本发明属于分子生物领域，涉及一种红细胞膜表面修饰基因递送系统及其应用。
背景技术：
随着红细胞载体的研究越来越广泛，作为自体细胞，红细胞载体具有很多独特的优势。它是血液中数量最多且寿命最长的细胞，具有极高的生物相容性，在体内循环时间能够长达120天，并且能够完全降解。因此，被广泛的用于药物载体，进行疾病的治疗。但是，红细胞直接包载药物也存在一些缺陷，如药物漏出，难以标准化制备等，这些都限制了其应用。因此，研究者们分离出纯净的红细胞膜，既保留了红细胞的优势，又易于制备，广泛应用于纳米药物递送系统。但是，红细胞膜很少用于基因递送系统，进行基因治疗。
目前，基因治疗的关键是安全高效的基因递送系统的构建与制备，如何获得安全高效的基因递送系统是非常重要的研究内容。病毒递送系统转染效果很好，但是因其安全问题备受争议。近年来，阳离子聚合物递送系统因其易于制备修饰、高转染效率等特点，受到了人们广泛的关注。但是由于其较高的电荷密度，在具有高的细胞转染效率的同时也具有很高的细胞毒性。并且，由于其正电荷的表面，这种递送系统在血液中很不稳定，且易被清除，在血液中循环时间很短，达不到满意的基因治疗效果。因此，安全高效稳定且具有血液长循环特点的基因递送系统的设计仍面临着很大的挑战。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有很好的生物相容性、在血液中长时间循环及高效基因递送效果的红细胞膜表面修饰基因递送系统。
本发明的第二个目的是提供红细胞膜表面修饰基因递送系统的制备方法。
本发明的第三个目的是提供红细胞膜表面修饰基因递送系统在制备基因递送药物的应用。
本发明的技术方案概述如下：
红细胞膜表面修饰基因递送系统的制备方法，包括如下步骤：
一.纳米红细胞膜液的制备：
(1)按比例，取375微升血液，加入edta，阻止其凝血，在600-1000g转速、4℃条件下离心5-10分钟，移除血浆和白细胞层，得到样品1；
所述edta和所述血液比例为1.5毫克/毫升；
(2)样品1用1×pbs缓冲溶液清洗至少5次，加入相当于所述血液体积8-20倍的0.25×pbs缓冲溶液，冰浴条件下，放置30-60分钟，使红细胞膜破裂并释放血红素，在4000-5000g转速下离心10-15分钟，收集浅粉色物为样品2；
(3)样品2用1×pbs清洗至少5次，离心，得到样品3，加入到8毫升ph＝7.4的pbs缓冲溶液中，超声1-2小时，得到样品4；
(4)将样品4通过脂质体挤出器来回挤压过200-800纳米的聚碳酸酯薄膜，反复进行至少10次，收集红细胞膜囊泡液为样品5；
(5)将样品5超声1-2小时，得纳米红细胞膜液为样品6，备用；
二.基因复合物的制备：
(1)以dmso为溶剂，配制浓度为2-5毫克/毫升的plga-pei液为液体3，将液体3以10秒一滴的速度滴入搅拌的ph＝7.4的pbs缓冲溶液中，密封、静置5-10小时；液体3与ph＝7.4的pbs缓冲溶液的体积比为1：5-20；plga-pei为p(la-co-ga)-g-pei的简称；
(2)将步骤(1)获得的液体移入截留分子量为1000-3500的透析袋中，用ph＝7.4的pbs缓冲溶液透析2-3天，得到基因载体液；
(3)ph＝7.4的pbs缓冲溶液配制的浓度为0.10毫克/毫升的基因溶液，在搅拌下，按pei中的氮/基因中的磷的摩尔比＝20的比例，滴加到0.2毫克/毫升基因载体液中，搅拌1-2小时,得到基因复合物；
三.按体积比1-3:1的比例，将样品6滴加到基因复合物中,得到红细胞膜表面修饰基因递送系统。
基因优选pegfp-znf580基因或cy5标记的寡核苷酸，还可以采用其它的基因。
上述制备方法制备的红细胞膜表面修饰基因递送系统。
上述红细胞膜表面修饰基因递送系统在制备基因递送药物的应用。
本发明的优点是：
(1)本发明的红细胞膜表面修饰的基因递送系统，采用基于pei的两亲性可降解聚合物负载基因，转染效率高，细胞毒性低。
(2)本发明的红细胞膜表面修饰的基因递送系统，在基因复合物表面包裹纳米级别的红细胞膜，作为基因递送系统，生物相容性更好，转染效率高，且在血液中更加稳定，避免了其在体内很快被清除，在体内的循环时间大大延长，进一步有利于基因递送与表达，从而达到治疗疾病的目的。
附图说明
图1为内皮细胞转染图。
图2为相对细胞活性图。
图3为体内循环时间图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。应理解，本发明的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做改动或修改,该等价形式同样落于本申请的权利要求所限定的范围。
