本发明涉及一种山茱萸提取物同时制备高纯度莫诺苷和马钱子苷的方法，尤其涉及一种对莫诺苷和马钱子苷有显著分离效果的中压反相硅胶柱色谱结合sephadexlh-20(羟丙基葡聚糖凝胶)凝胶柱色谱制备高纯度目标化合物的分离方法。
背景技术：
山茱萸为山茱萸科山茱萸属植物cornusofficinalissieb.etzucc.，其药用部位为干燥成熟果肉，具有补益肝肾、收涩固脱的功效，用于治疗眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、内热消渴等，应用十分广泛。山茱萸中有多种化学成分，环烯醚萜苷类成分是其最主要的活性成分，而莫诺苷和马钱子苷是环烯醚萜总苷中含量最大的两种成分，也是最主要的活性成分，在心血管保护、神经保护、抗肿瘤等方面具有较好的作用。寻找简单易行的从山茱萸中同时制备高纯度活性单体化合物的方法，将对山茱萸的开发利用奠定很好的基础。
从山茱萸中同时制备莫诺苷和马钱子苷的方法较少，专利cn102477053a中报道采用高速逆流色谱同时分离莫诺苷和马钱子苷，此方法需要特殊的设备，成本较高，不适合大量制备产物，同时采用重结晶的方式纯化，费时费力，且能拿到高纯度目标化合物的量也很有限；“山茱萸中马钱子苷和莫诺苷对照品的制备”(李小娜，山茱萸中马钱子苷和莫诺苷对照品的制备.中草药,2006,37(8):1168-1170.)中报道，采用水浸泡，煎煮提取，醇沉淀，大孔树脂富集，正向硅胶柱除杂，高效液相制备的方式同时制备莫诺苷和马钱子苷，此方法采用高效液相纯化，需要高成本设备和色谱柱，且一次只能制备少量样品，耗费时间长，只适合实验室小量制备，不适合工业化生产使用。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有制备方法和技术中，克服同时制备纯化莫诺苷和马钱子苷存在的不足，提出一种制备方法简单、容易操作，得率高且适合规模化生产同时制备高纯度莫诺苷和马钱子苷的方法。本发明的方法简单易行，且可以同时大量制备得到纯度≧98％(质量％，以下相同)的莫诺苷和马钱子苷。
一种山茱萸提取物同时制备高纯度莫诺苷和马钱子苷的方法，山茱萸提取物经大孔吸附树脂富集和正相硅胶初步分离后，还包括以下步骤：
(1)中压反相硅胶柱分离：将经大孔吸附树脂富集和正相硅胶初步分离得到的含莫诺苷和马钱子苷的混合样品用水溶解，经中压反相硅胶色谱柱，流动相为乙醇和水，进行梯度洗脱，分别收集富含莫诺苷和马钱子苷的洗脱液，减压浓缩得到纯度≧90％莫诺苷粗品和马钱子苷粗品；
(2)凝胶柱纯化：纯度≧90％的莫诺苷和马钱子苷粗品分别经sephadexlh-20凝胶(羟丙基葡聚糖凝胶)柱进行纯化，采用氯仿和甲醇混合溶剂进行洗脱，洗脱液减压蒸干得到高纯度的莫诺苷和马钱子苷。
步骤(1)中，中压反相硅胶分离采用仪器为中压色谱仪，压力在0-50mpa之间，使用时压力在5-25mpa之间；用中压反相硅胶柱色谱分离，柱层析为反相硅胶柱，所用反相硅胶填料为c18填料。
中压反相硅胶分离时，中压反相硅胶柱层析采用湿法上样，流动相为乙醇和水的混合溶剂，乙醇与水的体积比为5:95～20:80进行梯度洗脱后，收集乙醇与水的体积比为5:95～8:92流份，根据硅胶薄层色谱和高效液相色谱合并相同组分，减压浓缩得到纯度≧90％莫诺苷粗品；收集乙醇与水的体积比为10:90～20:80流份，根据硅胶薄层色谱和高效液相色谱合并相同组分，减压浓缩得到纯度≧90％马钱子苷粗品。中压反相柱层析(湿法上样)所得莫诺苷粗品和马钱子苷除少量样品纯度≧98％，绝大部分的纯度≧90％。
