抗体及抗体改造方法与流程
本发明属于蛋白工程领域，涉及蛋白质分子内或分子间的二硫键改造方法。具体而言，本发明涉及对抗体的重链和轻链之间的二硫键进行改造以改变或提高其结合特异性的方法。本发明还涉及经过二硫键改造的抗体例如双特异性抗体、其制备方法和用途。
技术背景：
在生物医药领域，抗体药物已经广泛应用于各种疾病例如恶性肿瘤、自身免疫疾病、炎症感染、心血管病等重大疾病的等的治疗。其中双特异性抗体(bispecificantibody，bsab)是一类能结合至少两种抗原表位的抗体，相对于传统单一靶点的抗体来说，其安全性和有效性得到了很大的改善，是抗体工程领域以及肿瘤免疫治疗领域的一个研发热点。
双特异性抗体并非细胞天然产生的抗体，只能通过细胞融合或dna重组技术进行人工制备。在制备双特异性抗体时，需要同时表达两条不同的重链以及两条不同的轻链，通过两对hc-lc的配对形成识别两种抗原的fab。在此过程中，同源重链结合以及异源轻链结合产生的错配问题，会产生十种不同的产物，其中只有一种是所需要的正确产物。因而制备该种抗体所需要解决的主要问题是不同链的随机装配如同源重链错配、轻链错配以及其他非目的产物的污染等问题。
尽管对于双特异性抗体的错配问题已经有了一些解决方案，但仍存在稳定性和溶解性低、工艺复杂、产量低等各种问题。因此，仍然需要对双特异性抗体进行改造以降低其重链和轻链之间的错配，并提高目的产物的产率的新方法。
发明概述
本发明人对抗体的重链和轻链的相互作用和空间结构进行了深入的分析，发现将抗体的重链恒定区1(ch1)-轻链恒定区(cl)界面中的特定位点引入非天然二硫键，在引入极少的位点突变且不影响抗体结构和功能的基础上，能够改变或提高抗体的重链和轻链之间的相互作用。上述方法可以用于对抗体或抗体片段进行改造。
相应的，一方面，本发明涉及对抗体的fab区进行改造的方法，所述方法包括将选自以下的一项或多项突变引入所述fab区的步骤：
a)ch1中的f170c和cl中的s162c；
b)ch1中的l128c和cl中的f118c；
c)ch1中的f126c和cl中的q124c；
d)ch1中的v173c和cl中的q160c；
e)铰链区中的k218e或k218d突变和cl中的e213r或e213k突变，其中根据eu编号对所述抗体重链和轻链进行编号。
在上述方法的一些实施方案中，对fab区引入突变a)-e)中的1项、2项、3项、4项或5项。在优选的实施方案中，对fab区引入突变a)-d)中的1项或2项突变，和任选的突变e)。
在一些实施方案中，上述方法还包括破坏铰链区-cl之间的天然二硫键，即破坏由铰链区中的第220位的半胱氨酸(c220)和cl中的第214位的半胱氨酸(c214)之间形成的二硫键。因此，在一些实施方案中，本发明的方法还包括将铰链区中的c220突变为除半胱氨酸以外的其它氨基酸或缺失c220，和/或将cl中的c214突变为除半胱氨酸以外的其它氨基酸或缺失c214。在优选的实施方案中，所述除半胱氨酸以外的其它氨基酸选自丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸。
在上述方法的任意实施方案中，所述fab区来源于igg、iga、igm、ige或igd，例如igg1、igg2、igg3或igg4同种型。
另一方面，本发明涉及生产具有至少两个不同的fab区的抗体或抗体片段的方法，所述方法包括以下步骤：
1)在所述抗体或抗体片段的第一fab区引入选自以下的一项或多项突变：
a)ch1中的f170c和cl中的s162c；
b)ch1中的l128c和cl中的f118c；
c)ch1中的f126c和cl中的q124c；
d)ch1中的v173c和cl中的q160c；和
e)铰链区中的k218e或k218d突变和cl中的e213r或e213k突变，其中根据eu编号进行编号，
2)在表达所述抗体或抗体片段的条件下，培养含有编码所述抗体或抗体片段的核酸的宿主细胞，和
3)从所述宿主细胞培养物回收所述抗体或抗体片段。
在一些实施方案中，上述方法还包括在在所述抗体或抗体片段的第二fab区引入选自以下的一项或多项突变：
a)ch1中的f170c和cl中的s162c；
b)ch1中的l128c和cl中的f118c；
c)ch1中的f126c和cl中的q124c；
d)ch1中的v173c和cl中的q160c；和
e)铰链区中的k218e或k218d突变和cl中的e213r或e213k突变，其中引入所述第一fab区的突变和引入所述第二fab区的突变不完全相同。
在上述方法的一些实施方案中，在所述第一fab区中引入突变a)-e)中的1项、2项、3项、4项或5项，在所述第二fab区中引入突变a)-e)中的1项、2项、3项、4项或5项，且其中引入所述第一fab区的突变和引入所述第二fab区的突变不完全相同。在优选的实施方案中，在所述第一fab区和/或第二fab区中引入突变a)-d)中的1项或2项，和任选的突变e)。
在一些实施方案中，上述方法还包括破坏所述第一fab区和/或第二fab区中铰链区cl之间的天然二硫键，即将所述第一fab区和/或第二fab区的铰链区中的c220突变为除半胱氨酸以外的其它氨基酸或缺失c220，和/或将所述第一fab区和/或第二fab区和/或第二fab区的cl中的c214突变为除半胱氨酸以外的其它氨基酸或缺失c214。在优选的实施方案中，所述除半胱氨酸以外的氨基酸选自丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸。
在上述方法的一些实施方案中，所述第一fab和所述第二fab区结合不同的抗原。
在上述方法的一些实施方案中，所述第一fab区和第二fab区结合同一抗原的两个不同表位。
在上述对fab区进行改造的方法和抗体或抗体片段的生产方法的一些实施方案中，所述fab区、第一fab区和第二fab区结合选自下组的抗原：cd2，cd3，cd3e，cd4，cd11，cd11a，cd14，cd16，cd18，cd19，cd20，cd22，cd23，cd25，cd28，cd29，cd30，cd32a，cd32b，cd33(p67蛋白)，cd38，cd40，cd40l，cd52，cd54，cd56，cd64，cd80，cd147，gd3，il-1α，il-1β，il-1r，il-2，il-2r，il-4，il-5，il-5r，il-6，il-6r，il-8，il-9，il-12，il-13，il-15，il-17，il-17r，il-18，il-23，干扰素α，干扰素β，干扰素γ；tnf-α，tnfβ，tnf-r1，tnf-rii，fasl，cd27l，cd30l，4-1bbl，trail，rankl，tweak，april，baff，light，veg1，ox40l，trail受体-1，腺苷受体，淋巴毒素β受体，taci，baff-r，epo；lfa-3，icam-1，icam-3，epcam，整联蛋白β1，整联蛋白β2，整联蛋白α4/β7，整联蛋白α2，整联蛋白α3，整联蛋白α4，整联蛋白α5，整联蛋白α6，整联蛋白αv，整联蛋白αvβ3，fgfr-3，角质形成细胞生长因子，vla-1，vla-4，l-选择素，抗id，e-选择素，hla，hla-dr，ctla-4，t细胞受体，b7-1，b7-2，vnr整联蛋白，tgfβ1，tgfβ2，嗜酸性粒细胞趋化因子1(eotaxin1)，blys(b淋巴细胞刺激因子)，补体c5，ige，因子vii，cd64，cbl，nca90，egfr(erbb-1)，her1，her2/neu(erbb-2)，her3(erbb-3)，her4(erbb4)，组织因子，内皮素受体，vla-4，半抗原np-cap或nip-cap，e-选择素，地高辛，胎盘碱性磷酸酶(plap)和睾丸plap样碱性磷酸酶，转铁蛋白受体，癌胚抗原(cea)，ceacam5，hmfg1,pem，粘蛋白muc1，muc18，肝素酶i，人心脏肌球蛋白，肿瘤相关糖蛋白-72(tag-72)，肿瘤相关抗原ca125，前列腺特异性膜抗原(psm-a)，高分子量黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)，癌(carcinoma)相关抗原，gco蛋白iib/iiia(gpiib/iiia)，表达lewisy相关碳水化合物的肿瘤相关抗原，人巨细胞病毒(hcmv)gh包膜糖蛋白，hivgp120，hcmv，呼吸合胞病毒rsvf，rsvffgp，细胞角蛋白肿瘤相关抗原，hepbgp120，cmv，gpiibiiia，hiviiibgp120v3环，呼吸道合胞病毒(rsv)fgp，单纯疱疹病毒(hsv)gd糖蛋白，hsvgb糖蛋白，hcmvgb包膜糖蛋白和产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)毒素，cd133，cd138，ox40，gitr，pd-1，pd-l1，pd-l2，ctla-4，kir，lag-3，tcrα，tcrβ，tcrγ，tcrδ，vegf，egf，vegfr，egfr，epcam，间皮素，glypicans，erbl，erb2，b7-h3，icos，bmp1，bmp2，bmp3b，bmp4，csf1，gm-csf，fgf1，fgf2，fgf3，fgf4，pdgfr，tigit，cs1，tweak，ccl1，ccl2，ccl3，ccl13，cxcl1，cxcl2，cxcl3，ip-10，岩藻糖基-gm1，igf1，igf2，igf1r，igf2r，rank配体，dll-4，gm-csfr，adams，肌生成抑制素，pcsk9，cxcr4，mif，peg2。在优选的实施方案中，所述fab区、第一fab区和第二fab区结合选自cd3和her2的抗原。
在一些实施方案中，上述生产方法用于生产抗体片段，所述抗体片段选自fab片段、fab'片段和f(ab')2片段。
在一些实施方案中，上述生产方法用于生产双特异性抗体，所述双特异性抗体具有第一重链和第一轻链，以及第二重链和第二轻链，其中所述第一重链和第一轻链形成所述第一fab区，所述第二重链和第二轻链形成所述第二fab区。
在一些实施方案中，上述方法还包括对所述第一重链引入p395k、p396k和v397k，且对所述第二重链引入t394d、p395d和p396d，或对所述第一重链引入t394d、p395d和p396d，且对所述第二重链引入p395k、p396k和v397k。上述突变能够增加第一重链和第二重链之间的结合特异性，以避免形成重链同源二聚体。
在上述方法的一些实施方案中，所述抗体或抗体片段来源于igg、iga、igm、ige或igd，例如igg1、igg2、igg3或igg4同种型。
本发明还涉及通过上述方法产生的抗体或抗体片段。
再一方面，本发明涉及具有至少两个不同的fab区的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段的第一fab区具有选自以下的一项或多项突变：
a)ch1中的f170c和cl中的s162c；
b)ch1中的l128c和cl中的f118c；
c)ch1中的f126c和cl中的q124c；
d)ch1中的v173c和cl中的q160c；和
e)铰链区中的k218e或k218d突变和cl中的e213r或e213k突变，
其中根据eu编号进行编号。
在上述抗体或抗体片段的一些实施方案中，所述抗体或抗体片段的第二fab区具有选自以下的一项或多项突变：
a)ch1中的f170c和cl中的s162c；
b)ch1中的l128c和cl中的f118c；
c)ch1中的f126c和cl中的q124c；
d)ch1中的v173c和cl中的q160c；和
e)铰链区中的k218e或k218d突变和cl中的e213r或e213k突变，
其中所述第二fab区的突变和所述第一fab区的突变不完全相同。
在上述抗体或抗体片段的一些实施方案中，所述第一fab区具有突变a)-e)中的1项、2项、3项、4项或5项，所述第二fab区具有突变a)-e)中的1项、2项、3项、4项或5项，且其中所述第一fab区的突变和所述第二fab区的突变不完全相同。在优选的实施方案中，所述第一fab区和/或第二fab区具有突变a)-d)中的一项或两项，和任选的突变e)。
在上述抗体或抗体片段的一些实施方案中，所述第一fab区和/或第二fab区还具有铰链区中的c220突变为除半胱氨酸以外的其它氨基酸或缺失c220，和/或cl中的c214突变为除半胱氨酸以外的其它氨基酸或缺失c214。其中，所述除半胱氨酸以外的其它氨基酸优选选自丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸。
在上述抗体和抗体片段的一些实施方案中，所述第一fab区和所述第二fab区结合不同的抗原。
在上述抗体和抗体片段的一些实施方案中，所述第一fab区和第二fab区结合同一抗原上的两个不同的表位。
在上述抗体和抗体片段的一些实施方案中，所述抗原选自下组：cd2，cd3，cd3e，cd4，cd11，cd11a，cd14，cd16，cd18，cd19，cd20，cd22，cd23，cd25，cd28，cd29，cd30，cd32a，cd32b，cd33(p67蛋白)，cd38，cd40，cd40l，cd52，cd54，cd56，cd64，cd80，cd147，gd3，il-1α，il-1β，il-1r，il-2，il-2r，il-4，il-5，il-5r，il-6，il-6r，il-8，il-9，il-12，il-13，il-15，il-17，il-17r，il-18，il-23，干扰素α，干扰素β，干扰素γ；tnf-α，tnfβ，tnf-r1，tnf-rii，fasl，cd27l，cd30l，4-1bbl，trail，rankl，tweak，april，baff，light，veg1，ox40l，trail受体-1，腺苷受体，淋巴毒素β受体，taci，baff-r，epo；lfa-3，icam-1，icam-3，epcam，整联蛋白β1，整联蛋白β2，整联蛋白α4/β7，整联蛋白α2，整联蛋白α3，整联蛋白α4，整联蛋白α5，整联蛋白α6，整联蛋白αv，整联蛋白αvβ3，fgfr-3，角质形成细胞生长因子，vla-1，vla-4，l-选择素，抗id，e-选择素，hla，hla-dr，ctla-4，t细胞受体，b7-1，b7-2，vnr整联蛋白，tgfβ1，tgfβ2，嗜酸性粒细胞趋化因子1(eotaxin1)，blys(b淋巴细胞刺激因子)，补体c5，ige，因子vii，cd64，cbl，nca90，egfr(erbb-1)，her1，her2/neu(erbb-2)，her3(erbb-3)，her4(erbb4)，组织因子，内皮素受体，vla-4，半抗原np-cap或nip-cap，e-选择素，地高辛，胎盘碱性磷酸酶(plap)和睾丸plap样碱性磷酸酶，转铁蛋白受体，癌胚抗原(cea)，ceacam5，hmfg1,pem，粘蛋白muc1，muc18，肝素酶i，人心脏肌球蛋白，肿瘤相关糖蛋白-72(tag-72)，肿瘤相关抗原ca125，前列腺特异性膜抗原(psm-a)，高分子量黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)，癌(carcinoma)相关抗原，gco蛋白iib/iiia(gpiib/iiia)，表达lewisy相关碳水化合物的肿瘤相关抗原，人巨细胞病毒(hcmv)gh包膜糖蛋白，hivgp120，hcmv，呼吸合胞病毒rsvf，rsvffgp，细胞角蛋白肿瘤相关抗原，hepbgp120，cmv，gpiibiiia，hiviiibgp120v3环，呼吸道合胞病毒(rsv)fgp，单纯疱疹病毒(hsv)gd糖蛋白，hsvgb糖蛋白，hcmvgb包膜糖蛋白和产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)毒素，cd133，cd138，ox40，gitr，pd-1，pd-l1，pd-l2，ctla-4，kir，lag-3，tcrα，tcrβ，tcrγ，tcrδ，vegf，egf，vegfr，egfr，epcam，间皮素，glypicans，erbl，erb2，b7-h3，icos，bmp1，bmp2，bmp3b，bmp4，csf1，gm-csf，fgf1，fgf2，fgf3，fgf4，pdgfr，tigit，cs1，tweak，ccl1，ccl2，ccl3，ccl13，cxcl1，cxcl2，cxcl3，ip-10，岩藻糖基-gm1，igf1，igf2，igf1r，igf2r，rank配体，dll-4，gm-csfr，adams，肌生成抑制素，pcsk9，cxcr4，mif，peg2。在优选的实施方案中，所述抗原选自cd3和her2。
在一些实施方案中，所述抗体片段选自fab片段、fab'片段和f(ab')2片段。
在一些实施方案中，所述抗体是具有第一重链和第一轻链，以及第二重链和第二轻链的双特异性抗体，其中所述第一重链和第一轻链形成所述第一fab区，所述第二重链和第二轻链形成所述第二fab区。在进一步的实施方案中，第一重链具有p395k、p396k和v397k突变，且所述第二重链具有t394d、p395d和p396d突变，或所述第一重链具有t394d、p395d和p396d和突变，且所述第二重链具有p395k、p396k和v397k突变。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段来源于igg、iga、igm、ige或igd，例如igg1、igg2、igg3或igg4。
在另一方面，本发明涉及对双特异性抗体进行改造的方法，其中所述双特异性抗体具有结合cd3的第一重链和第一轻链，和结合her2的第二重链和第二轻链，所述第二重链具有seqidno:7的氨基酸序列，且所述第二轻链具有seqidno:5的氨基酸序列，所述方法包括对所述第二重链和第二轻链引入选自以下a)-d)的1项或2项突变：
a)重链恒定区1(ch1)中的f170c和轻链恒定区(cl)中的s162c；
b)ch1中的l128c和cl中的f118c；
c)ch1中的f126c和cl中的q124c；和
d)ch1中的v173c和cl中的q160c，
其中根据eu编号对所述抗体重链和轻链进行编号。
在上述改造方法的一些实施方案中，还包括将所述第二重链的铰链区中的c220突变为除半胱氨酸以外的其它氨基酸或缺失c220，和/或将所述第二轻链的cl中的c214突变为除半胱氨酸以外的其它氨基酸或缺失c214的步骤。
在上述改造方法的一些实施方案中，还包括向所述第一重链引入k218e或k218d突变，并向所述第一轻链引入e213r或e213k突变；或向所述都第二重链引入k218e或k218d突变，并向所述第二轻链引入e213r或e213k突变。
在上述改造方法的一些实施方案中，所述第一重链具有seqidno:3的氨基酸序列，所述第一轻链具有seqidno:1的氨基酸序列。
本发明还涉及通过上述改造方法获得的双特异性抗体。
在一方面，本发明涉及抗体或抗体片段，其具有选自下组的cl区：seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25和seqidno:27。
在一方面，本发明涉及抗体或抗体片段，其具有选自下组的ch1区或铰链区：seqidno:29、seqidno:31、seqidno:33、seqidno:35、seqidno:37、seqidno:39、seqidno:41和seqidno:43。
在一方面，本发明涉及抗体或抗体片段，其具有选自下组的cl区和ch1区：
a)seqidno:11的cl区和seqidno:33的ch1区；
b)seqidno:13的cl区和seqidno:29的ch1区；
c)seqidno:15的cl区和seqidno:35的ch1区；
d)seqidno:17的cl区和seqidno:33的ch1区；和
e)seqidno:27的cl区和seqidno:43的ch1区。
在另一方面，本发明涉及抗体偶联物，其包含本发明的抗体或抗体片段，或双特异性抗体，以及与所述抗体或抗体片段，或双特异性抗体偶联的部分，其中所述部分选自细胞毒素、放射性同位素、荧光标记物、发光物、显色物质或酶。
在一些实施方案中，与本发明的抗体或抗体片段，或双特异性抗体偶联以形成抗体偶联物的部分是细胞毒素。在一些实施方案中，所述细胞毒素选自：秋水仙素，emtansine,maytansinoid,auristatin,vindesine,tubulysin等。