ea.hy926细胞购于中国科学院细胞库(上海研发公共服务平台)。
plga-pei是p(la-co-ga)-g-pei的简称；
plga数均分子量4000-15000(商品)；
pei重均分子量为1800-10000(商品)；
la为丙交酯的简称，
ga为乙交酯的简称，
pei为聚乙烯亚胺的简称，所述pei为10kda
脂质体挤出器型号为avantipolarlipids,usa。
稀盐酸：质量分数低于20％的盐酸。
实施例1
红细胞膜表面修饰基因递送系统的制备方法，包括如下步骤：
一.纳米红细胞膜液的制备：
(1)取375微升昆明昆明雄性小鼠，加入edta，阻止其凝血，在800g转速、4℃条件下离心8分钟，移除血浆和白细胞层，得到样品1；
所述edta和所述血液比例为1.5毫克/毫升；
(2)样品1用1×pbs缓冲溶液清洗10次，加入相当于所述血液体积12倍的0.25×pbs缓冲溶液，冰浴条件下，放置45分钟，使红细胞膜破裂并释放血红素，在4500g转速下离心12分钟，收集浅粉色物为样品2；
(3)样品2用1×pbs清洗5次，离心，得到样品3，加入到8毫升ph＝7.4的pbs缓冲溶液中，超声1.5小时，得到样品4；
(4)将样品4通过脂质体挤出器来回挤压过400纳米的聚碳酸酯薄膜，反复进行20次，收集红细胞膜囊泡液为样品5；
(5)将样品5超声1.5小时，得纳米红细胞膜液为样品6，备用；
二.基因复合物的制备：
(1)以dmso为溶剂，配制浓度为3毫克/毫升的plga-pei液为液体3(plga-pei见实施例4)，将液体3以10秒一滴的速度滴入搅拌的ph＝7.4的pbs缓冲溶液中，密封、静置8小时；液体3与ph＝7.4的pbs缓冲溶液的体积比为1：10；
(2)将步骤(1)获得的液体移入截留分子量为1000的透析袋中，用ph＝7.4的pbs缓冲溶液透析3天，得到基因载体液；
(3)ph＝7.4的pbs缓冲溶液配制的浓度为0.10毫克/毫升的基因(pegfp-znf580)溶液，在搅拌下，按pei中的氮/基因中的磷的摩尔比＝20的比例，滴加到0.2毫克/毫升基因载体液中，搅拌1.5小时,得到基因复合物；
三.按体积比2:1的比例，将样品6滴加到基因复合物中,得到红细胞膜表面修饰基因递送系统。
用cy5标记的寡核苷酸替代本实施例的pegfp-znf580，其它同本实施例，得到相应的红细胞膜表面修饰基因递送系统。
实施例2
红细胞膜表面修饰基因递送系统的制备方法，包括如下步骤：
一.纳米红细胞膜液的制备：
(1)取375微升昆明雄性小鼠血液，加入edta，阻止其凝血，在600g转速、4℃条件下离心10分钟，移除血浆和白细胞层，得到样品1；
所述edta和所述血液比例为1.5毫克/毫升；
(2)样品1用1×pbs缓冲溶液清洗5次，加入相当于所述血液体积8倍的0.25×pbs缓冲溶液，冰浴条件下，放置30分钟，使红细胞膜破裂并释放血红素，在4000g转速下离心15分钟，收集浅粉色物为样品2；
(3)样品2用1×pbs清洗6次，离心，得到样品3，加入到8毫升ph＝7.4的pbs缓冲溶液中，超声1小时，得到样品4；
(4)将样品4通过脂质体挤出器来回挤压过200纳米的聚碳酸酯薄膜，反复进行15次，收集红细胞膜囊泡液为样品5；
(5)将样品5超声1小时，得纳米红细胞膜液为样品6，备用；
二.基因复合物的制备：
(1)以dmso为溶剂，配制浓度为2毫克/毫升的plga-pei液为液体3，将液体3以10秒一滴的速度滴入搅拌的ph＝7.4的pbs缓冲溶液中，密封、静置5小时；液体3与ph＝7.4的pbs缓冲溶液的体积比为1：5；plga-pei为p(la-co-ga)-g-pei的简称；
(2)将步骤(1)获得的液体移入截留分子量为3500的透析袋中，用ph＝7.4的pbs缓冲溶液透析2天，得到基因载体液；
(3)ph＝7.4的pbs缓冲溶液配制的浓度为0.10毫克/毫升的基因溶液，在搅拌下，按pei中的氮/基因中的磷的摩尔比＝20的比例，滴加到0.2毫克/毫升基因载体液中，搅拌1小时,得到基因复合物；
三.按体积比3:1的比例，将样品6滴加到基因复合物中,得到红细胞膜表面修饰基因递送系统。
用cy5标记的寡核苷酸替代本实施例的pegfp-znf580，其它同本实施例，得到相应的红细胞膜表面修饰基因递送系统。
实施例3
红细胞膜表面修饰基因递送系统的制备方法，包括如下步骤：
