本发明涉及分子标记制备与应用技术领域，具体是一种山楂est-ssr标记引物的制备方法及应用。
背景技术：
山楂是蔷薇科(rosa-ceae)山楂属(crataegusl.)植物，原产于中国的山楂属植物有18个种，6个变种，经过长期培育和选择，形成了丰富的变异类型。对山楂资源进行准确的鉴定和分类，是进一步有效利用山楂资源的基础。目前山楂资源遗传基础研究比较落后，至今仍然是以形态分析方法进行资源评价鉴定为主，且在山楂上开展分子生物学研究的报道也较少，山楂基因组背景研究较少，通常只能利用近缘物种的相关信息进行参考，利用山楂转录组序列开发est-ssr引物的研究也未见报道。
ssr又称简单重复序列，(simplesequencerepeat，ssr)，也可称为微卫星dna，它以1-6个碱基序列为基本单位进行多次重复组成的dna序列，因为每个ssr序列的基本单元重复次数在不同的基因型间有很大差异，进而形成了ssr的多态性。ssr具有很多优点：(1)分布在整个基因组中，具有随机性、均匀性以及广泛性；(2)ssr序列两端较为保守，同种而不同类型间基本相同；(3)为共显性标记；(4)操作简便且快速，结果较为稳定。(4)而est-ssr来源于表达的基因组区域，可直接反映物种相关基因的多样性。基于此，ssr标记已被广泛应用于果树大量的遗传研究中(高志红，章镇，韩振海.2002.ssr技术及其在果树上的应用，果树学报.19(5)：281-285)。ssr也是果树分子遗传图谱构建中重要的标记类型(kijasjmh,etal.integrationoftrinucleotidemicrosatellitesintoalinkagemapofcitrus.1997,94:701-706；joobeart.etal.developmentofasecondgenerationlinkagemapforalmondusingrapdandssrmarkers.genome,2000,43:649-655)。本发明首次提出基于山楂转录组序列开发est-ssr引物技术方法的建立及带有山楂基因组信息的est-ssr引物的开发，为今后山楂的相关研究提供参考，促进和提高山楂的基础研究水平。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种山楂est-ssr标记引物的制备方法及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种山楂est-ssr标记引物的制备方法，包括以下步骤：
1)从山楂转录组数据中筛选组装长度大于5000bp的片段序列；
2)使用ssrhunter软件对每条片段进行ssr发掘，单一序列中挑出占富含二、三、四或五核苷酸重复且长度≥10bp的est序列；
3)使用primer3软件对ssr上游和下游各150bp的碱基序列进行est-ssr引物的筛选，即得山楂est-ssr标记引物。
作为本发明进一步的方案：步骤3)的引物长度为18-23bp，退火温度为55-63℃，gc含量为40-60％，pcr扩增产物的长度为150-300bp。
作为本发明进一步的方案：步骤3)的最适引物长度为20bp，退火温度为58℃，gc含量为50％，pcr扩增产物长度为200bp。
一种山楂est-ssr标记引物的应用，所述的山楂est-ssr标记引物用于进行山楂杂交群体进行分子标记分析。
一种山楂est-ssr标记引物的应用，用设计完成的ssr引物对田间采回的山楂种间杂交f1群体及双亲进行ssr引物的筛选和扩增；计算每对ssr引物在山楂种间杂交群体中扩增的多态性信息。
一种山楂est-ssr标记引物的应用，将在种间杂交f1群体以及双亲中扩增的est-ssr数据进行整理，以双假侧交理论为依据进行山楂分子遗传图谱的构建。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提出山楂est-ssr标记引物的制备方法及应用，为今后山楂的相关研究提供参考，促进和提高山楂的基础研究水平。
附图说明
图1为山楂est-ssr标记引物“h32”在群体中的扩增效果图(作图群体单株1-24)。