在一些实施方案中，与本发明的抗体或抗体片段，或双特异性抗体偶联以形成抗体偶联物的部分是放射性同位素。在一些实施方案中，所述放射性同位素选自：at211,i131,i125,y90,re186,re188,sm153,bi212,p32的放射性同位素等。
在一些实施方案中，与本发明的抗体或抗体片段，或双特异性抗体偶联以形成抗体偶联物的部分选自荧光标记物、发光物和显色物质，例如：fitc,luciferase,hrp等。
在一些实施方案中，与本发明的抗体或抗体片段，或双特异性抗体偶联以形成抗体偶联物的部分是酶，例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其活性片段和/或变体。
在再一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体，或抗体偶联物，和任选地一种或多种药学上可接受的载体，表面活性剂和/或稀释剂。
在一个方面，本发明涉及本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体，或抗体偶联物在制备用于治疗疾病的药物组合物中的用途。在一些实施方案中，所述疾病是癌症。
在另一个方面，本发明涉及治疗疾病的方法，其包括使用本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体、抗体偶联物或药物组合物的步骤。在一些实施方案中，所述疾病是癌症。
在一个方面，本发明包括核酸分子，其包含选自下组的核苷酸序列：seqidno:12、seqidno:14、seqidno:16、seqidno:18、seqidno:20、seqidno:22、seqidno:24、seqidno:26、seqidno:28、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:34、seqidno:36、seqidno:38、seqidno:40、seqidno:42和seqidno:44。
在另一个方面，本发明包括载体，其包含本发明的核酸分子。
在再一个方面，本发明包括宿主细胞，其包含本发明的核酸分子或载体。
附图说明
图1显示了可以使用本发明的方法进行改造或生产的抗体的结构的示意图。所述抗体可以具有不同的结构，并且可以是双特异性、三特异性或四特异性的抗体。其中，图1a显示了常见的“y”字型的抗体，其可以是双特异性抗体。图1b-1h显示了由图1a衍生的三特异性和四特异性抗体形式。
图2显示了蛋白a亲和层析纯化后，通过本发明的方法改造的抗her2×抗cd3双特异性抗体mutb、mutc、mutd和mute和对照双特异性抗体wt的sds-page电泳结果图。图中的wt是指由质粒pfuse-her2-hc-ob-6his、pfuse-c31-hc-oa、pcdna3.1-c31-lc，和pcdna3.1-her2-lc编码的双特异性抗体，其中wt(1:1:1:1)表示上述四种质粒以1:1:1:1的比例转染；wt(2:1:1:1)表示质粒pfuse-her2-hc-ob-6his,pfuse-c31-hc-oa,pcdna3.1-c31-lc,pcdna3.1-her2-lc的转染比例为2:1:1:1。图2a显示了非还原性sds-page电泳结果，图2b显示了还原性sds-page电泳结果。
图3显示了蛋白a亲和层析纯化后，在mutc的基础上进一步改造的双特异性抗体mutc-er、mutc+er和mutc-dec的sds-page电泳结果图。图3a显示了非还原性sds-page电泳结果，图3b显示了还原性sds-page电泳结果。
图4显示了通过阳离子交换层析(ciex)方法进一步纯化双特异性抗体mutc的峰形图和纯化后的sds-page电泳结果图。其中图4a为双特异性抗体mutc样品的ciex峰形图；图4b为非还原性sds-page电泳图，从左至右泳道1为蛋白marker；泳道2为经过蛋白a亲和层析纯化后尚未进行ciex方法的样品，其标记为input；泳道3-4为对应ciex的a峰的样品；泳道5-10为对应ciex的b峰的样品。图4c为对应图4b的还原性sds-page电泳图。
图5显示了蛋白a亲和层析纯化后，本发明的双特异性抗体mutc-d+er和mutc-d-dec的sds-page电泳结果图。其中5a为非还原性sds-page电泳图，图5b为还原性sds-page电泳图。
图6显示了抗her2×抗cd3双特异性抗体结合人源her2抗原的elisa结果。图6a显示了双特异性抗体mutc、mutc+er和mutc-er的结果。图6b显示了mutc-dec、mutc-d+er和mutc-d-dec的结果。
图7显示了her2×抗cd3双特异性抗体结合人源cd3抗原的elisa结果。图7a显示了双特异性抗体mutc、mutc+er和mutc-er的结果。图7b显示了mutc-d+er、mutc-d-dec和mutc-dec的结果。
图8显示了使用hrp标记的人源her2抗原和吸附于酶标板的人源cd3抗原的双抗原elisa实验检测抗体对两种抗原的结合的结果。图8a显示了相比于对照wt和higg，本发明的双特异性抗体mutb、mutc和mutd在结合两种抗原的elisa结果。图8b显示了双特异性抗体mute的结果。
图9显示了不同浓度的双特异性抗体介导的t细胞活化和对肿瘤细胞杀伤(ctl)的实验结果。图9a显示了双特异性抗体mutb、mutc和mutd相比于对照wt和higg的结果。图9b显示了双特异性抗体mutc和mute的结果。
图10显示了不同浓度的双特异性抗体介导的t细胞活化和对肿瘤细胞杀伤(ctl)的实验结果。图10a显示了双特异性抗体mutc、mutc+er和mutc-er相比于对照wt和higg的结果。图10b显示了双特异性抗体mutc-d+er、和mutc-d-dec和mutc-dec的结果。
发明详述
术语和缩略语
除非本文另有定义，与本申请结合使用的科学和技术术语及其缩略语应具有本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义。以下列举了本文中使用的部分术语和缩略语。
bsab：双特异性抗体(bispecificantibody)
hc：重链(heavychain)
lc：轻链(lightchain)
vh：重链可变区(variableregionofheavychain)
vl：轻链可变区(variableregionoflightchain)
ch：重链恒定区(constantregionofheavychain)
cl：轻链恒定区(constantregionoflightchain)
cdr：抗原互补决定区(complementaritydeterminingregion)
scfv：单链可变区抗体片段(single-chainvariablefragment)
adcc：抗体依赖的细胞毒性作用(antibodydependentcellularcytotoxicity)
elisa：酶联免疫吸附剂测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay)
本发明所述分子克隆、细胞培养、蛋白纯化、免疫学实验的操作步骤为该领域内被广泛应用的常规步骤。除非另外指明，否则本发明所述氨基酸序列按照从氨基端到羧基端的方向排列并书写。本发明所提及的氨基酸三字母缩写及核苷酸单字母缩写为该技术领域普遍接受的形式，氨基酸单字母缩写为iupac-iub生物化学命名委员会(iupac-iubbiochemicalnomenclaturecommission)推荐的形式。
术语“氨基酸”是指20种天然存在的氨基酸之一或可以存在于特定位置的任何非天然类似物。本发明所述“氨基酸突变”是指多肽序列中的氨基酸取代、添加、插入和/或缺失。本文中优选的氨基酸突变是取代。本发明中“氨基酸取代”或“取代”是指将亲本多肽序列中特定位置的氨基酸替代为另一种氨基酸。例如，取代c220s是指变体多肽，其中多肽的位置220处的半胱氨酸已被丝氨酸取代。
术语“抗体”指包含至少一个抗原识别位点并能特异性结合抗原的免疫球蛋白分子。在此，术语“抗原”是在机体内能诱发免疫应答且与抗体特异性结合的物质，如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、半抗原或上述物质的组合。抗体与抗原的结合依靠二者间形成的相互作用来介导，包括氢键、范德华力、离子键以及疏水键。抗原表面与抗体结合的区域为“抗原决定簇”或“表位”，一般来说，每个抗原有多个决定簇。
本发明所提及的术语“抗体”以其最广泛的含义理解，并包含单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体片段、包含至少两个不同的抗原结合结构域的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。抗体还包括鼠源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体以及其它来源的抗体。本发明的抗体可以来源于任何动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、牛、马、鸡、骆驼、美洲驼羊(llama)、羊驼(alpaca)、大羊驼(guanaco)、骆马(vicunas)或鲨鱼的免疫球蛋白分子等。抗体可以含有另外的改变，如非天然氨基酸，fc效应子功能突变和糖基化位点突变。抗体还包括翻译后修饰的抗体、包含抗体的抗原决定簇的融合蛋白，以及包含对抗原识别位点的任何其它修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体展现出所期望的生物活性。换句话说，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即至少含有一个抗原结合结构域的分子。
根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，可以将人免疫球蛋白分为5类：iga、igd、ige、igg和igm，其还可以进一步分成不同的亚类(同种型)，如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2等。根据轻链氨基酸序列，可将轻链分类为λ链或κ链。本发明的抗体可以是任何种类(如iga、igd、ige、igg和igm)或亚类(如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1或iga2)。
术语“人源化抗体”是指非人类物种如大鼠、小鼠等产生的抗体，经过修饰改造后保留亲本抗体与抗原结合的亲和力，同时减少异源抗体在人体内的免疫原性。一般来说，人源化抗体的cdr区氨基酸序列与亲本抗体(非人源抗体)基本一致，而框架区以及恒定区氨基酸序列为人免疫球蛋白的序列。人源化抗体可以是任何类别的免疫球蛋白的任何种类(如iga、igd、ige、igg和igm)或亚类(如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1或iga2)。人源化抗体的cdr区或框架区与亲本抗体的序列并不完全对应，可以根据实际需求进行残基插入、缺失或取代以便使抗体产生所期望的特性。对非人源抗体进行人源化改造可通过本领域中已知的方法来制备，包括cdr移植法、表面重组法、分子建模法等。
术语“双特异性抗体”是指能够结合两个独立抗原或对同一抗原内不同表位具有结合特异性的抗体分子。例如双特异性抗体分子的一臂结合肿瘤相关抗原，另一臂结合免疫细胞相关抗原，这样可以在肿瘤细胞处激活并启动细胞免疫相关机制。术语“多特异性抗体”是指双特异性，三特异性或四特异性抗体。多特异性抗体包括两种或更多种不同的抗原结合结构域，因此能够与两种、三种、四种或更多种不同的抗原结合。
术语“抗体”还包括抗体片段。“抗体片段”或“抗原结合片段”包括但不限于：(i)fab片段，其具有vl、cl、vh和ch1域；(ii)fab'片段，其是在ch1域的c端具有一个或多个半胱氨酸残基的fab片段；(iii)具有vh和ch1域的fd片段；(iv)fd'片段，其具有vh和ch1域和在ch1域的c端的一个或多个半胱氨酸残基；(v)fv片段，其具有抗体的单一臂的vl和vh域；(vi)dab片段，其由vh域或vl域组成；(vii)f(ab')2片段，一种包含由铰链区处的二硫键连接的两个fab'片段的二价片段；(viii)单链可变片段(scfv)。本文所用“抗体片段”不仅包含上述抗体片段，还包括由全抗体改造而来的抗体及使用重组dna技术而合成的新的抗体。
抗体的“可变区”是指抗体重链或轻链的可变区，包含各个可变区单独以及组合的形式。重链和轻链的可变区分别由三个互补决定区(complementaritydeterminingregion，cdr，又被叫做高可变区)以及位于cdr侧翼的四个框架区(frameworkregion，fr)组成。框架区对cdr起到支撑作用，并限定了各个cdr间的空间关系。重链或轻链的cdr由氨基端开始分别表示为cdr1、cdr2、cdr3。重链和轻链可变区通过非共价键结合，重链的3个cdr和轻链的3个cdr共同构成了抗原识别位点，该部分氨基酸残基是抗体参与抗原结合的主体，构成抗体识别抗原的特异性。
术语“抗体的fc区”或“人免疫球蛋白fc区”包含抗体除重链恒定区1(ch1)之外的恒定区多肽，即人免疫球蛋白iga、igd、igg重链恒定区羧基端的两个恒定区结构域ch2及ch3，以及人免疫球蛋白ige和igm重链恒定区羧基端的三个恒定区结构域ch2、ch3及ch4，并且还包括这些结构域氨基端的柔性铰链区。虽然fc区的边界可以变化，但人igg重链fc区通常定义为包含从a231开始到其羧基末端的残基。
免疫球蛋白fc区是抗体发挥免疫效应的功能域。igg抗体的fc能够与多种受体相互作用，其中最重要的是fcγ受体家族。该受体家族包括5种激活型受体：fcγri、fcγriia、fcγriic、fcγriiia和fcγriiib，以及1种抑制型受体：fcγriib。fc与fcγr的胞外区结合形成fc/fcγr复合物，导致fcγr胞内区itam(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs，免疫受体酪氨酸激活基序)或itim(immunoreceptortyrosine-basedinhibitorymotifs，免疫受体酪氨酸抑制基序)磷酸化激活下游信号转导通路，产生免疫应答如内吞作用、吞噬作用、细胞杀伤作用等。除此之外，fc还能与补体蛋白c1q结合，产生补体依赖的细胞毒性(complementdependentcytotoxicity，cdc)效应。
术语“迷你抗体(minibody)”是指由抗体片段vl-vh-ch3组成的人工抗体片段。
术语“纳米抗体(nanobody)”是指由单一单体可变抗体区组成的骆驼科抗体片段。
术语“原抗体(probody)”是抗原结合部位被掩蔽，直到活化才能发挥功能的人工抗体分子。
本文所用“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。抗原决定簇大多存在于抗原物质的表面，有些存在于抗原物质的内部，须经酶或其他方式处理后才暴露出来。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团，如氨基酸、碳水化合物或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的点和特征。抗原表位可以是“线性的”或者“构象的”。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(如抗体)之间所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在；在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。一个天然抗原物质可有多种和多个决定簇。一般而言，抗原分子越大，决定簇的数目越多。
本文所用“特异性结合”是指，两种分子间的非随机的结合反应，如抗体及其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方案中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5m，例如小于大约10-6m、10-7m、10-8m、10-9m、或10-10m或更小的亲和力(kd)结合该抗原。在本发明的一些实施方案中，术语“靶向”指特异性结合。
本文所用“kd”是指，特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，用于描述抗体与抗原间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10-5m，例如小于大约10-6m、10-7m、10-8m、10-9m、或10-10m或更小的平衡解离常(kd)结合抗原。
本文所用术语“ec50”即半最大效应浓度(concentrationfor50％ofmaximaleffect)，是指引起50％最大效应所对应的抗体浓度。
本文所用“载体(vector)”是指可以将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。而当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，该载体称为表达载体。载体可以通过转化、转导或者转染等方法导入宿主细胞，继而使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内获得表达。载体是本领域技术人员公认的、包括但不局限于：(1)质粒；(2)噬菌粒；(3)柯斯质粒；(4)人工染色体，如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；(5)噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及(6)动物病毒，如逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、孢疹病毒(如单纯孢疹病毒)、痘病毒、杆状病毒。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不局限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因；此外，载体还可以含有复制起始位点。
本发明所述的抗体例如双特异性抗体可以用标准的实验方法从宿主细胞中提取纯化。例如，可以采用蛋白a或蛋白g亲和层析法纯化抗体。纯化手段包括但不限于亲和层析色谱法、离子交换法、体积排阻色谱法以及蛋白超滤法。本发明所述双特异性抗体的分离纯化方法也包括上述方法的组合。在此使用的“纯化”是指从细胞、细胞培养物或其他天然组分中分离和/或回收目的组分。如无特别指明，本发明所述的抗体均为经纯化的抗体。术语“分离的抗体”是指基本不含有不同结构或抗原特异性的其他分子的抗体，“分离的双特异性抗体”是基本不含有其他类型的抗体分子的抗体。
在本发明中，免疫球蛋白重链中残基的编号方式是如kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991)中的eu索引的编号方式，其也可以在万维网上获得，并且通过引用明确地完整并入本文。“如kabat中的eu索引”是指人igg1eu抗体的残基编号方式。如本文所用，“kabat序列编号方式”或“kabat标记”是指如kabat中的eu索引编号编码可变区的序列。对于重链可变区，根据kabat编号，高变区范围为cdr1的氨基酸位置31至35，cdr2的氨基酸位置50至65，以及cdr3的氨基酸位置95至102。对于轻链可变区，根据kabat编号，高变区范围为cdr1的氨基酸位置24至34，cdr2的氨基酸位置50至56，cdr3的氨基酸位置89至97。
抗体改造方法