一.纳米红细胞膜液的制备：
(1)取375微升昆明雄性小鼠血液，加入edta，阻止其凝血，在1000g转速、4℃条件下离心5分钟，移除血浆和白细胞层，得到样品1；
所述edta和所述血液比例为1.5毫克/毫升；
(2)样品1用1×pbs缓冲溶液清洗7次，加入相当于所述血液体积20倍的0.25×pbs缓冲溶液，冰浴条件下，放置60分钟，使红细胞膜破裂并释放血红素，在5000g转速下离心10分钟，收集浅粉色物为样品2；
(3)样品2用1×pbs清洗7次，离心，得到样品3，加入到8毫升ph＝7.4的pbs缓冲溶液中，超声2小时，得到样品4；
(4)将样品4通过脂质体挤出器来回挤压过800纳米的聚碳酸酯薄膜，反复进行10次，收集红细胞膜囊泡液为样品5；
(5)将样品5超声2小时，得纳米红细胞膜液为样品6，备用；
二.基因复合物的制备：
(1)以dmso为溶剂，配制浓度为5毫克/毫升的plga-pei液为液体3，将液体3以10秒一滴的速度滴入搅拌的ph＝7.4的pbs缓冲溶液中，密封、静置10小时；液体3与ph＝7.4的pbs缓冲溶液的体积比为1：20；plga-pei为p(la-co-ga)-g-pei的简称；
(2)将步骤(1)获得的液体移入截留分子量为2000的透析袋中，用ph＝7.4的pbs缓冲溶液透析3天，得到基因载体液；
(3)ph＝7.4的pbs缓冲溶液配制的浓度为0.10毫克/毫升的基因溶液，在搅拌下，按pei中的氮/基因中的磷的摩尔比＝20的比例，滴加到0.2毫克/毫升基因载体液中，搅拌2小时,得到基因复合物；
三.按体积比1:1的比例，将样品6滴加到基因复合物中,得到红细胞膜表面修饰基因递送系统。
实施例4
plga-pei的制备，包括如下步骤：
(1)按摩尔比为1:20:20的比例，将数均分子量10000的plga、丁二酸酐和二甲氨基吡啶，以及三乙胺溶解在干燥的1,4-二氧六环中，在25℃、氮气保护下反应24小时，得到溶液2，将溶液2滴加入搅拌下的0℃的乙醇中，有沉淀生成；固液分离，固体溶解于三氯甲烷中，依次用饱和nahco3水溶液洗涤3次，稀盐酸洗涤4次，饱和nacl水溶液洗涤5次，得到的溶液加入无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液滴加入搅拌下的正己烷中，有沉淀生成，固液分离，固体真空干燥至恒重，得端基为羧基的plga；所述三乙胺为所述plga质量的2倍；(有文献报道)
(2)按摩尔比为1:20:20的比例，将端基为羧基的plga、edc和nhs溶解在dmso中，室温搅拌2小时，加入10kdapei的二甲基亚砜溶液中，使所述端基为羧基的plga和所述pei的摩尔比为1:20，室温搅拌反应24小时，置于截留分子量为1.4万的透析袋中，用超纯水透析3天，透析液冷冻干燥得plga-pei；
所述edc为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的简称；
所述nhs为n-羟基丁二酰亚胺的简称；
所述pei为聚乙烯亚胺的简称；
所述dmso为二甲基亚砜的简称；
本实施例仅是举例，并不对plga-pei的制备进行限定。
plga-pei为p(la-co-ga)-g-pei的简称。
实施例5
实施例1和实施例2制备的红细胞膜表面修饰基因递送系统的基因递送效果通过体外转染进行评价，包括如下步骤：
将ea.hy926细胞接种在加入dmem培养基的24孔细胞培养板上，密度为4×105细胞/孔，过夜培养至细胞达到50％-70％的融合。先用无血清培养基饥饿12小时，用d-hanks清洗掉细胞碎片和代谢产物。分别加实施例1、实施例2制备的红细胞膜表面修饰基因递送系统(含有pegfp-znf580)，细胞培养箱中孵育4小时后取出，用d-hanks清洗并更换成完全培养基，继续培养。在24小时通过倒置荧光显微镜观察细胞内表达的绿色荧光蛋白，
并采用流式细胞仪对转染效率进行测定。
分析结果：图1为细胞转染结果，分别测定了实施例1和实施例2制备的红细胞膜表面修饰基因递送系统。其中，图1(1)为绿色荧光蛋白表达的荧光图，图1(2)为转染效率图。从图1(1)中可以看出，实施例1和实施例2制备的红细胞膜表面修饰基因递送系统能够将基因有效地递送至细胞内，且基因能够表达成相应的绿色荧光蛋白。从图1(2)中，可以看出，实施例1和实施例2制备的红细胞膜表面修饰基因递送系统均获得了较高的转染效率。
实施例6
对照：
