本发明涉及工业微生物发酵技术领域，具体涉及一种提高青蒿酸发酵产量的方法。
背景技术：
青蒿素是从复合花序植物黄花蒿茎叶中提取的有过氧基团的倍半萜内酯药物，由中国药学家屠呦呦在1971年发现，分子式为c15h22o5。青蒿素是继乙氨嘧啶、氯喹、伯喹之后最有效的抗疟特效药，尤其是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾，具有速效和低毒的特点，曾被世界卫生组织称做是“世界上唯一有效的疟疾治疗药物”。青蒿素在后来的40多年中得以广泛使用，据统计数据显示，每年全世界对于青蒿素及其衍生物的销售额便多达15亿美元。近些年，青篙素在抗血吸虫、调节或抑制体液的免疫功能、提高淋巴细胞的转化率，利胆，祛痰，镇咳，平喘等其他疾病的治疗中也显示出诱人的前景。因此，青蒿素市场前景非常广阔。
青蒿素主要有三种生产方法，一种是传统的从青蒿中提取，该方法受到气候、地域的影响大，产量不稳定；二是通过化学全合成获得，此方法难度极大，成本高昂；第三种方法是采用基因工程技术通过微生物发酵获得青蒿酸，再经过化学合成青蒿素，该方法产量高，生产稳定，生产成本低，且工艺绿色环保；第三种方法是采用基因工程技术通过微生物发酵获得青蒿酸，再合成青蒿素，该方法即通过生物合成的方法得到青蒿酸，然后经过化学转化生产青蒿素。2013年，who也批准了该工艺生产的青蒿素应用于临床。
第三种方法中青蒿素关键中间体青蒿酸对最终成品的收率和成本有很大影响。青蒿酸的微生物发酵方法开发始于2004年盖茨基金会的支持项目，国内外所采用的技术均是以此为基础发展而来的酵母发酵工艺，但实际工业化生产中存在较多问题，实现工业化生产难度仍然很大。
semi-syntheticartemisinin:amodelfortheuseofsyntheticbiologyinpharmaceuticaldevelopment(chrisj.paddonandjayd.keasling，2014，12卷，p355)公开了由于酿酒酵母工程菌在构建青蒿酸的合成基因时，需要半乳糖诱导的启动子启动后，才能实现青蒿酸的生物合成，因此发酵产青蒿酸的必须条件是半乳糖的存在。而实际生产中，半乳糖添加量很大，成本又极高(约180-250元/kg)，因此，发酵过程中，半乳糖的大量使用直接导致青蒿酸发酵成本高昂，最终导致生物合成青蒿素的成本仍然无法与天然提取的产品相抗衡，因此半合成青蒿素最终未能形成大规模的产业化生产。
high-levelsemi-syntheticproductionofthepotentantimalarialartemisinin(cjpaddon，pjwestfall，djpitera,et.al.nature,2013,496(7446):528-532)公开了通过基因敲除和重新构建的手段，克服了常规工艺操作中必须使用半乳糖作为合成基因启动子的诱导剂的缺陷，获得了可以不需要半乳糖诱导青蒿酸合成的酵母工程菌，但是，此菌种发酵周期为144小时，周期过长，且需要通过在发酵过程中大量添加肉豆蔻酸异丙酯(ipm)来制备青蒿酸，但肉豆蔻酸异丙酯(ipm)的大量添加不利于成本的控制，且菌种遗传稳定性差，产量不稳定，不利于工业化大规模生产。productionofamorphadieneinyeast,anditsconversiontodihydroartemisinicacid,precursortotheantimalarialagentartemisinin(pjwestfall，djpitera，jrlenihan,et.al.proceedingsofthenationalacademyofsciences.2012,109(3):e111-e118)描述了一种通过对酿酒酵母工程菌基因改造的方式，实现了紫穗槐-4,11-二烯的高产，但菌体内难以实现从紫穗槐-4,11-二烯到青蒿酸的转化，需在体外通过化学方法实现紫穗槐-4,11-二烯到青蒿酸的转化，转化工艺较为复杂，收率低，会引入新的杂质，成本高昂，因此，其实际工业化应用较差。专利cn101338309a公开了一种通过将cyp71av1p450基因和p450还原酶cpr基因导入酿酒酵母细胞来获得青蒿酸基因工程菌从而生产青蒿酸的方法，该方法对青蒿酸发酵产量的工艺优化及产量描述较少，且该专利中未对菌种可否工业化生产应用方面进行表述。
针对现有技术中青蒿酸发酵生产中存在的产量低、成本高、不能够实现工业化生产、菌种性能不稳定等缺点，寻找一种产量高，成本低、对人体无害和对环境友好，菌种遗传稳定性高，且能够实现工业化生产的青蒿酸发酵工艺很有必要。
技术实现要素：
本发明提供了一种提高青蒿酸发酵产量的方法，包括以下步骤：以可产青蒿酸的酿酒酵母工程菌为生产菌株，在含有乳糖水解液和外源因子的发酵培养基中发酵，所述乳糖水解液为乳糖经酶水解为葡萄糖和半乳糖的溶液，所述外源因子为甲羟戊酸和柠檬醛的一种或两种。