抗体是抗原刺激机体产生免疫反应后，由浆细胞分泌的能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin，ig)。天然抗体一般为二价抗体(除igm类别以外)，即一个抗体分子包含两个抗原结合位点，每个fab臂含有一个抗原结合位点。抗体轻链通过两个二硫键与重链共价连接，重链-轻链二聚体再由重链间形成的二硫键构成y字形抗体分子。不同类别的抗体重链间的二硫键数量会有差异。位于y字形两条臂与主干间的区域为铰链区，具有一定的柔性。每条抗体多肽链包括可变区以及恒定区，通过空间折叠形成不同的结构域单元。其中，抗体的重链氨基端为可变区，其后为三个恒定区ch1、ch2、ch3；轻链氨基端为可变区，其后为一个恒定区cl。重链与轻链的可变区相互作用构成了抗原识别结合的区域，加上cl与ch1相互作用以及ch1和ch2之间的部分铰链区构成抗体fab区域；两条重链的ch2、ch3形成同源二聚体为igg抗体的fc区域；ch1、ch2之间的铰链区形成的二硫键进一步稳定了抗体的结构。
抗体的fab区包括抗体重链和轻链氨基端的可变区结构域以及位于其之后的一个恒定区结构域和部分铰链区构成。其中，重链第一个恒定区结构域(ch1)与轻链的恒定区结构域(cl)结合，重链的可变区结构域(vh)和轻链的可变区结构域(vl)结合。
相较于传统化疗药物，抗体具有毒副作用较小、特异性高、细胞杀伤效果好等优点，是当前制药领域的研发热点之一。自1986年第一个用于临床治疗的单克隆抗体药物抗cd3单抗莫罗莫那(muromonabokt3)经fda批准上市，单抗药物在恶性肿瘤、自身免疫疾病、炎症感染、心血管病等重大疾病的治疗中发展迅速，是生物医药领域复合增长率最高的一类产品。截至2016年底全球已有63种抗体类药物上市，全球抗体药物销售额超过1000亿美元，占全球药品销售额的20％以上。而且全球销售前10名的药品中，有6个是抗体类药物，其中半数以上用于癌症治疗领域。单抗药物的作用机理包括阻断生长信号、阻断肿瘤血管生成、诱导细胞凋亡、激活免疫细胞产生免疫效应，其中单抗发挥重要功能主要是通过fc与免疫细胞(如nk细胞、单核细胞等)表面的fcγr(fcγ受体)结合激活细胞增强adcc，抗体依赖的细胞毒性作用)、adcp(antibodydependentcellularphagocytosis)或通过fc与补体蛋白c1q结合增强cdc来发挥细胞杀伤作用。
虽然抗体药物在近十几年取得了突破进展，已成为未来制药行业发展的主要方向，但单抗药物在实际应用过程中仍然面临总体有效性低、容易产生耐药性等问题。fcγr在人群中具有多态性，如nk细胞表面的fcγriiia-v158与fc结合能力较高，而fcγriiia-f158结合能力较弱，这直接影响了部分病人对药物的响应，也是单抗药物有效性较低的原因之一。另外在治疗恶性肿瘤尤其是实体肿瘤时，单抗效果不佳，肿瘤异质性、肿瘤干细胞以及肿瘤细胞自身的多信号通路调节使得针对单一靶点的免疫治疗容易产生耐药性(becka,etal.natrevimmunol.2010；10(5):345-52.)。
由于t细胞并不表达fcγr，传统单抗并不能直接激活杀伤性t细胞，于是人们尝试通过改造传统单抗以达到激活t细胞杀伤肿瘤的目的，其中双特异性抗体(bsab)是目前最有应用前景的方法之一。bsab是一类能结合至少两种抗原表位的抗体，相对于传统单一靶点的抗体来说，其安全性和有效性得到了很大的改善，是抗体工程领域以及肿瘤免疫治疗领域的研发热点。在治疗恶性肿瘤的实际应用中，bsab通常同时结合肿瘤细胞表面抗原以及免疫细胞表面抗原，通过激活自身免疫系统杀伤肿瘤细胞(chamesp,etal.curropindrugdiscovdevel2009,12:276-283.)。
双特异性抗体并非细胞天然产生的抗体，只能通过细胞融合或dna重组技术进行人工制备，目前已有多种制备方法。早期的双特异性抗体多是通过已纯化好的单抗化学交联或两种不同的杂交瘤细胞融合产生，但这些方法生产的产品会有许多问题如产物不稳定、产量低下、抗体修饰不当、免疫原性、生产纯化困难等。随着近些年基因工程技术的进步，bsab大量通过基因工程技术制备，目前已有超过50种不同的双特异性抗体形式，总体可以分为两类：不包含fc以及包含fc区域的双特异性抗体(brinkmannu,etal.mabs2017,9:182-212.)。前者通常为分子量较小的抗体片段，不能介导fc相关的生物学功能。而后者通常为igg形式，该种抗体与天然抗体形式类似，其y字形的两臂可分别结合两种不同的抗原，fc区域能够介导adcc、adcp以及cdc，增加抗体在血液中的半衰期、稳定性和溶解性，容易通过现有的方法大量制备。
在制备igg结构的抗体时，需要同时表达两条不同的重链以及两条不同的轻链，通过两对hc-lc的配对形成识别两种抗原的fab，在这个过程中，同源重链结合以及异源轻链结合产生的错配问题，会产生十种不同的产物，而其中只有一个是所需要的正确产物。因而制备该种抗体所需要解决的主要问题是不同链的随机装配如同源重链错配、轻链错配以及其他非目的产物的污染等问题。
对于同源重链错配问题，一种解决方案是由ridgeway等人发明的igg抗体“knobintohole”嵌合技术(简称“kih”)，其基本原理是在igg抗体的两条重链的fc区域引入不同的氨基酸突变，在第一条重链中引入具有大侧链基团的氨基酸(t366y)而在第二条重链中引入具有小侧链基团的氨基酸(y407t)。当这两条链在细胞内同时表达时，由于空间结构互补，它们倾向于结合在一起形成异源二聚体，而不是同源二聚体，为了克服突变所带来的不稳定性，研究者又进一步通过噬菌体展示技术筛选随机突变，构建了更加稳定的结构，即：凸起结构-t366w，凹陷结构-t366s，l368a，y407v。理论上，通过这种方法可以使任意两个不同抗体形成异源二聚体，但其中仍有5％同源二聚体，且无法解决轻链错配的问题(us5731168a，us5731168a；ridgwayjb,etal.proteineng1996,9:617-621.；atwells,etal.jmolbiol1997,270:26-35.；merchantam,etal.natbiotechnol1998,16:677-681.)。
除了利用空间位阻形成的疏水作用克服同源二聚体的形成，另一种解决方案是利用离子键，在两条重链中人为引入电荷性质相反的氨基酸，这样通过同种电荷的排斥作用抑制同源二聚体的形成，相关方法在专利及文献中均有详细描述(us8592562b2，us20170058054a1，wo2014084607a1；gunasekarank,etal.jbiolchem2010,285:19637-19646；stropp,etal.jmolbiol2012,420:204-219；choihj,etal.molimmunol2015,65:377-383)。
在本发明人的在先专利申请(公开号：wo2017034770a1)中，公开了对抗体的重链部分进行改造以增加两条重链之间的结合活性和特异性的方法。具体而言，该方法通过改变ch3区域相互作用界面的氨基酸的电荷性质，减少同源二聚体、促进异源二聚体的形成，成功解决了双特异性抗体制备过程中重链错配的问题。
对于重链和轻链之间的错配问题，目前有如下几种解决方案：1)筛选和使用共同轻链；2)将轻链融合到重链；3)对轻链和重链进行改造使其能够特异性配对。
解决轻链错配，最直接的方法是使用共同轻链，即2条重链共用相同的轻链。一般情况下，抗体轻链的可变区域是不同的，多样的可变区域也决定了抗体对抗原识别的特异性。实际应用中，共同轻链的获取比较困难，需要花费大量人力和时间去筛选，同时也不能保证筛选到合适的共同轻链；此外，共同轻链的使用可能降低对抗原的特异性和亲和力，因此共同轻链并不适用于所有的双特异性抗体。
其他的解决方法是通过改造使轻链和重链融合，例如通过一段非天然的衔接序列连接重链可变区域和轻链可变区域产生单链可变片段(singlechainvariablefragment，scfv)，或将轻链连接到重链的可变区域形成单链fab抗体片段(singlechainfabantibodyfragment，scfab)，但这一引入的衔接序列会带来稳定性、溶解性等问题，容易形成抗体聚合物，可能引起免疫原性问题(gunasekarank,etal.jbiolchem2010,285:19637-19646.；mudam,etal.蛋白engdessel2011,24:447-454.；wranikbj,etal.jbiolchem2012,287:43331-43339.)。对于具有2条轻链的双特异性抗体，可以将两种抗体分开表达来避免轻链错配，如可控fab臂交换(controlledfab-armexchange，cfae)、化学交联等。cfae方法通过分别表达纯化两种特异性单抗，在体外采用氧化还原的的方法使两种特异性抗体装配在一起形成类似天然igg结构的双特异性抗体。其原理借鉴了人igg4分子在体内的fab臂交换的生理学过程，在这一过程种igg4ch3区域的第409位的精氨酸(r409)和铰链区第228位的丝氨酸(s228)发挥了关键作用。目前这种装配方法工艺复杂、需要进行二次纯化、产量低、会极大地增加生产成本(wo2008119353，wo2011131746a2；labrijnaf,etal.procnatlacadsciusa2013,110:5145-5150.；cookag,etal.jimmunolmethods1994,171:227-237.)。
lindhofer等人(lindhoferh,etal.jimmunol1995,155:219-225)描述了另一种解决方案，该方法利用大鼠重链与小鼠重链能够天然结合的特点，将生产大鼠来源单抗和小鼠来源单抗的两种杂交瘤细胞通过体细胞融合的技术形成能够生产双特异抗体的细胞。这种方法产生的抗体通过种属限制克服了轻链错配，错配率可降低至4-10％。最早上市的双特异性抗体catumaxomab(商品名：removabtm)便是通过该技术生产的，该抗体用于治疗恶性腹水肿。但由于抗体是鼠源的，会带来免疫原性的问题。
尽管已经存在上述解决双特异性抗体的重链和轻链之间错配问题的技术方案，仍然存在工艺复杂、抗原性、目标抗体的产量低以及不适用于所有抗体等各种问题。因此，对于解决重链和轻链之间错配的新的且有效的方法仍然存在需要。
本发明深入分析了人源igg1ch1-cl和铰链区-cl相互作用的空间结构，发现在ch1-cl交界面引入非天然二硫键，且任选的去除铰链区-cl区域的天然二硫键(hc-c220s，lc-c214s)，能够在引入极少的位点突变且不影响抗体结构和功能的基础上，利用人工改造的二硫键形成配对的重链-轻链fab或全抗体。
具体而言，本发明鉴定了抗体重链ch1和轻链cl之间的4个氨基酸对(见以下表1)，其适合用于突变为半胱氨酸以在重链ch1和轻链cl之间形成非天然二硫键。
表1.可以形成重链ch1-轻链cl之间二硫健的氨基酸对
此外，本发明人对上述位点在不同的抗体同种型之间的保守性进行了分析。如表2所示，上述4个氨基酸对在igg1、igg2、igg3和igg4同种型中保守。
表2.氨基酸对在igg1、igg2、igg3和igg4中的保守性
本发明还提供了一种电荷改造方法，即对抗体的铰链区引入k218e或k218d突变，并对cl引入e213r或e213k突变，其增加重链与轻链之间的结合特异性。这对电荷改造可以单独使用或与本发明的二硫键改造方法组合用于抗体例如双特异性抗体或多特异性抗体的构建设计中，促进抗体的重链-轻链正确配对。
因此，在一方面，本发明涉及对抗体的fab区进行改造的方法，所述方法包括将选自以下的一项或多项突变引入所述fab区的步骤：
a)重链恒定区1(ch1)中的f170c和轻链恒定区(cl)中的s162c；
b)ch1中的l128c和cl中的f118c；
c)ch1中的f126c和cl中的q124c；
d)ch1中的v173c和cl中的q160c；
e)铰链区中的k218e或k218d突变和cl中的e213r或e213k突变，
其中根据eu编号对所述抗体重链和轻链进行编号。
可以对抗体的fab区引入上述突变组合a)-e)中的一项或多项，例如1项、2项、3项、4项或5项。在优选的实施方案中，对抗体的fab区引入上述突变组合a)-d)中的1项或2项，以在抗体的重链和轻链，或重链和轻链的片段之间形成1对或2对非天然二硫键，且任选的引入突变组合e)以进一步增加抗体重链和轻链之间的结合特异性。
在一些实施方案中，本发明的改造方法还包括破坏破坏ch1-cl之间的天然二硫键，即破坏由铰链区中的第220位的半胱氨酸(c220)和cl中的第214位的半胱氨酸(c214)之间形成的二硫键。其可以通过以下方法实现:突变轻链cl区域214位点的半胱氨酸为任何非半胱氨酸，优选的是丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸，或者删除214位点的半胱氨酸；或突变重链铰链区220位的半胱氨酸为任何非半胱氨酸；或突变轻链cl区域214位的半胱氨酸为任何非半胱氨酸，同时突变重链铰链区220位的半胱氨酸为任何非半胱氨酸；或删除轻链cl区域214位的半胱氨酸，同时突变重链铰链区220位的半胱氨酸为任何非半胱氨酸。
在上述方法的任意实施方案中，所述fab区来源于igg、iga、igm、ige或igd，例如igg1、igg2、igg3或igg4同种型。如表2所示，本发明鉴定的氨基酸对在igg1、igg2、igg3和igg4同种型中保守。因此本发明的方法可以用于上述抗体同种型。
应当理解，本发明的对fab区进行改造的方法可以应用于任何具有至少一个fab区的抗体或抗体片段，包括例如单克隆抗体、双特异性抗体或多特异性抗体；鼠源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体以及其它来源的抗体；以及任何具有fab区的抗体片段，例如fab片段，fab'片段和f(ab')2片段。
在另一方面，本发明涉及对双特异性抗体进行改造的方法，其中所述双特异性抗体具有结合cd3的第一重链和第一轻链，和结合her2的第二重链和第二轻链，所述第二重链具有seqidno:7的氨基酸序列，且所述第二轻链具有seqidno:5的氨基酸序列，所述方法包括对所述第二重链和第二轻链引入选自以下a)-d)的1项或2项突变：
a)重链恒定区1(ch1)中的f170c和轻链恒定区(cl)中的s162c；
b)ch1中的l128c和cl中的f118c；
c)ch1中的f126c和cl中的q124c；和
d)ch1中的v173c和cl中的q160c，
其中根据eu编号对所述抗体重链和轻链进行编号。
在上述改造方法的一些实施方案中，还包括将所述第二重链的铰链区中的c220突变为除半胱氨酸以外的其它氨基酸或缺失c220，和/或将所述第二轻链的cl中的c214突变为除半胱氨酸以外的其它氨基酸或缺失c214的步骤。
在上述改造方法的一些实施方案中，还包括向所述第一重链引入k218e或k218d突变，并向所述第一轻链引入e213r或e213k突变；或向所述都第二重链引入k218e或k218d突变，并向所述第二轻链引入e213r或e213k突变。
在上述改造方法的一些实施方案中，所述第一重链具有seqidno:3的氨基酸序列，所述第一轻链具有seqidno:1的氨基酸序列。
本发明还涉及通过上述改造方法获得的双特异性抗体。
抗体生产方法
一方面，本发明涉及生产具有至少两个不同的fab区的抗体或抗体片段的方法，所述方法包括以下步骤：
1)在所述抗体或抗体片段的第一fab区引入选自以下的一项或多项突变：
a)ch1中的f170c和cl中的s162c；
b)ch1中的l128c和cl中的f118c；
c)ch1中的f126c和cl中的q124c；
d)ch1中的v173c和cl中的q160c；和
e)铰链区中的k218e或k218d突变和cl中的e213r或e213k突变，其中根据eu编号进行编号，
2)在表达所述抗体或抗体片段的条件下，培养含有编码所述抗体或抗体片段的核酸的宿主细胞，和
3)从所述宿主细胞培养物回收所述抗体或抗体片段。
在一些实施方案中，上述方法还包括在在所述抗体或抗体片段的第二fab区引入选自以下的一项或多项突变：
a)ch1中的f170c和cl中的s162c；
b)ch1中的l128c和cl中的f118c；
c)ch1中的f126c和cl中的q124c；
d)ch1中的v173c和cl中的q160c；和
e)铰链区中的k218e或k218d突变和cl中的e213r或e213k突变，其中引入所述第一fab区的突变和引入所述第二fab区的突变不完全相同。
在上述方法的一些实施方案中，在所述第一fab区中引入突变a)-e)中的1项、2项、3项、4项或5项，在所述第二fab区中引入突变a)-e)中的1项、2项、3项、4项或5项，且其中引入所述第一fab区的突变和引入所述第二fab区的突变不完全相同。在优选的实施方案中，在所述第一fab区和/或第二fab区中引入突变a)-d)中的1项或2项，和任选的突变e)。
在一些实施方案中，上述方法还包括破坏所述第一fab区和/或第二fab区中铰链区-cl区之间的天然二硫键，即将所述第一fab区和/或第二fab区的铰链区中的c220突变为除半胱氨酸以外的其它氨基酸或缺失c220，和/或将所述第一fab区和/或第二fab区和/或第二fab区的cl中的c214突变为除半胱氨酸以外的其它氨基酸或缺失c214。在优选的实施方案中，所述除半胱氨酸以外的氨基酸选自丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸。
在上述方法的一些实施方案中，所述第一fab区和第二fab区结合相同的抗原上的不同表位。
在上述方法的一些实施方案中，所述第一fab区结合第一抗原，所述第二fab区结合第二抗原，且所述第一抗原和第二抗原不同。
应当理解，本文描述的用于生产抗体或抗体片段的方法可以用于任何具有至少两个不同的fab区的抗体或抗体片段，包括双特异性抗体和多特异性抗体。此外，可以根据需要选择不同的fab区以构建双特异性抗体或多特异性抗体。
在一些实施方案中，上述生产方法用于生产抗体片段，所述抗体片段选自fab片段、fab'片段和f(ab')2片段。
在一些实施方案中，上述生产方法用于生产双特异性抗体，所述双特异性抗体具有第一重链和第一轻链，以及第二重链和第二轻链，其中所述第一重链和第一轻链形成所述第一fab区，所述第二重链和第二轻链形成所述第二fab区。
在一些实施方案中，上述方法还包括对所述第一重链引入p395k、p396k和v397k，且对所述第二重链引入t394d、p395d和p396d，或对所述第一重链引入t394d、p395d和p396d，且对所述第二重链引入p395k、p396k和v397k。上述突变能够增加第一重链和第二重链之间的结合特异性，以避免形成重链同源二聚体。
在上述方法的一些实施方案中，所述抗体或抗体片段来源于igg、iga、igm、ige或igd，例如igg1、igg2、igg3或igg4同种型。
本发明还涉及通过上述方法产生的抗体或抗体片段。
改造的抗体
另一方面，本发明涉及具有至少两个不同的fab区的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段的第一fab区具有选自以下的一项或多项突变：
a)ch1中的f170c和cl中的s162c；
b)ch1中的l128c和cl中的f118c；
c)ch1中的f126c和cl中的q124c；
d)ch1中的v173c和cl中的q160c；和
e)铰链区中的k218e或k218d突变和cl中的e213r或e213k突变，其中根据eu编号进行编号。
在上述抗体或抗体片段的一些实施方案中，所述抗体或抗体片段的第二fab区具有选自以下的一项或多项突变：
a)ch1中的f170c和cl中的s162c；
b)ch1中的l128c和cl中的f118c；
c)ch1中的f126c和cl中的q124c；
d)ch1中的v173c和cl中的q160c；和
e)铰链区中的k218e或k218d突变和cl中的e213r或e213k突变，其中所述第二fab区的突变和所述第一fab区的突变不完全相同。
在上述抗体或抗体片段的一些实施方案中，所述第一fab区具有突变a)-e)中的1项、2项、3项、4项或5项，所述第二fab区具有突变a)-e)中的1项、2项、3项、4项或5项，且其中所述第一fab区的突变和所述第二fab区的突变不完全相同。在优选的实施方案中，所述第一fab区和/或第二fab区具有突变a)-d)中的一项或两项，和任选的突变e)。