图2为山楂est-ssr标记引物“h32”在群体中的扩增效果图(作图群体单株25-48)。
图3为山楂est-ssr标记引物“h32”在群体中的扩增效果图(作图群体单株49-72)。
图4为山楂est-ssr标记引物“h32”在群体中的扩增效果图(作图群体单株73-96)。
图5为山楂est-ssr标记引物构建的母本‘大绵球’遗传图谱。
图6为山楂est-ssr标记引物构建的父本‘秋金星’的遗传图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
请参阅图1-6，一种山楂est-ssr标记引物的制备方法，包括以下步骤：
1)从山楂转录组数据中筛选组装长度大于5000bp的片段序列，用于后续山楂est-ssr标记的开发；
2)使用ssrhunter软件对每条片段进行ssr发掘，单一序列中挑出占富含二、三、四或五核苷酸重复且长度≥10bp的est序列；
3)使用primer3软件对ssr上游和下游各150bp的碱基序列进行est-ssr引物的筛选，即得山楂est-ssr标记引物。引物长度为18-23bp，退火温度为55-63℃，gc含量为40-60％，pcr扩增产物的长度为150-300bp。优选的，最适引物长度为20bp，退火温度为58℃，gc含量为50％，pcr扩增产物长度为200bp。
4)一种山楂est-ssr标记引物的应用，所述的山楂est-ssr标记引物用于进行山楂杂交群体进行分子标记分析。用设计完成的ssr引物山楂杂交f1群体及双亲进行ssr引物的筛选和扩增；计算每对ssr引物在山楂种间杂交群体中扩增的多态性信息。
5)一种山楂est-ssr标记引物的应用，所述的山楂est-ssr标记引物用于山楂分子遗传图谱的构建。将在种间杂交f1群体以及双亲中扩增的est-ssr数据进行整理，以双假侧交理论为依据进行山楂分子遗传图谱的构建。
实施例1
1、供试材料：以山楂品种‘大绵球’为母本，‘秋金星’为父本创建杂交群体，选用92株杂交f1代为作图群体，采用ssr分子标记技术构建山楂分子遗传图谱；
2、选取山楂品种及杂交后代植株上嫩绿的叶片提取总dna，基因组dna提取依照马明等(2007)提出的改良ctab法；
3、利用本发明的山楂est-ssr标记引物进行分析，具体步骤如下：
3.1、est-ssr筛选及扩增；
3.1.1、pcr反应体系：本试验的ssr-pcr反应体系为16μl，各组分如下：10×buffer(含mg2+)1.6μl，dntp0.8μl(浓度2.5mm/μl)，引物2*0.8μl(浓度5nmol/μl)，taq聚合酶1μl(1u/μl)，模板dna1μl(20ng/μl)，ddh2o10μl；
3.1.2、pcr反应程序：ssr-pcr扩增在bio-radt100tmthermalcycler上运行，程序如下：1阶段：94℃下预变性5min；2阶段：94℃下变性1min，x℃退火1min(x为退火温度，根据不同引物而不同，一般在50-63℃之间)，72℃延伸1min，重复25次；3阶段：72℃延伸7min，4℃下保存；
3.1.3、显色：①配制5％聚丙烯酰胺凝胶，倒入玻璃槽中，待其冷却凝固之后放到电泳仪上(北京市六一仪器厂生产的dycz-24a型电泳仪)；②预电泳，使电流提前在聚丙烯酰胺凝胶中流通，冲刷掉一些杂质，以防pcr产物在电泳时受到阻碍，使得带型不整齐；③点样，每个点样孔点6-7μl的pcr产物，点样速度要快，不然前边点的样品可能会扩散；④电泳，进行电泳的恒定电压为240v，时间为2h左右，具体时间根据pcr产物的大小来定；⑤显色，首先将电泳完成的聚丙烯酰胺凝胶放到1g/l的agno3溶液中染色10min，然后用蒸馏水清洗，之后将凝胶放到含0.5mol/lnaoh和4％甲醛的混合溶液中显色直到出现清晰的条带为止，最后用蒸馏水清洗；