优选的，溶剂洗脱流速为10-50ml/min，每一个梯度洗脱3-5个柱体积。流动相按照乙醇与水的体积比分别为5:95、7:93、8:92、10:90、12:88、15:85、20：80进行梯度洗脱。
步骤(2)中，采用sephadexlh-20凝胶柱色谱进行纯化时，流动相为氯仿和甲醇，氯仿与甲醇的体积比可为0:1～2.5:1之间的任何比值，即氯仿与甲醇的体积比为0:1，0.5:1，1:1，1.5:1，2:1，2.5:1或在此之间的任何比例作溶剂。
优选的，莫诺苷粗品采用spehadexlh-20凝胶进行纯化时，流动相用氯仿与甲醇的体积比为1.5:1进行洗脱；马钱子苷粗品采用spehadexlh-20凝胶进行纯化时，流动相用氯仿与甲醇的体积比为2.5:1进行洗脱。
sephadexlh-20凝胶柱色谱根据柱子直径和长短，流速控制在2～20ml/min。
洗脱后根据硅胶薄层色谱和高效液相色谱合并相同组分，减压蒸干得到的莫诺苷的纯度≧98％，马钱子苷的纯度≧98％。
本发明中，山茱萸提取物的制备方法可为：将干燥山茱萸果实粉碎后过20目筛，在筛分的粉末中加入50％乙醇，液料比为10:1(ml/g)，进行超声提取，连续提取三次，合并提取液，减压浓缩蒸干后得到山茱萸提取物粉末。超声提取的工艺条件：室温下进行，超声波的功率为300w，提取时间为每次45min～60min。
大孔吸附树脂富集：将山茱萸提取物用水溶解后经大孔吸附树脂柱，流动相为水和/或乙醇，进行梯度洗脱，收集富含莫诺苷和马钱子苷的洗脱液，减压回收得到干燥洗脱物。
优选的，大孔吸附树脂富集为将山茱萸提取物用水溶解，过滤，除去不溶物，液体经hp-20型大孔吸附树脂柱，分别用水、10％乙醇(体积％，以下相同)、40％乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，收集40％乙醇洗脱液，减压回收得到干燥洗脱物。优选的，溶剂洗脱流速为10-50ml/min，每一个梯度洗脱3-5个柱体积。
正相硅胶柱初步分离：将所得洗脱物溶解后，正相硅胶拌样，拌样硅胶干法上样，流动相为氯仿和甲醇，进行梯度洗脱，收集富含莫诺苷和马钱子苷的洗脱液，减压浓缩得含莫诺苷和马钱子苷的混合样品。
优选的，正相硅胶柱初步分离为将所得洗脱物用甲醇溶解后，正相硅胶拌样，拌样硅胶干法上样，流动相为氯仿：甲醇＝15:1～8:1进行梯度洗脱，合并氯仿：甲醇＝10:1～8:1相同组分，减压浓缩得含莫诺苷和马钱子苷的混合样品，所用正相硅胶为160～200目。优选的，溶剂洗脱流速为10-50ml/min，每一个梯度洗脱2-5个柱体积。流动相按照氯仿与甲醇的体积比分别为15:1、12:1、10:1、9:1、8:1的梯度进行洗脱。
将得到的单体莫诺苷和马钱子苷采用高效液相检测，最终确定莫诺苷和马钱子苷的纯度。本发明涉及的hplc分析方法，液相色谱仪为waters2545型2998检测器，色谱柱:waterssunfirec18column(4.6*250mm，5μm)，流动相：甲醇：水＝30:70，流速：1ml/min，检测波长：240nm。