在上述抗体或抗体片段的一些实施方案中，所述第一fab区和/或第二fab区还具有铰链区中的c220突变为除半胱氨酸以外的其它氨基酸或缺失c220，和/或cl中的c214突变为除半胱氨酸以外的其它氨基酸或缺失c214。其中，所述除半胱氨酸以外的其它氨基酸优选选自丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸。
在上述抗体和抗体片段的一些实施方案中，所述第一fab区和第二fab区结合相同抗原上的不同表位。
在上述抗体和抗体片段的一些实施方案中，所述第一fab区结合第一抗原，所述第二fab区结合所述第二抗原，且其中所述第一抗原和第二抗原不同。
在一些实施方案中，所述抗体片段选自fab片段、fab'片段和f(ab')2片段。
在一些实施方案中，所述抗体是具有第一重链和第一轻链，以及第二重链和第二轻链的双特异性抗体，其中所述第一重链和第一轻链形成所述第一fab区，所述第二重链和第二轻链形成所述第二fab区。在进一步的实施方案中，第一重链具有p395k、p396k和v397k突变，且所述第二重链具有t394d、p395d和p396d突变，或所述第一重链具有t394d、p395d和p396d和突变，且所述第二重链具有p395k、p396k和v397k突变。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段来源于igg、iga、igm、ige或igd，例如igg1、igg2、igg3或igg4。
在任意实施方案中，本发明改造的fab区、抗体或抗体片段结合癌症抗原，对于癌症发展或侵袭性相关的非癌症蛋白，或者病毒相关蛋白。实际上，本发明改造的fab区、抗体或抗体片段可以结合任何抗原，包括但不限于以下蛋白，亚基，结构域，基序和表位：cd2；cd3，cd3e，cd4，cd11，cd11a，cd14，cd16，cd18，cd19，cd20，cd22，cd23，cd25，cd28，cd29，cd30，cd32，cd33(p67蛋白)，cd38，cd40，cd40l，cd52，cd54，cd56，cd80，cd147，gd3，il-1，il-1r，il-2，il-2r，il-4，il-5，il-6，il-6r，il-8，il-12，il-15，il-18，il-23，干扰素α，干扰素β，干扰素γ；tnf-α，tnfβ，tnf-r1，tnf-rii，fasl，cd27l，cd30l，4-1bbl，trail，rankl，tweak，april，baff，light，veg1，ox40l，trail受体-1，腺苷受体，淋巴毒素β受体，taci，baff-r，epo；lfa-3，icam-1，icam-3，epcam，整联蛋白β1，整联蛋白β2，整联蛋白α4/β7，整联蛋白α2，整联蛋白α3，整联蛋白α4，整联蛋白α5，整联蛋白α6，整联蛋白αv，整联蛋白αvβ3，fgfr-3，角质形成细胞生长因子，vla-1，vla-4，l-选择素，抗id，e-选择素，hla，hla-dr，ctla-4，t细胞受体，b7-1，b7-2，vnr整联蛋白，tgfβ1，tgfβ2，嗜酸性粒细胞趋化因子1(eotaxin1)，blys(b淋巴细胞刺激因子)，补体c5，ige，因子vii，cd64，cbl，nca90，egfr(erbb-1)，her2/neu(erbb-2)，her3(erbb-3)，her4(erbb4)，组织因子，vegf，vegfr，内皮素受体，vla-4，半抗原np-cap或nip-cap，t细胞受体α/β，e-选择素，地高辛，胎盘碱性磷酸酶(plap)和睾丸plap样碱性磷酸酶，转铁蛋白受体，癌胚抗原(cea)，ceacam5，hmfg1,pem，粘蛋白muc1，muc18，肝素酶i，人心脏肌球蛋白，肿瘤相关糖蛋白-72(tag-72)，肿瘤相关抗原ca125，前列腺特异性膜抗原(psma)，高分子量黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)，癌(carcinoma)相关抗原，gco蛋白iib/iiia(gpiib/iiia)，表达lewisy相关碳水化合物的肿瘤相关抗原，人巨细胞病毒(hcmv)gh包膜糖蛋白，hivgp120，hcmv，呼吸合胞病毒rsvf，rsvffgp，vnr整联蛋白，细胞角蛋白肿瘤相关抗原，hepbgp120，cmv，gpiibiiia，hiviiibgp120v3环，呼吸道合胞病毒(rsv)fgp，单纯疱疹病毒(hsv)gd糖蛋白，hsvgb糖蛋白，hcmvgb包膜糖蛋白和产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)毒素。
在一些实施方案中，本发明改造的fab区、抗体或抗体片段结合选自下组的抗原：psma，cd133，cd138，cd20，cd19，ox40，gitr，pd-1，pd-l1或pd-l2，ctla-4，kir，lag-3，cd3，tcrα，tcrβ，tcrγ，tcrδ，cd40，cd40l，vegf，egf，vegfr，egfr，her1，her2，her3，epcam，间皮素，glypicans，cd28，erbl，erb2，b7-h3，icos，bmp1，bmp2，bmp3b，bmp4，csf1，gm-csf，fgf1，fgf2，fgf3，fgf4，pdgfr，tigit，cs1，tweak，ccl1，ccl2，ccl3，ccl13，cxcl1，cxcl2，cxcl3，ip-10，岩藻糖基-gm1，igf1，igf2，igf1r，igf2r，cd64，cd32a，cd32b，cd16，整联蛋白，rank配体，cea，dll-4，gm-csfr，adams，肌生成抑制素，pcsk9，cxcr4，il-1α，il-1β，il-12，il-18，tnfα，il-23，il-13，mif，il-17，il-17r，il-15，il-9，il-5，il-5r，il-6，il-25，peg2等。本发明的抗体可以对于病毒相关靶标是特异性的，例如hiv蛋白，hpv蛋白，cmv蛋白，流感病毒蛋白或朊病毒蛋白。
在某些方面，本发明改造的fab区、抗体或抗体片段可用于诊断和治疗应用。更具体地，本发明的方法可以用于生成可以结合两种或多于两种靶抗原的双特异性或多特异性抗体，所述靶抗原可以选自，但不限于以下靶标：il-1α，il-1β，il-12，il-18，tnfα，il-23，il-13，mif，il-17，il-17r，il-15；vegf，vegfr，egfr；il-9，il-5，il-5r，il-6，il-25，il-13，adams，peg2，her1，her2和her3。此外，本领域技术人员将能够鉴定其它可能的靶标。
本发明的方法可以用于改造双特异性抗体，其可以用于但不限于激活t细胞杀死携带肿瘤抗原的靶细胞，其中一个抗原结合区域由单克隆抗体的fab区域组成，其c端与其中一条重链的铰链区的n端相连，可结合肿瘤细胞抗原靶点或者免疫效应细胞上的信号通路靶点；另一个抗原结合区域由单克隆抗体的fab区域组成，其c端与第二条重链的铰链区的n端相连；同样地，它也可以特异性结合肿瘤细胞的抗原靶点或者免疫效应细胞上的信号通路靶点；同样，本发明按照上述技术方案突变产生的双特异性抗体也可以用于阻断，拮抗或激活靶抗原，例如拮抗细胞因子或细胞因子受体。
在一方面，本发明涉及抗体或抗体片段，其具有选自下组的cl区：seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25和seqidno:27。
在一方面，本发明涉及抗体或抗体片段，其具有选自下组的ch1区或铰链区：seqidno:29、seqidno:31、seqidno:33、seqidno:35、seqidno:37、seqidno:39、seqidno:41和seqidno:43。
在一方面，本发明涉及抗体或抗体片段，其具有选自下组的cl区和ch1区：
a)seqidno:11的cl区和seqidno:33的ch1区；
b)seqidno:13的cl区和seqidno:29的ch1区；
c)seqidno:15的cl区和seqidno:35的ch1区；
d)seqidno:17的cl区和seqidno:33的ch1区；和
e)seqidno:27的cl区和seqidno:43的ch1区。
核酸序列和宿主细胞
本发明还涉及编码本发明的抗体的核苷酸序列，以及包含这些核苷酸序列的载体。在表达抗体的过程中，将所述核苷酸序列插入合适的载体中，载体包括但不限于：质粒、噬菌表达载体、柯斯质粒、人工染色体、噬菌体以及动物病毒。表达载体中包含用于调控表达的元件，包括但不限于启动子、转录起始序列、增强子、信号肽序等。启动子包括但不限于t7启动子、t3启动子、sp6启动子、β-actin启动子、ef-1α启动子、cmv启动子以及sv40启动子。将表达载体转入宿主细胞中可使用本领域内已知的合适方法，包括但不限于：磷酸钙沉淀法、聚乙烯亚胺转染法、脂质体转染法、电穿孔法、pei(聚乙烯亚胺)转染法。
在一个方面，本发明包括核酸分子，其包含选自下组的核苷酸序列：seqidno:12、seqidno:14、seqidno:16、seqidno:18、seqidno:20、seqidno:22、seqidno:24、seqidno:26、seqidno:28、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:34、seqidno:36、seqidno:38、seqidno:40、seqidno:42和seqidno:44。
在另一个方面，本发明包括载体，其包含本发明的核酸分子。
在再一个方面，本发明包括宿主细胞，其包含本发明的核酸分子或载体。所述的宿主细胞包括但不限于cho细胞(chinesehamsterovarycells，中国仓鼠卵巢细胞)、hek293细胞(humanembryonickidneycells293，人胚肾细胞293)、骨髓瘤细胞、酵母或原核细胞如大肠杆菌(escherichiacoli)。
抗体偶联物
在另一方面，本发明涉及抗体偶联物，其包含本发明的抗体或抗体片段，或双特异性抗体，以及与所述抗体或抗体片段，或双特异性抗体偶联的部分，其中所述部分选自细胞毒素、放射性同位素、荧光标记物、发光物、显色物质或酶。
在一些实施方案中，与本发明的抗体或抗体片段，或双特异性抗体偶联以形成抗体偶联物的部分是细胞毒素。在一些实施方案中，所述细胞毒素选自：秋水仙素，emtansine,maytansinoid,auristatin,vindesine,tubulysin等。
在一些实施方案中，与本发明的抗体或抗体片段，或双特异性抗体偶联以形成抗体偶联物的部分是放射性同位素。在一些实施方案中，所述放射性同位素选自：at211,i131,i125,y90,re186,re188,sm153,bi212,p32的放射性同位素等。
在一些实施方案中，与本发明的抗体或抗体片段，或双特异性抗体偶联以形成抗体偶联物的部分选自荧光标记物、发光物和显色物质，例如：fitc,luciferase,hrp等。
在一些实施方案中，与本发明的抗体或抗体片段，或双特异性抗体偶联以形成抗体偶联物的部分是酶，例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其活性片段和/或变体。
药物组合物和疾病治疗方法
在再一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体，或抗体偶联物，和任选地一种或多种药学上可接受的载体，表面活性剂和/或稀释剂。
在一个方面，本发明涉及本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体，或抗体偶联物在制备用于治疗疾病的药物组合物中的用途。在一些实施方案中，所述疾病是癌症。
在另一个方面，本发明涉及治疗疾病的方法，其包括使用本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体、抗体偶联物或药物组合物的步骤。
在一些实施方案中，所述疾病是癌症。
在一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体或抗体偶联物，和任选地药学上可接受的载体，表面活性剂和/或稀释剂。
短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、介质、包封材料、制造助剂(例如润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或锌或硬脂酸)或溶剂包封材料，其涉及维持lap结合剂的稳定性、溶解度或活性。在与配制剂的其它成分相容并且不对患者有害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(8)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(9)二醇，如丙二醇；(10)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇(peg)；(11)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(12)琼脂；(13)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(14)海藻酸；(15)无热原水；(16)等张盐水；(17)林格氏溶液；(19)ph缓冲溶液；(20)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(21)填充剂，如多肽和氨基酸(22)血清组分，如血清白蛋白、hdl和ldl；(23)c2-c12醇，如乙醇；和(24)药物配制剂中使用的其它无毒相容物质。释放剂、包衣剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于药物配制剂中。诸如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等的术语在本文中可互换使用。
在一些实施方案中，除本发明的抗体、双特异性抗体或抗体偶联物外，所述药物组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂包括但不限于化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、用于放射疗法的试剂、抗血管生成剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它治疗癌症的试剂，如抗cd20抗体、表皮生长因子受体(egfr)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、her1/egfr抑制剂(例如厄洛替尼
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是化疗剂。化疗剂的非限制性实例可以包括烷化剂类(alkylatingagents)，诸如塞替派(thiotepa)和
本文所述的药物组合物可以特别配制用于以固体、液体或凝胶形式向受试者施用化合物，包括适用于以下的那些：(1)肠胃外施用，例如通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射，作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放配制剂；(2)表面应用，例如作为施用于皮肤的霜剂、软膏剂或受控释放贴片或喷雾剂；(3)阴道内或直肠内，例如作为子宫托、乳膏或泡沫；(4)眼；(5)经皮；(6)经粘膜；或(7)鼻。
在一个方面，本发明涉及本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体或抗体偶联物在制备用于治疗疾病的药物组合物中的用途。在一些实施方案中，所述疾病是癌症。
在另一个方面，本发明涉及本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体、抗体偶联物或药物组合物，其用于治疗疾病。在一些实施方案中，所述疾病是癌症。
在再一个方面，本发明涉及治疗疾病的方法，其包括向受试者施用本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体、抗体偶联物或药物组合物的步骤。在一些实施方案中，所述疾病是癌症。
癌症的实例包括但不限于基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和cns癌；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；胆管癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝癌；上皮内新生物；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(例如唇、舌、口、和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；畸胎癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；以及其它癌和肉瘤；和移植后淋巴增生性疾病(ptld)，以及与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生，水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)、原始起源肿瘤和梅格斯(meigs)氏综合征。
可以将本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体、抗体偶联物或药物组合物施用于有需要的受试者或患者。术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指动物，例如人类。术语“非人动物”和“非人哺乳动物”在本文中可互换使用，并且包括哺乳动物如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猫、狗、牛、猪和非人灵长类动物。术语“受试者”还包括任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼。然而，有利地，受试者是哺乳动物如人或其它哺乳动物，例如驯养的哺乳动物，例如狗、猫、马等。生产哺乳动物，如牛、绵羊、猪等也包括在术语受试者中。
具体实施方法
以下将结合实施例进一步说明本发明的内容。应当理解以下实施例仅是说明性的，而不应被认为是对本发明范围的限制。
实施例1：双特异性抗体的设计和表达载体构建
(1)双特异性抗体的设计
本实施中的设计和构建的示例性双特异性抗体为“y”字型抗体(见图1a)，其包括2条完整的重链和2条完整的轻链，共同形成抗体的fab和fc结构域。fab两臂分别特异性结合人cd3和人her2。其中特异性结合人cd3的部分在本文中命名为c31，其包含一条抗体重链和一条抗体轻链，其序列来源于抗体重链和轻链来源于鼠源单克隆抗体(参见专利号us9587021)。特异性结合人her2的部分包含一条抗体重链和一条抗体轻链，其序列来源于人源化单克隆抗体herceptin的序列(参见专利号us5821337)。抗体的fc部分按照发明人先前的专利申请公开wo2017034770a1中的方法进行的改造，其中对结合人cd3部分的重链做如下突变：p395k、p396k、v397k，该突变标记为oa；对结合人her2部分的重链做如下突变：t394d、p395d、p396d，该突变标记为ob，使其形成重链异源二聚体。该双特异性抗体在本文中称为双特异性抗体wt。
抗cd3(c31)轻链氨基酸序列(seqidno：1)
qtvvtqepsltvspggtvtltcgsstgavttsnyanwvqekpgqaprgliggtnkrapwtparfsgsllggkaaltitgaqaedeadyycalwysnlwvfgggtkltvlgklvtmeikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvytcevthqglsspvtksfnrgec抗cd3(c31)重链氨基酸序列(seqidno：3)