在优选的实施方案中，所述酶为β-半乳糖苷酶。
在优选的实施方案中，所述β-半乳糖苷酶与乳糖的质量比为0.1-2：100。
在优选的实施方案中，所述乳糖水解液中葡萄糖和半乳糖的量与发酵培养基的质量体积比分别为15-30：1(单位为g/l)。
在优选的实施方案中，所述乳糖经酶水解的水解温度为50-55℃，水解时间为3-5h，水解率为90％-95％，水解ph为4-7，优选5.5。
在优选的实施方案中，所述外源因子在发酵培养基中的浓度为0.1-0.5g/l。
在优选的实施方案中，所述发酵培养基还包括：硫酸铵8-15g/l；磷酸二氢钾5-8g/l；七水硫酸镁3-6.2g/l；维生素溶液8-12ml/l；金属离子溶液6-10ml/l；cuso4·5h2o20-40ug/l，其余为水，ph为5.0-5.5。用含氨13-14.5mol/l的水溶液调控ph；
所述金属离子溶液成分为：znso4·7h2o5.75g/l；mncl2·4h2o0.32g/l；cocl2·6h2o0.47g/l；namoo4·2h2o0.48g/l；cacl2·2h2o2.9g/l；feso4·7h2o2.8g/l；0.5medta80ml/l，其余为水；
所述维生素溶液成分为：生物素0.05g/l；泛酸钙1g/l；烟酸1g/l；肌醇25g/l；维生素b11g/l；吡哆醛1g/l；对氨基苯甲酸0.2g/l，其余为水。
在优选的实施方案中，所述发酵的时间为84-120h，发酵的温度为22-35℃。
在优选的实施方案中，所述发酵还包括流加碳源、氮源及非水溶性油状液体，所述非水溶性油状液体为棕榈酸异丙酯和油酸的一种或两种。
在优选的实施方案中，所述流加碳源的时间为从发酵10-18h开始，直至发酵结束，所述流加碳源为乳糖水解液、甘油水溶液、蔗糖水溶液和乙醇水溶液中的一种或几种。
在优选的实施方案中，所述乳糖水解液的浓度为400-700g/l，所述甘油水溶液的浓度为400-700g/l，所述蔗糖水溶液的浓度为400-700g/l，所述乙醇水溶液的浓度为80-99％(v/v)。
在优选的实施方案中，所述流加碳源的速度控制在每小时流加碳源的体积为发酵培养基的初始体积的0.2％-2％。
在优选的实施方案中，所述流加氮源的时间为从发酵36-45h开始，直至发酵结束，所述流加的氮源为酵母浸粉水溶液、蛋白胨水溶液和谷氨酸钠水溶液中的一种或几种。
在优选的实施方案中，所述酵母浸粉水溶液的浓度为200-500g/l，所述蛋白胨水溶液的浓度为200-500g/l，所述谷氨酸钠水溶液的浓度为200-500g/l。
在优选的实施方案中，所述流加氮源的速度控制在每小时流加氮源的体积为发酵培养基的初始体积的0.05％-0.5％。
在优选的实施方案中，所述流加非水溶性油状液体的时间为第48-55h后，流加方式为一次性补加。
在优选的实施方案中，所述流加非水溶性油状液体的体积为发酵培养基的初始体积的5％-40％。
在优选的实施方案中，所述生产菌株可进一步在含有抗生素的平板固体培养基上进行抗性筛选，所述抗生素为诺尔斯霉素、遗传霉素和潮霉素b的一种或几种。
在优选的实施方案中，所述抗生素在平板固体培养基上的含量为50-300μg/l。
在优选的实施方案中，所述平板培养的时间为30-50h。
按照本发明发酵工艺制备的青蒿酸产量可高达42g/l以上，青蒿酸的发酵产量有了极大的提高，同时，选择可水解为葡萄糖(葡萄糖可作为生长代谢的碳源)和半乳糖的乳糖水解液替代现有技术中的半乳糖，在酶的催化下，一分子的乳糖可以水解为一分子的葡萄糖和一分子的半乳糖，在水解率为100％的前提下，342.3g的乳糖可以水解为180.16g葡萄糖和180.16g半乳糖。由于半乳糖为青蒿酸发酵所必须的合成基因的启动子诱导剂且使用量大，而市场价约为乳糖的6倍，因此，极大的降低了发酵成本。
本发明中青蒿酸的发明工艺较现有技术中青蒿酸的生产工艺有益效果主要体现在以下几个方面：
(1)本发明发酵制备的青蒿酸，效价可高达42g/l，发酵效价高。
(2)本发明通过对乳糖进行水解，获得同时含有高浓度葡萄糖和半乳糖的水解液，葡萄糖可被直接利用，半乳糖可用于转入基因的启动子诱导剂，以此水解液作为发酵碳源，摒弃了直接添加半乳糖的工艺，极大的降低了青蒿酸的发酵成本。
(3)本发明在发酵培养基中，添加了甲羟戊酸和/或柠檬醛等外源因子，进一步提高了青蒿酸的发酵效价。
(4)本发明通过在发酵过程中一次性补加棕榈酸异丙酯和/或油酸等非水溶性油状液体，促使青蒿酸从发酵培养基中向油状液体中转移，减少青蒿酸堆积对发酵菌体的毒害，并进一步提高了青蒿酸的发酵产量，棕榈酸异丙酯和油酸均为无刺激性气味、无毒害的油状液体，环境友好且价格相对低廉，利于工业化大规模生产。
(5)本发明对可产青蒿酸的酵母基因工程菌进行了抗性筛选，菌种遗传稳定性较高。
具体实施方式