3.1.4、est-ssr标记筛选：根据已有山楂转录组数据设计了86对ssr引物，在北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成；ssr引物筛选是以双亲提供模板dna，根据上文提到的ssr-pcr反应体系分别加入相应的物质，分别对双亲模板dna进行扩增，退火温度设置为54℃；根据电泳结果分析符合ssr标记的条带(只有符合hk*hk、ab*cd、ab*cc、aa*bc、nn*np、lm*ll以及ef*eg此7种带型的引物才能用于山楂分子遗传图谱构建)，进而确定引物是否符合要求；已经确定的ssr引物有可能会因为退火温度不够而出现杂带，此时应该对这些ssr引物进行温度梯度筛选；每对引物设置8个温度梯度分别从63℃到50℃，依次为63.0℃、62.0℃、60.4℃、57.9℃、55.0℃、52.5℃、50.9℃以及50.0℃。经pcr扩增后，根据电泳结果找出与退火温度相对应的清晰、稳定且没有杂带的条带，以此确定退火温度；
3.2、ssr标记的统计：ssr分子标记在遗传图谱中是用引物名称来表示的；杂交群体在ssr分子标记上的条带带型只有符合hk*hk、ab*cd、ab*cc、aa*bc、nn*np、lm*ll以及ef*eg7种带型的才能用于遗传图谱的构建，hk*hk类型群体有hk、hh和kk3种带型，ab*cd类型群体有ac、ad、bc和bd4种类型，ab*cc类型群体有ac和bc2种带型，aa*bc类型群体有ab和ac2种带型，nn*np类型群体有nn和np2种带型，lm*ll类型群体有lm和ll2种带型，ef*eg类型群体有ee、ef、eg和fg4种带型；
3.3、遗传图谱的构建：应用joinmap3.0软件，设置lod为4.0，最大重组值为0.4，分别将母本分离位点+双亲共有分离位点和父本分离位点+双亲共有分离位点进行运算，通过kosambi函数将重组率转换为图距(cm)，并应用mapchart2.2软件分别绘制出双亲的分子遗传图谱；
在构建的遗传图谱中，母本‘大绵球’的遗传图谱包括21个连锁群，有153个标记位点，覆盖总图距1085.4cm，位点之间平均遗传距离为7.05cm；连锁群的平均长度为51.69cm，每个连锁群平均包含7.33个位点。在21个连锁群中，位点数最多的连锁群(dmq1)含76个位点，位点数最少的连锁群含有2个位点。最长的连锁群dmq3覆盖图距为138.987cm，最短的连锁群dmq17覆盖图距为7.285cm；父本‘秋金星’的遗传图谱包括22个连锁群，有170个标记位点，覆盖总图距1097.7cm，位点间平均遗传距离为6.45cm，连锁群平均长度49.89cm，每个连锁群平均包含7.73个位点。在22个连锁群中，位点数最多的连锁群(qjx1)含82个位点，位点数最少的连锁群分布含有2个位点。最长的连锁群qjx1覆盖图距为135.156cm，最短的连锁群qjx20覆盖图距为1.673cm。共包含est-ssr标记4个，分别位于连锁群5、19、20和21。
表1山楂est-ssr标记引物的序列
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。
序列表
<110>沈阳农业大学
<120>一种山楂est-ssr标记引物的制备方法及应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>3615
<212>dna
<213>脱氧核糖核酸(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>1
tctccactgctcaatcgtcttgaccatctccactgctcaatctgccaccaatttctcctt60
caagcgagagattggctggaatttgagattggctggaatttgggggcgagagagttgttt120
ggagagcagtgagaggatttcagagcgccaacctctcctccttctgttcgaccggtgaat180
cgaacttcagtcaaagctgcgaacttgaagtttgtgatgcttgtggggataggtttgtgc240
catgtgaaacaacgaagacattgatcacgacgaatggcctgaaatctgcacaagtttctt300
ctactcactgccgcggcctgaaatctgcacaactaccgccaacatttcctctatccgcga360
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