莫诺苷和马钱子苷在中压反相硅胶柱色谱上有显著的分离效果，一次就可以将两者完全分离开，且速度快、效率高。凝胶sephadexlh-20所用流动相是氯仿和甲醇的不同比例，所用洗脱剂是正相体系，即保证了分离效果，又可保证快速分离和回收。纯度≧90％的莫诺苷粗品和马钱子苷粗品，分别经凝胶柱层析(湿法上样，湿法装柱，填料一次装柱后可反复长期使用)的方法，可得到纯度≧98％的高纯度莫诺苷和马钱子苷。本方法操作简单易行，条件温和，反相硅胶柱和凝胶柱都可以反复使用，适合用山茱萸提取物同时规模化制备和生产纯度≧98％的莫诺苷和马钱子苷。
本发明方法能够从山茱萸提取物中同时获得高纯度的莫诺苷和马钱子苷。本发明通过多次摸索尝试，最终选出一条最佳的纯化工艺路线，为市场提供一种简单易操作，且高效大量制备含量≧98％高纯度的莫诺苷和马钱子苷的方法。
附图说明
图1为莫诺苷纯度检查hplc色谱图。
图2为马钱子苷纯度检查hplc色谱图。
具体实施方式
本发明从山茱萸提取物同时制备高纯度莫诺苷和马钱子苷的方法，包括以下具体步骤：
步骤一：将山茱萸干燥果实粉碎过20目筛，溶剂用50％乙醇，液料比用10:1(ml/g)进行超声提取，连续提取三次，合并提取液，减压浓缩蒸干后得到山茱萸粗提物粉末。
步骤二：上述粉末用水溶解，过滤，除去不溶物，液体经hp-20型大孔吸附树脂柱，流动相依次用水、10％乙醇、40％乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，收集40％乙醇洗脱液，减压蒸馏干燥回收得到干燥洗脱物。
步骤三：将上述洗脱物用甲醇溶解，正相硅胶拌样，拌样硅胶干法上样，干法上柱，用常压正相硅胶柱色谱进行分离，流动相用氯仿：甲醇＝15:1～8:1进行梯度洗脱，收集氯仿：甲醇＝10:1～8:1流分，合并相同组分，减压浓缩得到含莫诺苷和马钱子苷的混合样品，所用正相硅胶为160～200目。
步骤四：将含莫诺苷和马钱子苷的混合样品用纯水溶解，上中压反相c18色谱柱，流动相：乙醇：水＝5:95～20:80梯度洗脱，收集乙醇：水＝5:95～8:92流份，合并相同组分，得到纯度≧90％的莫诺苷；收集乙醇：水＝10:90～20:80流份，合并相同组分，得到纯度≧90％的马钱子苷。
步骤五：纯度≧90％的莫诺苷粗品和马钱子苷粗品，分别用spehadexlh-20凝胶进行纯化，流动相分别用氯仿：甲醇＝1.5:1和2.5:1进行洗脱，合并相同组分，减压蒸干同时得到≧98％高纯度的莫诺苷和马钱子苷。将得到的单体用高效液相检测，最终确定莫诺苷和马钱子苷的纯度。
本发明中乙醇的浓度均指体积浓度，混合溶剂中溶剂之间的比例均指体积比，莫诺苷和马钱子苷的纯度为质量百分比纯度。
实施例1山茱萸果实的提取
将干燥的山茱萸果实10kg粉碎过20目筛，溶剂用50％乙醇，液料比用10:1进行超声提取，超声波的功率为300w，提取时间为60min，连续提取三次，合并提取液，减压浓缩干燥得到山茱萸提取物。
实施例2高纯度莫诺苷和马钱子苷的制备
1)大孔吸附树脂富集
将山茱萸提取物，加水溶解，过滤，得滤液。将滤液湿法上样到hp-20型大孔吸附树脂柱，使样品完全吸附后，依次用纯水、10％、40％、70％、95％乙醇梯度洗脱，收集洗脱液。流速为40ml/min，每个梯度洗脱3个柱体积。根据薄层和高效液相色谱检测，目标物全部富集在40％乙醇洗脱部位，将40％乙醇洗脱部位减压浓缩干燥。