以下实施例对本发明作进一步说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制，本发明保护范围以权利要求为准。
本发明所用菌种为任意可产青蒿酸的酿酒酵母工程菌，可商购或在实验室自行构建，例如以购买自中国典型培养物保藏中心(武汉大学)保藏号cctccay92011的酿酒酵母菌为出发菌株，利用基因工程手段构建甲戊二羟酸途径(mva)基因、adh1(青蒿醇脱氢酶基因)和aldh1(青蒿醛脱氢酶基因)，过表达thmgr和erg20基因增加了酵母体内半萜类物质共同前体法尼基焦磷酸fpp的积累量，并通过过表达酿酒酵母mva路径基因和ads基因，抑制鲨烯合酶表达，实现青蒿二烯的大量合成，进一步的，导入外源基因cyp71av1(细胞色素p450酶基因)，从而实现青蒿酸的合成，具体菌种构建方法可参照文献rodk,paradiseem,ouelletm,etal.productionoftheantimalarialdrugprecursorartemisinicacidinengineeredyeast[j].nature,2006,440(7086):940-943和paddoncj,westfallpj,piteradj,etal.high-levelsemi-syntheticproductionofthepotentantimalarialartemisinin[j].nature,2013,496(7446)：528-532中的methods部分描述的详细方法；或公告号为cn101338309b的中国专利公开的可以生产青蒿酸的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，优选生物保藏号为cgmccno.1861的酿酒酵母。
本发明实施例中用到的菌种为以购买自中国典型培养物保藏中心(武汉大学)保藏号cctccay92011的酿酒酵母菌为出发菌株，通过利用基因工程手段构建的可发酵产青蒿酸的酿酒酵母工程菌，具体菌种构建方法参照文献rodk,paradiseem,ouelletm,etal.productionoftheantimalarialdrugprecursorartemisinicacidinengineeredyeast[j].nature,2006,440(7086):940-943和paddoncj,westfallpj,piteradj,etal.high-levelsemi-syntheticproductionofthepotentantimalarialartemisinin[j].nature,2013,496(7446)：528-532中的methods部分描述的详细方法。
除特别说明外，本发明实施例中所用的各种材料和试剂都是本领域种常用的材料和试剂，均可以通过常规的商业途径获得。
诺尔斯霉素，购自solarbiolifescience；遗传霉素，购自inalco；潮霉素b，购自solarbiolifescience。
本发明青蒿素效价检测所用的液相检测方法条件如下：色谱柱：diamonsilc18(250mm×460mm,5μm)，流动相：乙腈:0.2％(质量体积比，g/l)磷酸水溶液＝65:35(v/v)，梯度洗脱，保留时间：25min，流速：1ml/min，进样量：10μl，检测波长：212nm，柱温：(30±1)℃。
本发明中乳糖水解液中水解率的检测及计算方法：以rg乳糖溶于ql水溶液中为例，经一定量β-半乳糖苷酶水解后，取5ml乳糖水解液定容至500ml容量瓶中，即稀释100倍，将稀释100倍的乳糖水解液取1ml，用酶法进行葡萄糖浓度的检测，得出葡萄糖的浓度，以t(g/l)表示后，对水解率y进行计算，具体计算公式如下：
其中，
t为经酶法检测的葡萄糖浓度，g/l；
r为乳糖的量，g；
q为溶解乳糖的水体积，l；
342.3为乳糖的摩尔分子质量，g/mol；
180.16为葡萄糖的摩尔分子质量，g/mol。
本发明实施例中所用的种子培养基为：葡萄糖19.5g/l，(nh4)2so415g/l，kh2po48g/l，mgso4·7h2o6.2g/l，维生素溶液12ml/l，金属离子溶液10ml/l，cuso4·5h2o40ug/l，琥珀酸缓冲液(0.5m，ph5.0)100ml/l，其余为水，ph＝5.0。
本发明实施例中种子培养基、平板固体培养基与发酵培养基中用到的维生素溶液与金属离子溶液具体配方如下：
维生素溶液为：生物素0.05g/l；泛酸钙1g/l；烟酸1g/l；肌醇25g/l；维生素b11g/l；吡哆醛1g/l；对氨基苯甲酸0.2g/l，其余为水。
金属离子溶液为：znso4·7h2o5.75g/l；mncl2·4h2o0.32g/l；cocl2·6h2o0.47g/l；namoo4·2h2o0.48g/l；cacl2·2h2o2.9g/l；feso4·7h2o2.8g/l；0.5medta80ml/l，其余为水。
