽试液，再加入无水乙醇至刻度，混匀立即用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值(A)，吸光值记为Ai，再在温室避光保存30min后测吸光值，记为Aj，对照试验为只加DPPH的乙醇溶液，其吸光值记为Ac。按下式计算自由基清除率(K)：K(％)＝[1-(Ai-Aj)/Ac]*100％。结果如下表3：表10不同菌种制备巨藻抗氧化肽对DPPH自由基清除率的影响序号菌种DPPH自由基清除率(％)1枯草芽孢杆菌(编号GIM1.784)35.82乳酸链球菌(编号GIM1.198)5.503醋酸醋杆菌(编号GIM1.367)3.154地衣芽孢杆菌(编号GIM1.863)19.335谷氨酸棒状杆菌(编号GIM1.41)6.676酿酒酵母(编号GIM1.255)1.257米曲霉(编号GIM3.487)10.278黑曲霉(编号GIM3.576)4.86结果表明，用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、米曲霉发酵制备的巨藻抗氧化肽对DPPH自由基清除效果较好，因此，本发明采用三者混合培养，联合发酵。意外且惊喜的是，单独采用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、米曲霉发酵时，三者的DPPH自由基清除率和为65.4％，而采用三者的混合菌种发酵时，三者的DPPH自由基清除率上升至78％，表明三者混合使用具有协同增效的功能，可以达到最佳抗氧化效果。当前第1页1 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