以实施例1步骤二获得的基因复合物为对照和实施例1及实施例2制备的红细胞膜表面修饰基因(pegfp-znf580)系统的细胞毒性由mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)比色法进行评价，包括如下步骤：
ea.hy926细胞接种到96孔板(1×104细胞/孔)dmem细胞培养基中，细胞生长到90％后，将dmem细胞培养基换为无血清dmem培养基，进行饥饿处理12小时。之后培养基换为新鲜的10％fbsdmem生长培养基。将不同浓度的基因复合物和实施例1及实施例2制备的红细胞膜表面修饰基因递送系统水溶液加入到10％fbsdmem生长培养基中，混合均匀。24小时后弃去上层清液，向每个孔中加入5毫克/毫升的mtt溶液(ph＝7.4pbs缓冲溶液为溶剂)20微升，继续培养4小时，使甲瓒结晶。培养，小心弃去孔内培养基，而后向孔内加入150微升dmso，置摇床上低速振荡10分钟，使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪在490纳米波长处测量各孔的光密度值(od)。利用如下公式计算相对细胞活性(％)：
其中，od490’：实验组减去调零组的吸光度值，avg(od490c’)：矫正后的对照组吸光度平均值。
分析结果：图2为相对细胞活性，分别测定了基因复合物和实施例1及实施例2制备的红细胞膜表面修饰基因递送系统。其中，
a为基因复合物的相对细胞活性；
b为实施例1制备的红细胞膜表面修饰基因递送系统的相对细胞活性；
c为实施例2制备的红细胞膜表面修饰基因递送系统的相对细胞活性。
从图中可以看出，与基因复合物相比，由于纳米红细胞膜的包裹，实施例1及实施例2制备的红细胞膜表面修饰基因递送系统具有更高的细胞活性、更低的细胞毒性。
实施例7
利用体内循环实验来评价基因复合物和实施例1及实施例2制备的红细胞膜表面修饰基因(cy5标记的寡核苷酸)递送系统在体内的循环时间。步骤如下：
雄性昆明鼠分别经尾部静脉注射200微升基因复合物、实施例1及实施例2制备的红细胞膜表面修饰基因递送系统水溶液。注射后分别在2分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时和72小时时间点时，采血20微升。向采集的血液中加入200微升0.01摩尔/升pbs缓冲溶液(含有肝素，浓度为10u/毫升)。用300g转速离心5分钟去除血细胞，取180微升上清液利用多功能酶标仪进行荧光强度的测定。所有的动物实验都遵循武警后勤学院动物保护指导方针来执行，符合美国国立卫生研究院―实验动物保护和使用指南。
分析结果：图3为体内循环时间，分别测定了基因复合物和实施例1及实施例2制备的红细胞膜表面修饰基因递送系统。其中，
a为基因复合物的体内循环时间；
b为实施例1制备的红细胞膜表面修饰基因递送系统的体内循环时间；
c为实施例2制备的红细胞膜表面修饰的基因递送系统的体内循环时间。
从图中可以看出，基因复合物在体内的循环时间大概为24小时，而实施例1制备的红细胞膜表面修饰基因递送系统的体内循环时间约为72小时，实施例2制备的红细胞膜表面修饰的基因递送系统的体内循环时间大于72小时。结果说明，相对于基因复合物来说，红细胞膜表面修饰的基因递送系统具有显著提高的体内循环时间，且随着红细胞膜包裹量的提高，体内循环时间延长。
pegfp-znf580委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中的znf580基因的核苷酸序列用seqno.1所示。
cy5标记的寡核苷酸购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
各实施例采用的血液可以使用人血液，要采用相同的血型的血液为原料。
序列表
<110>天津大学
<120>红细胞膜表面修饰基因递送系统及制备方法及应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>519
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
atgctgctgctgcctccgcgcccaccgcatccgcgttcttcttctccagaagcaatggac60
ccgccgcctccgaaagccccaccgttcccgaaagctgaaggcccgtcctctactccgtct120
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