对比实施例1：
(1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.5％(v/v)接种到种子培养基中，培养16h，得菌种液；
(2)菌种的抗性筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-7倍后，吸取100μl涂至含有200μg/l潮霉素b的平板固体培养基上，培养40h，得酿酒酵母工程菌单菌落；
平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/l，(nh4)2so415g/l，kh2po48g/l，mgso4·7h2o6.2g/l，维生素溶液12ml/l，金属离子溶液10ml/l，cuso4·5h2o40ug/l，琥珀酸缓冲液100ml/l(0.5m，ph5.0)，琼脂20g/l，其余为水。
(3)种子培养：从含有抗生素的平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养24h得种子液；
(4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按照10％(v/v)的接种量接种至不添加外源因子的20l的发酵培养基中；
发酵培养基的配方为：葡萄糖25g/l；半乳糖25g/l；硫酸铵10g/l；磷酸二氢钾6g/l；七水硫酸镁5g/l；维生素溶液10ml/l；金属离子溶液8ml/l；cuso4·5h2o30ug/l，其余为水。发酵过程中，用含氨14mol/l的水溶液调控ph，使其发酵过程中ph维持在5.0-5.5之间。
从发酵培养15h开始直至发酵结束，持续性流加700g/l蔗糖水溶液，每小时的流加体积为发酵培养基初始体积20l的2％，从发酵培养40h开始直至发酵结束，持续性流加300g/l谷氨酸钠水溶液，每小时的流加体积为发酵培养基初始体积20l的0.2％，发酵培养52h后，一次性补加棕榈酸异丙酯和油酸，补加体积分别为发酵培养基初始体积20l的15％；发酵培养120h后，结束发酵，获得含青蒿酸的发酵液。
(5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经hplc检测得青蒿酸发酵产量为24.6g/l。
实施例1
(1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.5％接种到种子培养基中，培养16h，得菌种液；
(2)菌种的抗性筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-7倍后，吸取100μl涂至含有200μg/l潮霉素b的平板固体培养基上，培养40h，得酿酒酵母工程菌单菌落；
平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/l，(nh4)2so415g/l，kh2po48g/l，mgso4·7h2o6.2g/l，维生素溶液12ml/l，金属离子溶液10ml/l，cuso4·5h2o40ug/l，琥珀酸缓冲液100ml/l(0.5m，ph5.0)，琼脂20g/l，其余为水。
(3)种子培养：从含有抗生素的平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养24h得种子液；
(4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按照10％的接种量接种至含有甲羟戊酸和柠檬醛的20l的发酵培养基中培养，其中甲羟戊酸和柠檬醛在培养基中的浓度各为0.1g/l；
发酵培养基的配方为：乳糖水解液0.1l/l；硫酸铵10g/l；磷酸二氢钾6g/l；七水硫酸镁5g/l；维生素溶液10ml/l；金属离子溶液8ml/l；cuso4·5h2o30ug/l，甲羟戊酸0.1g/l；柠檬醛0.1g/l；其余为水。发酵过程中，用含氨14mol/l的水溶液调控ph，使其发酵过程中ph维持在5.0-5.5之间。
发酵培养基中的乳糖水解液的制备方法：取1144g乳糖溶解于2l水中，再加入12gβ-半乳糖苷酶，在ph为4.0，53℃条件下水解4h，水解率为93％，将所有的乳糖水解液混入发酵培养基中，发酵培养基的初始体积为20l，使乳糖水解液中葡萄糖和半乳糖与发酵培养基的质量体积比分别为28:1(g/l)
从发酵培养15h开始直至发酵结束，持续性流加700g/l蔗糖水溶液，每小时的流加体积为发酵培养基初始体积20l的2％，从发酵培养40h开始直至发酵结束，持续性流加300g/l谷氨酸钠水溶液，每小时的流加体积为发酵培养基初始体积20l的0.2％，发酵培养52h后，一次性补加棕榈酸异丙酯和油酸，补加的体积分别为发酵培养基初始体积20l的15％；发酵培养120h后，结束发酵，获得含青蒿酸的发酵液。