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfntyamnwvrqapgkglewvarirskynnyatyyadsvkdrftisrddsknslylqmnslktedtavyycarhgnfgnsyvswfaywgqgtlvtvssissastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttkkkldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
抗her2(herceptin)轻链氨基酸序列(seqidno：5)
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvntavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsrsgtdftltisslqpedfatyycqqhyttpptfgqgtklvtmeikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvytcevthqglsspvtksfnrgec
抗her2(herceptin)重链氨基酸序列(seqidno：7)
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdtyihwvrqapgkglewvariyptngytryadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycsrwggdgfyamdywgqgtlvtvssissastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
(2)表达质粒的分子克隆
人工合成编码c31轻链的核苷酸序列(seqidno：2)和编码c31重链的核苷酸序列(seqidno：4)。利用通用的分子克隆的方法(sambrookjf,e.f.etal.molecularcloning:alaboratorymanual.4thed.coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork:2012)，将编码c31轻链的核苷酸序列克隆到改造过的质粒pcdna3.1(+)(invitrogen，货号v790-20)上，该质粒经过改造在多克隆位点n端加入了一段人白介素-2(interleukin-2，il-2)的信号肽序列(seqidno：9和seqidno：10)，使其能够在细胞(例如hek293细胞)中表达分泌抗体，所得的表达质粒命名为pcdna3.1-c31-lc。将编码c31重链的核苷酸序列克隆到质粒pfuse-higg1-fc2(invivogene)上，所得的表达质粒命名为pfuse-c31-hc-oa。
人工合成编码抗her2(herceptin)轻链的核苷酸序列(seqidno：6)和编码抗her2(herceptin)重链的核苷酸序列(seqidno：8)。利用通用的分子克隆的方法，将编码抗her2轻链的核苷酸序列克隆到上述改造过的质粒pcdna3.1(+)上，使其能够在细胞(例如hek293细胞)中表达分泌抗体，所得的表达质粒命名为pcdna3.1-her2-lc；将编码抗her2重链的核苷酸序列克隆到质粒pfuse-higg1-fc2(invivogene)上，所得的表达质粒命名为pfuse-her2-hc-ob。
为了使上述双特异性抗体的四条链在sds-page凝胶上形成可区分的4条带，在抗her2重链c端加上6his标签，构建的表达质粒，命名为pfuse-her2-hc-ob-6his。
(3)对双特异性抗体的改造
按照本发明人已经公开的专利申请wo2017034770a1中的方法对抗体序列进行氨基酸点突变。将表2中的b、c、d或e所示的氨基酸对的2个非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸残基，使重链ch1和轻链cl间在突变位点之间形成二硫键。同时，破坏原有的重链铰链区和轻链cl链间的天然二硫键，其可以通过以下方法实现:将轻链cl区域第214位的半胱氨酸突变为任何非半胱氨酸或者删除第214位的半胱氨酸，和/或将重链铰链区第220位的半胱氨酸突变为任何非半胱氨酸或者删除第220位的半胱氨酸。在将半胱氨酸突变为非半胱氨酸的情况下，优选将其突变为丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸。通过上述突变方法，本发明产生了4种示例性抗her2×抗cd3双特异性抗体，分别命名为mute、mutb、mutc和mutd(参见表3)。其中，mute在双特异性抗体wt的基础上，在抗her2重链序列中引入c220s和v173c突变，并在抗her2轻链序列中引入c214s和q160c突变；mutb在抗her2重链序列中引入c220s和f170c突变，并在抗her2轻链序列中引入c214s和s162c突变；mutc在抗her2重链序列中引入了c220s和l128c突变，并在抗her2轻链序列中引入了c214s和f118c突变；mutd为在抗her2重链序列中引入c220s和f126c突变，并在抗her2轻链序列中引入c214s和q124c突变。
表3抗her2×抗cd3双特异性抗体突变组合i
为进一步增加轻链对重链的选择性，在双特异性抗体的一条轻链上引入e213r突变，并在相应重链上引入k218e突变，得到表4中所示的抗her2×抗cd3双特异性抗体突变组合mutc+er和mutc-er。其中，mutc+er为在mutc的基础上，在抗cd3(c31)重链序列中引入k218e突变，并在抗cd3轻链中引入e213r突变；mutc-er为在mutc的基础上，在抗her2重链中引入k218e突变，并在抗her2轻链中引入e213r突变。此外，还构建了mutc-dec构建体，其中将抗her轻链的第214位的半胱氨酸删除(del-c214)。
表4抗her2×抗cd3双特异性抗体突变组合ii
为了在双特异性抗体中同时形成2个非天然二硫健，构建了表5中所示的抗her2×抗cd3双特异性抗体突变组合mutc-d+er和mutc-d-dec。其中，mutc-d+er在双特异性抗体wt的基础上，在抗her2重链序列中引入c220s、l128c和f126c突变，在抗her轻链序列中引入c214s、f118c和q124c突变，同时在抗cd3重链序列中引入k218e突变，并在抗cd3轻链序列中引入e213r突变。mutc-d-dec为在抗her2重链序列中引入了c220s、l128c和f126c突变，并在抗her2轻链序列中删除了第214位的半胱氨酸，并引入了f118c和q124c突变。
表5抗her2×抗cd3双特异性抗体突变组合iii
实施例2：双特异性抗体表达与纯化
(1)抗her2×抗cd3双特异性抗体的瞬时表达
采用无内毒素质粒大提试剂盒(endo-free-plasmidmaxikit(100)，购自omega公司，商品目录号为d6926-04)进行质粒大量提取，操作步骤按照试剂盒所提供的说明书进行。将hek293细胞培养至细胞密度为2.0～3.0×106个/ml，将细胞悬液离心5min，转速为1000rpm，丢弃旧的培养上清，用新鲜的培养基(opm-291cd03medium，购自上海奥浦迈生物科技有限公司，货号为81070-001)重悬细胞，使其密度为1.0×106/ml。使用实施例1中所构建的表达载体即双特异性抗体wt的表达载体和表4、5和6所列的突变组合mutb、mutc、mutd、mute、mutc-dec、mutc+er、mutc-er、mutc-d+er和mutc-d-dec分别对细胞进行共转染。将转染后的细胞悬浮液放置在37℃、5％co2、120rpm的培养摇床中避光培养4-5天。
(2)抗her2×抗cd3双特异性抗体的纯化
离心收集表达上清并用0.22μm滤膜过滤细胞上清。使用已经平衡好的蛋白a亲和层析填料(mabselectsuretm，购自gehealthcare公司，货号为17-5438-02)捕获上清液中的双特异性抗体蛋白，使用平衡缓冲液(137mmnacl，2.7mmkcl，10mmna2hpo4，1.8mmkh2po4)洗去非特异性结合的蛋白后(约10个柱体积)。随后，使用洗脱缓冲液(100mm甘氨酸，ph3.5)洗脱5个柱体积，收集洗脱液，并用中和缓冲液(1mtris-hcl，ph9.0)调节ph至中性。将洗脱后的样品通过sds-page进行分析。
对于双特异性抗体mutb、mutc、mutd和mute，经该步骤纯化后目的蛋白的纯度示于图2中。其中，对照wt(1:1:1:1)是指质粒pfuse-her2-hc-ob-6his,pfuse-c31-hc-oa,pcdna3.1-c31-lc,pcdna3.1-her2-lc以1:1:1:1的比例转化细胞获得的产物。如图2b中的还原性sds-page结果所示，发现wt(1:1:1:1)双特异性抗体中抗her2重链的含量偏低，因此设计了对照wt(2:1:1:1)，其中将编码抗her2重链的质粒pfuse-her2-hc-ob-6his与其它三种质粒的转染比例设置为2:1:1:1。然而，从图2b可见，对照wt(2:1:1:1)中her2重链的比例含量同样偏低。该结果说明对照双特异性抗体wt中her2重链的比例含量不是由于her2重链低表达引起的，而是由于未经改造的2条重链和2条轻链的链间不正确配对造成的。而经改造的双特异性抗体mutb、mutc、mutd和mute，两条重链的比例接近1：1，两条轻链的比例也接近1：1。
双特异性抗体mutc+er、mutc-er和mutc-dec经蛋白a亲和层析纯化后，目的蛋白的纯度如图3所示，两条重链的比例接近1：1，两条轻链的比例接近1：1。
使用aktapure25l1蛋白纯化系统对mutc洗脱液进行了进一步的纯化。其中，将洗脱样品上样至已经平衡好的阳离子交换柱(预装柱resourcetms，1ml，gehealthcare，货号ge17-1178-01)，使用平衡缓冲液a(50mm磷酸钠，ph6.0)洗去非特异性结合的蛋白至紫外吸收线平缓，随后用洗脱缓冲液b(50mm磷酸钠，1mnacl，ph6.0)从5％-45％线性洗脱30-50个柱体积，收集洗脱峰，图4a显示洗脱曲线。用sds-page分析蛋白大小及纯度，双特异性抗体mutc经该步骤纯化后，目的蛋白的纯度如图4b和4c所示。
在进一步的实验中，对双特异性抗体进行形成2对二硫键的改造(见表6)。双特异性抗体mutc-d+er，mutc-d-dec在表达并通过蛋白a纯化后，通过sds-page分析目的蛋白的纯度。结果见图5a和5b，其中图5a显示了非还原性sds-page的结果，图5b显示了还原性sdspage的结果。
实施例3：抗体的抗原结合检测
为了验证通过本发明披露的二硫键及电荷改造形成的双特异性抗体抗原结合能力，通过elisa分别检测纯化的双特异性抗体对抗原cd3和抗原her2的结合检测。具体步骤如下。
1)实验使用的抗原为人her2抗原(购自acrobiosystems公司)和人cd3抗原(购自sinobiologicalinc.公司)
2)包被：用1×pbs将抗原稀释至100ng/ml。将稀释好的抗原加入酶标板中，每孔加200μl，用封板膜封住反应孔，室温包被1.5小时或者4℃包被16小时。使用0.05％pbst洗板5次。
3)封闭：用脱脂奶粉和pbsbuffer配制3％m-pbs。向酶标板每孔加300μl3％m-pbs，用封板膜封住反应孔，室温孵育1小时。使用0.05％pbst洗板5次。
4)抗体结合：以100μl/孔加入按照一定梯度浓度稀释的抗体，每个抗体浓度以3个复孔进行实验。添加抗体后，用封板膜封住反应孔，室温孵育1.5小时。使用0.05％pbst洗板5次。
5)二抗：用3％m-pbs溶液按照1:2000稀释二抗即hrp标记的山羊抗人igg(购自peprotech公司，商品目录号为sa0001-17)，将稀释后的二抗以50μl/孔添加到孔。用封板膜封住反应孔，室温孵育1小时。使用0.05％pbst洗板5次。
6)显色：加入tmb显色液100μl/孔，室温避光孵育10～20min。
7)终止：加入终止液(2mhcl)100μl/孔，混匀后立即测量450nm处的od值。
8)数据分析：使用graphpadprism5软件进行数据处理。生成以log(样品浓度)为横坐标、od值为纵坐标的曲线，并得到kd、r2等数据。
如图6所示，纯化的抗her2×抗cd3双特异性抗体mutc、mutc+er、mutc-er、mutc-d+er、mutc-d-dec和mutc-dec显示出具有对her2抗原的强结合活性。经过计算，抗her2×抗cd3双特异性抗体对her2抗原结合的kd值为0.8nm。此外，如图7显示，抗her2×抗cd3双特异性抗体mutc、mutc+er、mutc-er、mutc-d+er、mutc-d-dec和mutc-dec保持了对cd3抗原结合能力。上述结果表明，经本发明的方法改造的双特异性抗体保持了对抗原结合的能力。
实施例4：双抗原同时结合检测
在抗体生产过程中，如果双特异抗体的重链和轻链发生错配现象，则双特异抗体失去对2种不同抗原的结合能力和生物学功能。为了进一步验证本发明的改造方法解决了上述问题，使用了双特异性双抗原elisa方法验证经本发明的改造方法组装的双特异性抗体能够同时结合2种抗原，并与由未经改造的两条天然重链和两条天然轻链组装成的双特异性抗体(wt)进行比较。理论上，这种未经改造的两条天然重链和两条天然轻链组装形成的双特异性抗体只有约25％其两条重链与两条轻链正确配对，因此能够同时结合2种抗原的抗体比例为25％。
本实验采用双特异性双抗原elisa方法，将相应的第一抗原吸附于固相载体表面，加入待测试的双特异性抗体，使其与固相载体表面的抗原反应。随后，洗涤固相载体上形成的抗原-抗体复合物，再加入酶标记的第二抗原，形成第一抗原-抗体-第二抗原复合物。然后，加入该酶的反应底物，其被酶催化成有色产物。该产物的量与能够特异性结合两种抗原的双特异性抗体的量成正比。
具体实验步骤为：将抗原cd3包被于酶标板(nunc)，4℃包被过夜，洗板后加入脱脂牛奶封闭，洗板后再加入双特异性抗体以及相应对照抗体(wt和higg)，室温孵育1.5小时，洗板，加入hrp标记的人her2抗原(hrp-her2)，室温孵育2小时，洗板，加入发光底物，使用酶标仪(synergyhtx，bioteck)检测发光值。结果参见图8。其中，图8a显示了双特异性抗体mutb、mutc和mutd相比于对照的结果，图8b显示了mute的结果。上述双特异性双抗原elisa结合测定显示，相比于未改造的wt，双特异性抗体mutb、mutc、mutd、mute同时结合her2抗原和cd3抗原的量分别提高了大约2倍、4倍、3倍、2倍。上述结果证明了经本发明设计和改造的mutb、mutc、mutd、mute提高了双特异性抗体重链和轻链之间的正确配对。
实施例5：t细胞肿瘤杀伤检测(ctl)
为了进一步验证通过本发明二硫键及电荷改造形成的双特异性抗体在细胞水平的抗原结合能力及对肿瘤的杀伤活性，对纯化的双特异性抗体进行ctl杀伤性检测。具体步骤如下。
ctl杀伤性检测：skbr-3细胞是一种her2高表达的乳腺癌细胞系，并在本实验中作为靶细胞。使用胰酶消化细胞skbr-3细胞，制备单细胞悬液。用无酚红的5％fbs-1640培养基将细胞密度调整为0.20×106/ml，并以50μl/孔加入96孔板的孔，使得细胞终浓度为1.0×104个/孔。本实验加入20倍(e：t＝20:1)于靶细胞数的效应细胞pbmc，即1.50×105个/孔(1.50×106/ml，100μl/孔)。用无酚红的5％fbs-rpmi1640培养基将抗体稀释至4μg/ml，然后按1:4的比例进行倍比稀释，得到浓度分别为4000ng/ml、1000ng/ml、2500ng/ml、625ng/ml、156.25ng/ml、39.06ng/ml、9.77ng/ml、2.44ng/ml、0.61ng/ml、0.15ng/ml的抗体。按照实验设计向相应孔中以50μl/孔加入抗体。将细胞和抗体混匀后于37℃，5％co2培养箱培养，约20h后用乳酸脱氢酶细胞毒性试剂盒(购自beyotime公司)检测对细胞的杀伤，其反映双特异性抗体的杀伤活性。按照以下公式计算杀伤率：
杀伤率(％)＝(od样品-s自发)/(max-s自发)×100％
其中，s自发＝od自发释放孔(靶细胞+效应细胞)，max＝od最大释放孔(靶细胞)；
如图9a和9b所示，而没有改造的两条天然重链和两条天然轻链组装的双特异性抗体wt(1:1:1:1)和wt(2:1:1:1)因含有大比例的重链-轻链错配(理论上只有25％的双特异性抗体重链和轻链正确配对)，使得正确配对的具有正常生物学活性的双特异性抗体的比例在总蛋白中较低，其对her2高表达的肿瘤细胞skbr-3杀伤的ec50浓度分别为21.16ng/ml和41.65ng/ml。作为对比，纯化的抗her2×抗cd3双特异性抗体mutb、mutc、mutd和mute对her2高表达的肿瘤细胞skbr3杀伤效果显著,其ec50浓度分别为0.95ng/ml、1.28ng/ml、0.71ng/ml和0.13ng/ml。
此外，图10显示了纯化的双特异性抗体mutc、mutc+er、mutc-er、mutc-dec、mutc-d+er和mutc-d-dec对skbr3细胞的杀伤效果显著,其ec50浓度分别为0.045ng/ml，0.055ng/ml，0.034ng/ml，0.078ng/ml，0.071ng/ml，0.063ng/ml。
这些数据表明：通过本发明的二硫键和电荷改造方法组装的双特异性抗体在体外细胞毒性实验中，能够识别并结合免疫细胞表面的cd3抗原，同时识别并结合肿瘤细胞skbr3表面的her2抗原，并激活t细胞杀伤肿瘤细胞skbr3。通过本发明的方法改造的双特异性抗体在细胞水平保持了抗原结合活性，且相比于未经改造的抗体显示出增强的细胞毒性活性(ctl作用)。
序列表
<110>广州爱思迈生物医药科技有限公司
<120>抗体及抗体改造方法
<130>1
<160>44
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>225
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>peptide
<222>(1)..(225)
<223>抗cd3（c31）轻链氨基酸序列
<400>1
glnthrvalvalthrglngluproserleuthrvalserproglygly
151015
thrvalthrleuthrcysglyserserthrglyalavalthrthrser
202530
asntyralaasntrpvalglnglulysproglyglnalaproarggly
354045
leuileglyglythrasnlysargalaprotrpthrproalaargphe
505560
serglyserleuleuglyglylysalaalaleuthrilethrglyala
65707580
glnalagluaspglualaasptyrtyrcysalaleutrptyrserasn
859095
leutrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleuglylysleu
100105110
valthrmetgluilelysargthrvalalaalaproservalpheile
115120125
pheproproseraspgluglnleulysserglythralaservalval
130135140
cysleuleuasnasnphetyrproargglualalysvalglntrplys
145150155160
valaspasnalaleuglnserglyasnserglngluservalthrglu
165170175
glnaspserlysaspserthrtyrserleuserserthrleuthrleu