2)正相硅胶柱分离
取上述干燥物500g，用5000ml甲醇溶解，正相硅胶(160-200目)拌样；用常压硅胶柱色谱分离，5000g正相硅胶(160-200目)干法上柱，流动相用氯仿：甲醇＝15:1～8:1，按照氯仿与甲醇的体积比分别为15:1、12:1、10:1、9:1、8:1，进行梯度洗脱，流速为30ml/min，每个梯度洗脱3个柱体积。分别收集氯仿：甲醇＝10:1～8:1流分，合并相同组分；减压回收得到含莫诺苷和马钱子苷的混合样品。
3)中压反相硅胶柱分离
取步骤2)中含莫诺苷和马钱子苷的混合样品100g用纯水溶解，过滤，滤液上中压(压力在0-50mpa之间，使用时压力在5-25mpa之间)反相硅胶c18柱(填料c18，填装量1200g)，流动相用：乙醇：水＝5:95～20:80，分别为5:95、7:93、8:92、10:90、12：88、15:85、20:80进行梯度洗脱，流速：30ml/min，每个梯度洗脱4个柱体积；收集乙醇：水＝5:95～8:92流分，根据硅胶薄层色谱和高效液相色谱合并相同组分，减压浓缩干燥，得到纯度≧90％的莫诺苷粗品；收集乙醇：水＝10:90～20:80流分，根据硅胶薄层色谱和高效液相色谱合并相同组分，减压浓缩干燥，得到纯度≧90％的马钱子苷粗品。中压反相硅胶柱，一次装柱可以反复使用，且洗脱速度快，时间短，效率高。
4)凝胶柱纯化
分别取步骤3)中纯度≧90％的莫诺苷和马钱子苷样品，分别用纯水溶解，经sephadexlh-20凝胶纯化，流动相分别用氯仿：甲醇＝1.5:1和2.5:1进行洗脱，流速为6ml/min，根据硅胶薄层色谱和高效液相色谱合并相同组分，减压蒸干得到≧98％高纯度的莫诺苷和马钱子苷。凝胶柱可以反复使用，所用流动相为正相体系，每次柱层析时间短，分离和回收效率高。
实施例3hplc检测方法
液相色谱仪：waters2545型2998型紫外检测器
色谱柱:waterssunfirec18column(4.6×250mm，5μm)
流动相：甲醇：水＝30:70
流速：1ml/min
检测波长：240nm
进样量:10μl
出峰时间：莫诺苷为9.22min，马钱子苷为20.92min
供试品及对照品配制溶液：色谱级甲醇溶解。
采用上述仪器和方法，对实施例2得到的莫诺苷和马钱子苷进行检测，莫诺苷和马钱子苷纯度检查hplc色谱分别如图1和图2所示，经与对照品图谱对比，确定为莫诺苷和马钱子苷单体，且纯度均≧98％。
本发明将山茱萸提取物经大孔吸附树脂和正相硅胶初步分离，再用中压色谱仪反相柱进行分离，流动相为乙醇：水＝5:95～20:80进行梯度洗脱，合并相同组分，减压浓缩得到纯度≧90％的莫诺苷和马钱子苷粗品；最后分别经sephadexlh-20凝胶柱色谱纯化，流动相用：氯仿：甲醇＝1.5:1和2.5:1分别进行洗脱，合并相同组分，减压蒸干得到纯度在98％以上的莫诺苷和马钱子苷。莫诺苷和马钱子苷在中压反相硅胶柱色谱上有显著的分离效果，一次就可以将两者完全分离开，且速度快、效率高。本方法操作简单易行，条件温和，适合用山茱萸提取物同时规模化制备和生产纯度≧98％的莫诺苷和马钱子苷。