(5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经hplc检测得青蒿酸发酵产量为41.8g/l。
对比实施例1与实施例1的区别在于①实施例1发酵培养基加入乳糖水解液，对比实施例1中加入半乳糖，②实施例1中加入了外源因子甲羟戊酸和柠檬醛，对比实施例1中没有加入外源因子。与对比实施例1相比，实施例1发酵培养基中用乳糖水解液代替了对比实施例1中的半乳糖，当培养基中使用乳糖水解液时，可不用单独添加大量的半乳糖，从而使发酵成本显著降低，此外，对比实施例1效价为24.6g/l，实施例1效价为41.8g/l，青蒿酸的产量有明显的提高。因此，乳糖水解液的使用在保证青蒿酸产量的前提下，极大的降低了发酵成本，而外源因子的添加又显著的提高了青蒿酸发酵产量。
实施例2
(1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.1％(v/v)接种到种子培养基中，培养30h，得菌种液；
(2)菌种的抗性筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-5倍后，吸取100μl涂至含有300μg/l诺尔斯霉素的平板固体培养基上，培养30h，得酿酒酵母工程菌单菌落；
平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/l，(nh4)2so415g/l，kh2po48g/l，mgso4·7h2o6.2g/l，维生素溶液12ml/l，金属离子溶液10ml/l，cuso4·5h2o40ug/l，琥珀酸缓冲液100ml/l(0.5m，ph5.0)，琼脂20g/l，其余为水。
(3)种子培养：从含有抗生素的平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养16h得种子液；
(4)发酵培养：将步骤3)中所得的种子液按照10％(v/v)的接种量接种至含有甲羟戊酸的20l的发酵培养基中培养，其中甲羟戊酸在培养基中的浓度为0.3g/l；
发酵培养基的配方为：乳糖水解液0.05l/l；硫酸铵8g/l；磷酸二氢钾5g/l；七水硫酸镁3g/l；维生素溶液8ml/l；金属离子溶液6ml/l；cuso4·5h2o20ug/l；甲羟戊酸0.3g/l，其余为水。发酵过程中，用含氨13mol/l的水溶液调控ph，使其发酵过程中ph维持在5.0-5.5之间。
发酵培养基中的乳糖水解液的制备方法：取633g乳糖溶于1l水中，再加入0.633gβ-半乳糖苷酶，在ph为7.0，50℃条件下水解5h，水解率为90％，将所有的乳糖水解液混入发酵培养基中，发酵培养基的初始体积为20l，使乳糖水解液中葡萄糖和半乳糖与发酵培养基的质量体积比分别为15：1(g/l)。
从发酵培养10h开始直至发酵结束，持续性流加400g/l乳糖水解液，每小时的流加体积为发酵培养基初始体积20l的1％，从发酵培养36h开始直至发酵结束，持续性流加200g/l酵母浸粉水溶液，每小时的流加体积为发酵培养基初始体积20l的0.05％，发酵培养48h后，一次性补加棕榈酸异丙酯，补加的体积为发酵培养基初始体积20l的5％；发酵培养84h后，结束发酵，获得含青蒿酸的发酵液。
流加的乳糖水解液的制备方法为：取8000g乳糖溶于20l水中，再加入168.5gβ-半乳糖苷酶，在ph为5.5，50℃条件下水解5h，水解率为95％，即得400g/l的乳糖水解液。
(5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经hplc检测得青蒿酸发酵产量为38.9g/l。
实施例3
(1)菌种液的制备：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.3％接种到种子培养基中，培养20h，得菌种液；
(2)菌种的抗性筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-6倍后，吸取100μl涂至含有250μg/l遗传霉素的平板固体培养基上，培养35h，得酿酒酵母工程菌单菌落；
平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/l，(nh4)2so415g/l，kh2po48g/l，mgso4·7h2o6.2g/l，维生素溶液12ml/l，金属离子溶液10ml/l，cuso4·5h2o40ug/l，琥珀酸缓冲液100ml/l(0.5m，ph5.0)，琼脂20g/l，其余为水。
(3)种子培养：从含有抗生素的平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养20h得种子液；