180185190
serlysalaasptyrglulyshislysvaltyrthrcysgluvalthr
195200205
hisglnglyleuserserprovalthrlysserpheasnargglyglu
210215220
cys
225
<210>2
<211>675
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
cagactgtggtgactcaggagccttccctgaccgtgtctccaggcggcaccgtgacactg60
acctgtggctctagcaccggcgccgtgaccacatccaactacgctaattgggtgcaggag120
aagccaggacaggctccaaggggactgatcggaggaacaaacaagagggctccctggacc180
cctgctaggttttccggatctctgctgggaggcaaggccgctctgacaatcaccggagct240
caggctgaggacgaggctgattactattgcgctctgtggtattcaaatctgtgggtcttc300
ggcgggggaacaaaactgactgtgctgggaaagcttgtcaccatggaaatcaaacgtacg360
gtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaact420
gcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaag480
gtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaag540
gacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacac600
aaagtctacacctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttc660
aacaggggagagtgt675
<210>3
<211>458
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>peptide
<222>(1)..(458)
<223>抗cd3（c31）重链氨基酸序列
<400>3
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly
151015
serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheasnthrtyr
202530
alametasntrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
alaargileargserlystyrasnasntyralathrtyrtyralaasp
505560
servallysaspargphethrileserargaspaspserlysasnser
65707580
leutyrleuglnmetasnserleulysthrgluaspthralavaltyr
859095
tyrcysalaarghisglyasnpheglyasnsertyrvalsertrpphe
100105110
alatyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserserileserser
115120125
alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys
130135140
serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr
145150155160
pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser
165170175
glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser
180185190
leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr
195200205
tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys
210215220
lysvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocys
225230235240
proalaprogluleuleuglyglyproservalpheleuphepropro
245250255
lysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcys
260265270
valvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrp
275280285
tyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglu
290295300
gluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleu
305310315320
hisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasn
325330335
lysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalalysgly
340345350
glnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglu
355360365
metthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyr
370375380
proseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasn
385390395400
asntyrlysthrthrlyslyslysleuaspseraspglyserphephe
405410415
leutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasn
420425430
valphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthr
435440445
glnlysserleuserleuserproglylys
450455
<210>4
<211>1374
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
gaggtgcagctggtggaaagcgggggtggactggtgcagcctggtggtagcctgcgactg60
tcttgtgccgcttctggtttcactttcaacacatacgccatgaattgggtgagacaggct120
ccaggcaagggactggagtgggtggctcggatcaggtctaagtacaacaattatgccaca180
tactatgctgacagcgtgaaggatagattcaccatctcccgcgacgatagcaagaactcc240
ctgtatctgcagatgaatagcctgaagacagaggacaccgccgtgtactattgcgctcgc300
cacggcaacttcggcaattcttacgtgagctggtttgcctattggggccagggcacactg360
gtgaccgtgagctccatctcgagtgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggca420
ccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactac480
ttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacacc540
ttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccc600
tccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacacc660
aaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgc720
ccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggac780
accctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaa840
gaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagaca900
aagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctg960
caccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctccca1020
gcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtac1080
accctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtc1140
aaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaac1200
aactacaagaccacgaagaagaagctggactccgacggctccttcttcctctacagcaag1260
ctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcat1320
gaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa1374
<210>5
<211>217
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>peptide
<222>(1)..(217)
<223>抗her2轻链氨基酸序列
<400>5
aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcysargalaserglnaspvalasnthrala
202530
valalatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile
354045
tyrseralaserpheleutyrserglyvalproserargphesergly
505560
serargserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro
65707580
gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnhistyrthrthrpropro
859095
thrpheglyglnglythrlysleuvalthrmetgluilelysargthr
100105110
valalaalaproservalpheilepheproproseraspgluglnleu
115120125
lysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrpro
130135140
argglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnsergly
145150155160
asnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyr
165170175
serleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshis
180185190
lysvaltyrthrcysgluvalthrhisglnglyleuserserproval
195200205
thrlysserpheasnargglyglucys
210215
<210>6
<211>651
<212>dna
<213>人工序列
<400>6
gacatccagatgacacagtcccctagcagcctgagcgctagcgtgggcgacagggtcaca60
atcacctgcagggccagccaggatgtgaacaccgccgtggcctggtaccaacagaagccc120
ggcaaggcccccaaactgctgatctacagcgccagcttcctgtactccggcgtgccctcc180
agattcagcggcagcaggagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagccc240
gaggacttcgccacctactattgccagcagcactacacaacccctcccaccttcggccag300
ggcaccaagcttgtcaccatggaaatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatc360
ttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaat420
aacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggt480
aactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagc540
accctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacacctgcgaagtcacc600
catcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt651
<210>7
<211>453
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>peptide
<222>(1)..(453)
<223>抗her2重链氨基酸序列
<400>7
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly
151015
serleuargleusercysalaalaserglypheasnilelysaspthr
202530
tyrilehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
alaargiletyrprothrasnglytyrthrargtyralaaspserval
505560
lysglyargphethrileseralaaspthrserlysasnthralatyr
65707580
leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys
859095
serargtrpglyglyaspglyphetyralametasptyrtrpglygln
100105110
glythrleuvalthrvalserserileserseralaserthrlysgly
115120125
proservalpheproleualaproserserlysserthrserglygly
130135140
thralaalaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluproval
145150155160
thrvalsertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrphe
165170175
proalavalleuglnserserglyleutyrserleuserservalval
180185190
thrvalproserserserleuglythrglnthrtyrilecysasnval
195200205
asnhislysproserasnthrlysvalasplyslysvalgluprolys
210215220
sercysasplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleu
225230235240
leuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthr
245250255
leumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval
260265270
serhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyval
275280285
gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnser
290295300
thrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleu
305310315320
asnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproala
325330335
proileglulysthrileserlysalalysglyglnproargglupro
340345350
glnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthrlysasngln
355360365
valserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspileala
370375380
valglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthr
385390395400
proprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleu
405410415
thrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysser
420425430
valmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuser
435440445
leuserproglylys
450
<210>8
<211>1359
<212>dna
<213>人工序列
<400>8
gaggttcagctggtggaatccggaggcggactggtgcagcctggaggaagcctgagactg60
agctgcgccgccagcggcttcaacatcaaggacacctatatccattgggtgaggcaggct120
cccggaaaaggcctggagtgggtggccaggatctaccctaccaacggctacaccaggtac180
gccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcgccgacaccagcaagaacaccgcctac240
ctgcagatgaacagcctcagagccgaggacaccgccgtgtattactgcagcagatggggc300