(4)发酵培养：将步骤3)中所得的种子液按照10％的接种量接种至含有柠檬醛的20l的发酵培养基中培养，其中柠檬醛在培养基中的浓度为0.4g/l；
发酵培养基的配方为：乳糖水解液0.075l/l；硫酸铵15g/l；磷酸二氢钾8g/l；七水硫酸镁6.2g/l；维生素溶液12ml/l；金属离子溶液10ml/l；cuso4·5h2o40ug/l；柠檬醛0.4g/l，其余为水。发酵过程中，用含氨14.5mol/l的水溶液调控ph，使其发酵过程中ph维持在5.0-5.5之间。
发酵培养基中的乳糖水解液的制备方法：取800g乳糖溶于1.5l水中，再加入10gβ-半乳糖苷酶，在ph为5.5，55℃的条件下水解3h，水解率在95％，将所有的乳糖水解液混入发酵培养基中，发酵培养基的初始体积为20l，使乳糖水解液中葡萄糖和半乳糖与发酵培养基的质量体积比分别为20：1(g/l)。
从发酵培养12h开始直至发酵结束，持续性流加450g/l甘油水溶液，每小时的流加体积为发酵培养基初始体积20l的0.5％，从发酵培养38h开始直至发酵结束，持续性流加250g/l蛋白胨水溶液，每小时的流加体积为发酵培养基初始体积20l的0.1％，发酵培养50h后，一次性补加油酸，补加体积为发酵培养基初始体积20l的10％；发酵培养96h后，结束发酵，获得含青蒿酸的发酵液。
(5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经hplc检测得青蒿酸发酵产量为39.7g/l。
实施例4
(1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.8％接种到种子培养基中，培养18h，得菌种液；
(2)菌种的抗性筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-7倍后，吸取100μl涂至各含有150μg/l诺尔斯霉素和遗传霉素的平板固体培养基上，培养45h，得酿酒酵母工程菌单菌落；
平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/l，(nh4)2so415g/l，kh2po48g/l，mgso4·7h2o6.2g/l，维生素溶液12ml/l，金属离子溶液10ml/l，cuso4·5h2o40ug/l，琥珀酸缓冲液100ml/l(0.5m，ph5.0)，琼脂20g/l，其余为水。
(3)种子培养：从含有抗生素的平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养28h得种子液；
(4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按照10％的接种量接种至含有甲羟戊酸和柠檬醛的20l的发酵培养基中培养，其中甲羟戊酸和柠檬醛在培养基中的浓度各为0.2g/l；
发酵培养基的配方为：乳糖水解液0.1l/l；硫酸铵12g/l；磷酸二氢钾8g/l；七水硫酸镁6g/l；维生素溶液11ml/l；金属离子溶液8ml/l；cuso4·5h2o35ug/l；甲羟戊酸0.2g/l；柠檬醛0.2g/l，其余为水。发酵过程中，用含氨13.5mol/l的水溶液调控ph，使其发酵过程中ph维持在5.0-5.5之间。
发酵培养基中的乳糖水解液的制备方法：取1212g乳糖溶于2l水中，在加入24.2gβ-半乳糖苷酶，在ph为5.0，52℃的条件下水解3h，水解率在94％，将所有的乳糖水解液混入发酵培养基中，发酵培养基的初始体积为20l，使乳糖水解液中葡萄糖和半乳糖与发酵培养基的质量体积比分别为30：1(g/l)。
从发酵培养16h开始直至发酵结束，持续性流加65％(v/v)乙醇水溶液，每小时的流加体积为发酵培养基初始体积20l的1.2％，从发酵培养42h开始直至发酵结束，持续性流加350g/l酵母浸粉水溶液和350g/l蛋白胨水溶液，每小时的氮源流加体积分别为发酵培养基初始体积20l的0.25％，发酵培养55h后，一次性补加棕榈酸异丙酯和油酸，补加体积分别为发酵培养基初始体积20l的20％；发酵培养84h后，结束发酵，获得含青蒿酸的发酵液。
(5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经hplc检测得青蒿酸发酵产量为40.6g/l。
实施例5
(1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.4％接种到种子培养基中，培养24h，得菌种液；
(2)菌种的抗性筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-6倍后，吸取100μl涂至各含有50μg/l诺尔斯霉素和潮霉素b的平板固体培养基上，培养50h，得酿酒酵母工程菌单菌落；
平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/l，(nh4)2so415g/l，kh2po48g/l，mgso4·7h2o6.2g/l，维生素溶液12ml/l，金属离子溶液10ml/l，cuso4·5h2o40ug/l，琥珀酸缓冲液100ml/l(0.5m，ph5.0)，琼脂20g/l，其余为水。
(3)种子培养：从含有抗生素的平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养30h得种子液；
(4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按照10％的接种量接种至含有甲羟戊酸的20l的发酵培养基中培养，其中甲羟戊酸在培养基中的浓度为0.5g/l；
发酵培养基的配方为：乳糖水解液0.075l/l；硫酸铵15g/l；磷酸二氢钾7g/l；七水硫酸镁5.2g/l；维生素溶液12ml/l；金属离子溶液9ml/l；cuso4·5h2o40ug/l；甲羟戊酸0.5g/l，其余为水。发酵过程中，用含氨13.8mol/l的水溶液调控ph，使其发酵过程中ph维持在5.0-5.5之间。
发酵培养基中的乳糖水解液的制备方法：取800g乳糖溶于1.5l水中，再加入10gβ-半乳糖苷酶，在ph为5.5，55℃的条件下水解3h，水解率在95％，将所有的乳糖水解液混入发酵培养基中，发酵培养基的初始体积为20l，使乳糖水解液中葡萄糖和半乳糖与发酵培养基的质量体积比分别为20：1(g/l)。
从发酵培养18h开始直至发酵结束，持续性流加500g/l的乳糖水解液和500g/l甘油水溶液，每小时的流加体积分别为发酵培养基初始体积20l的0.8％，从发酵培养45h开始直至发酵结束，持续性流加400g/l蛋白胨水溶液和400g/l谷氨酸钠水溶液，每小时的流加体积分别为发酵培养基初始体积20l的0.2％，发酵培养50h后，一次性补加棕榈酸异丙酯，补加体积为发酵培养基初始体积20l的15％；发酵培养96h后，结束发酵，获得含青蒿酸的发酵液。
流加的乳糖水解液的制备方法为：取10000g乳糖溶于20l水中，在加入210gβ-半乳糖苷酶，在ph为5.5，50℃的条件下水解5h，水解率在95％，即得500g/l的乳糖水解液。
(5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经hplc检测得青蒿酸发酵产量为42.1g/l。
实施例6
(1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.6％接种到种子培养基中，培养16h，得菌种液；
(2)菌种的抗性筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-7倍后，吸取100μl涂至各含有100μg/l遗传霉素和潮霉素b的平板固体培养基上，培养35h，得酿酒酵母工程菌单菌落；
平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/l，(nh4)2so415g/l，kh2po48g/l，mgso4·7h2o6.2g/l，维生素溶液12ml/l，金属离子溶液10ml/l，cuso4·5h2o40ug/l，琥珀酸缓冲液100ml/l(0.5m，ph5.0)，琼脂20g/l，其余为水。
(3)种子培养：从含有抗生素的平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养24h得种子液；
(4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按照10％的接种量接种至含有柠檬醛的20l的发酵培养基中培养，其中柠檬醛在培养基中的浓度为0.2g/l；
发酵培养基的配方为：乳糖水解液0.075l/l；硫酸铵15g/l；磷酸二氢钾8g/l；七水硫酸镁6g/l；维生素溶液12ml/l；金属离子溶液10ml/l；cuso4·5h2o40ug/l；柠檬醛0.2g/l，其余为水。发酵过程中，用含氨13.5mol/l的水溶液调控ph，使其发酵过程中ph维持在5.0-5.5之间。
发酵培养基中的乳糖水解液的制备方法：取633g乳糖溶于1.5l水中，再加入3.2gβ-半乳糖苷酶，在ph为5.5，55℃的条件下水解5h，水解率在90％，将所有的乳糖水解液混入发酵培养基中，发酵培养基的初始体积为20l，使乳糖水解液中葡萄糖和半乳糖与发酵培养基的质量体积比分别为15:1(g/l)。