ggcgacggcttctacgctatggattactggggacagggcacactggtgaccgtgagctcc360
atctcgagtgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagc420
acctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtg480
acggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtccta540
cagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggc600
acccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaa660
gttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactc720
ctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcc780
cggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaag840
ttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggag900
cagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg960
aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaa1020
accatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcc1080
cgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatccc1140
agcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacg1200
cctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaag1260
agcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaac1320
cactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa1359
<210>9
<211>20
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>signal
<222>(1)..(20)
<223>humaninterleukin-2信号肽氨基酸序列
<400>9
mettyrargmetglnleuleusercysilealaleuserleualaleu
151015
valthrasnser
20
<210>10
<211>60
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<221>sig_peptide
<222>(1)..(60)
<223>humaninterleukin-2信号肽核酸序列
<400>10
atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacgaattcg60
<210>11
<211>107
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>mutagen
<222>(11)..(11)
<223>mutcf118c轻链cl序列
<400>11
argthrvalalaalaproservalpheilecysproproseraspglu
151015
glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe
202530
tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln
354045
serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser
505560
thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu
65707580
lyshislysvaltyrthrcysgluvalthrhisglnglyleuserser
859095
provalthrlysserpheasnargglyglucys
100105
<210>12
<211>321
<212>dna
<213>人工序列
<400>12
cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatctgcccgccatctgatgagcagttgaaatct60
ggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacag120
tggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggac180
agcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgag240
aaacacaaagtctacacctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaag300
agcttcaacaggggagagtgt321
<210>13
<211>107
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>mutagen
<222>(17)..(17)
<223>mutdq124c轻链cl序列
<400>13
argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu
151015
cysleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe
202530
tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln
354045
serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser
505560
thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu
65707580
lyshislysvaltyrthrcysgluvalthrhisglnglyleuserser
859095
provalthrlysserpheasnargglyglucys
100105
<210>14
<211>321
<212>dna
<213>人工序列
<400>14
cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagtgcttgaaatct60
ggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacag120
tggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggac180
agcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgag240
aaacacaaagtctacacctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaag300
agcttcaacaggggagagtgt321
<210>15
<211>107
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>mutagen
<222>(53)..(53)
<223>muteq160c轻链cl序列
<400>15
argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu
151015
glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe
202530
tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln
354045
serglyasnsercysgluservalthrgluglnaspserlysaspser
505560
thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu
65707580
lyshislysvaltyrthrcysgluvalthrhisglnglyleuserser
859095
provalthrlysserpheasnargglyglucys
100105
<210>16
<211>321
<212>dna
<213>人工序列
<400>16
cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatct60
ggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacag120
tggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcctgtgagagtgtcacagagcaggac180
agcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgag240
aaacacaaagtctacacctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaag300
agcttcaacaggggagagtgt321
<210>17
<211>107
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>mutagen
<222>(55)..(55)
<223>mutbs162c轻链cl序列
<400>17
argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu
151015
glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe
202530
tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln
354045
serglyasnserglnglucysvalthrgluglnaspserlysaspser
505560
thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu
65707580
lyshislysvaltyrthrcysgluvalthrhisglnglyleuserser
859095
provalthrlysserpheasnargglyglucys
100105
<210>18
<211>321
<212>dna
<213>人工序列
<400>18
cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatct60
ggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacag120
tggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagtgtgtcacagagcaggac180
agcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgag240
aaacacaaagtctacacctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaag300
agcttcaacaggggagagtgt321
<210>19
<211>107
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>mutagen
<222>(106)..(106)
<223>e213r轻链cl序列
<400>19
argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu
151015
glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe
202530
tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln
354045
serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser
505560
thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu
65707580
lyshislysvaltyrthrcysgluvalthrhisglnglyleuserser
859095
provalthrlysserpheasnargglyargcys
100105
<210>20
<211>321
<212>dna
<213>人工序列
<400>20
cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatct60
ggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacag120
tggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggac180
agcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgag240
aaacacaaagtctacacctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaag300
agcttcaacaggggaaggtgt321
<210>21
<211>107
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>mutagen
<222>(107)..(107)
<223>c214s轻链cl序列
<400>21
argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu
151015
glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe
202530
tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln
354045
serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser
505560
thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu
65707580
lyshislysvaltyrthrcysgluvalthrhisglnglyleuserser
859095
provalthrlysserpheasnargglygluser
100105
<210>22
<211>321
<212>dna
<213>人工序列
<400>22
cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatct60
ggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacag120
tggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggac180
agcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgag240
aaacacaaagtctacacctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaag300
agcttcaacaggggagagtct321
<210>23
<211>106
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>mutagen
<222>(1)..(106)
<223>c214位点半胱氨酸缺失突变轻链cl序列
<400>23
argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu
151015
glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe
202530
tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln
354045
serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser
505560
thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu
65707580
lyshislysvaltyrthrcysgluvalthrhisglnglyleuserser
859095
provalthrlysserpheasnargglyglu
100105
<210>24
<211>318
<212>dna
<213>人工序列
<400>24
cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatct60
ggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacag120
tggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggac180
agcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgag240
aaacacaaagtctacacctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaag300
agcttcaacaggggagag318
<210>25
<211>107
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>mutagen
<222>(106)..(107)
<223>e213r-c214s轻链cl序列
<400>25
argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu
151015
glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe
202530
tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln
354045
serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser
505560
thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu
65707580
lyshislysvaltyrthrcysgluvalthrhisglnglyleuserser
859095
provalthrlysserpheasnargglyargser
100105
<210>26
<211>321
<212>dna
<213>人工序列
<400>26
cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatct60
ggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacag120
tggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggac180
agcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgag240
aaacacaaagtctacacctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaag300
agcttcaacaggggaaggtct321
<210>27
<211>107
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>mutagen
<222>(11)..(17)
<223>mutc-df118c-q124c的轻链cl序列
<400>27
argthrvalalaalaproservalpheilecysproproseraspglu
151015
cysleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe
202530
tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln
354045
serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser
505560
thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu
65707580
lyshislysvaltyrthrcysgluvalthrhisglnglyleuserser
859095
provalthrlysserpheasnargglyglucys
100105
<210>28
<211>321
<212>dna
<213>人工序列
<400>28
cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatctgcccgccatctgatgagtgcttgaaatct60
ggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacag120
tggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggac180
agcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgag240
aaacacaaagtctacacctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaag300
agcttcaacaggggagagtgt321
<210>29
<211>98
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>mutagen
<222>(9)..(9)
<223>mutdf126c重链ch1序列
<400>29
alaserthrlysglyproservalcysproleualaproserserlys
151015
serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr
202530
pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser
354045
glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser
505560
leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr
65707580
tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys
859095
lysval
<210>30
<211>294
<212>dna
<213>人工序列
<400>30
gctagcaccaagggcccatcggtctgccccctggcaccctcctccaagagcacctctggg60
ggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg120
tggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca180
ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacc240
tacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagtt294
<210>31
<211>98
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>mutagen
<222>(11)..(11)
<223>mutcl128c重链ch1序列
<400>31
alaserthrlysglyproservalpheprocysalaproserserlys
151015
serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr
202530
pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser
354045
glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser
505560
leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr
65707580
tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys
859095
lysval
<210>32
<211>294
<212>dna
<213>人工序列
<400>32
gctagcaccaagggcccatcggtcttcccctgcgcaccctcctccaagagcacctctggg60
ggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg120
tggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca180
ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacc240
tacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagtt294
<210>33
<211>98
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>mutagen
<222>(53)..(53)
<223>mutbf170c重链ch1序列
<400>33
alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys
151015
serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr
202530
pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser
354045
glyvalhisthrcysproalavalleuglnserserglyleutyrser
505560
leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr
65707580
tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys
859095
lysval
<210>34
<211>294
<212>dna
<213>人工序列
<400>34
gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctggg60
ggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg120
tggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacacctgcccggctgtcctacagtcctca180
ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacc240
tacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagtt294
<210>35
<211>98
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>mutagen
<222>(56)..(56)
<223>mutev173c重链ch1序列
<400>35
alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys
151015
serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr
202530
pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser
354045
glyvalhisthrpheproalacysleuglnserserglyleutyrser
505560
leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr
65707580
tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys
859095
lysval
<210>36
<211>294
<212>dna
<213>人工序列
<400>36
gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctggg60
ggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg120
tggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggcttgcctacagtcctca180
ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacc240
tacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagtt294
<210>37
<211>113
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>mutagen
<222>(101)..(101)
<223>k218e重链ch1序列
<400>37
alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys
151015
serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr
202530
pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser
354045
glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser
505560
leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr
65707580
tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys
859095
lysvalgluproglusercysasplysthrhisthrcysproprocys
100105110
pro
<210>38
<211>339
<212>dna
<213>人工序列
<400>38
gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctggg60
ggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg120
tggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca180
ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacc240
tacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagccc300
gaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgccca339
<210>39
<211>113
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>mutagen
<222>(103)..(103)
<223>c220s重链ch1序列
<400>39
alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys
151015
serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr
202530
pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser
354045
glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser
505560
leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr
65707580
tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys
859095
lysvalgluprolysserserasplysthrhisthrcysproprocys
100105110
pro
<210>40
<211>339
<212>dna
<213>人工序列
<400>40
gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctggg60
ggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg120
tggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca180
ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacc240
tacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagccc300
aaatctagcgacaaaactcacacatgcccaccgtgccca339
<210>41
<211>113
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>mutagen
<222>(101)..(103)
<223>k218e-c220s重链ch1序列
<400>41
alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys
151015
serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr
202530
pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser
354045
glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser
505560
leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr
65707580
tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys
859095
lysvalgluprogluserserasplysthrhisthrcysproprocys
100105110
pro
<210>42
<211>339
<212>dna
<213>人工序列
<400>42
gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctggg60
ggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg120
tggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca180
ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacc240
tacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagccc300
gaatctagcgacaaaactcacacatgcccaccgtgccca339
<210>43
<211>98
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>mutagen
<222>(9)..(11)
<223>mutc-df126c-l128c重链ch1序列
<400>43
alaserthrlysglyproservalcysprocysalaproserserlys
151015
serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr
202530
pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser
354045
glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser
505560
leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr
65707580
tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys
859095
lysval
<210>44
<211>294
<212>dna
<213>人工序列
<400>44
gctagcaccaagggcccatcggtctgcccctgcgcaccctcctccaagagcacctctggg60
ggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg120
tggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca180
ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacc240
tacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagtt294
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！