从发酵培养17h开始直至发酵结束，持续性流加600g/l甘油水溶液和600g/l蔗糖水溶液，每小时的流加体积分别为发酵培养基初始体积20l的0.7％，从发酵培养40h开始直至发酵结束，持续性流加450g/l酵母浸粉水溶液、450g/l蛋白胨水溶液和450g/l谷氨酸钠水溶液，每小时的流加体积分别为发酵培养基初始体积20l的0.15％，发酵培养48h后，一次性补加油酸，补加体积为发酵培养基初始体积20l的20％；发酵培养120h后，结束发酵，获得含青蒿酸的发酵液。
(5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经hplc检测得青蒿酸发酵产量为38.5g/l。
实施例7
(1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.7％接种到种子培养基中，培养20h，得菌种液；
(2)菌种的抗性筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-7倍后，吸取100μl涂至各含有80μg/l遗传霉素和潮霉素b的平板固体培养基上，培养45h，得酿酒酵母工程菌单菌落；
平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/l，(nh4)2so415g/l，kh2po48g/l，mgso4·7h2o6.2g/l，维生素溶液12ml/l，金属离子溶液10ml/l，cuso4·5h2o40ug/l，琥珀酸缓冲液100ml/l(0.5m，ph5.0)，琼脂20g/l，其余为水。
(3)种子培养：从含有抗生素的平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养28h得种子液；
(4)发酵培养：将步骤3)中所得的种子液按照10％的接种量接种至含有柠檬醛的20l的发酵培养基中培养，其中柠檬醛在培养基中的浓度为0.1g/l；
发酵培养基的配方为：乳糖水解液0.1l/l；硫酸铵13g/l；磷酸二氢钾8g/l；七水硫酸镁6.2g/l；维生素溶液10ml/l；金属离子溶液10ml/l；cuso4·5h2o30ug/l；柠檬醛0.1g/l，其余为水。发酵过程中，用含氨14mol/l的水溶液调控ph，使其发酵过程中ph维持在5.0-5.5之间。
发酵培养基中的乳糖水解液的制备方法：取1239g乳糖溶于2l水中，再加入5.2gβ-半乳糖苷酶，在ph为5.5，52℃的条件下水解5h，水解率在92％，将所有的乳糖水解液混入发酵培养基中，发酵培养基的初始体积为20l，使乳糖水解液中葡萄糖和半乳糖与发酵培养基的质量体积比分别为30：1(g/l)。
从发酵培养13h开始直至发酵结束，持续性流加700g/l蔗糖水溶液和70％(v/v)乙醇水溶液，每小时的流加体积分别为发酵培养基初始体积20l的0.1％，从发酵培养44h开始直至发酵结束，持续性流加500g/l酵母浸粉水溶液和500g/l谷氨酸钠水溶液，每小时的流加体积分别为发酵培养基初始体积20l的0.2％，发酵培养53h后，一次性补加棕榈酸异丙酯和油酸，补加体积分别为发酵培养基初始体积20l的18％；发酵培养90h后，结束发酵，获得含青蒿酸的发酵液。
(5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经hplc检测得青蒿酸发酵产量为36.7g/l。
实施例8
(1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.2％接种到种子培养基中，培养30h，得菌种液；
(2)菌种的抗性筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-5倍后，吸取100μl涂至各含有60μg/l诺尔斯霉素、遗传霉素和潮霉素b的平板固体培养基上，培养48h，得酿酒酵母工程菌单菌落；
平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/l，(nh4)2so415g/l，kh2po48g/l，mgso4·7h2o6.2g/l，维生素溶液12ml/l，金属离子溶液10ml/l，cuso4·5h2o40ug/l，琥珀酸缓冲液100ml/l(0.5m，ph5.0)，琼脂20g/l，其余为水。
(3)种子培养：从含有抗生素的平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养25h得种子液；
(4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按照10％的接种量接种至含有甲羟戊酸和柠檬醛的20l的发酵培养基中培养，其中甲羟戊酸和柠檬醛在培养基中的浓度各为0.25g/l；
发酵培养基的配方为：乳糖水解液0.1l/l；硫酸铵15g/l；磷酸二氢钾8g/l；七水硫酸镁6g/l；维生素溶液11ml/l；金属离子溶液8ml/l；cuso4·5h2o38ug/l；甲羟戊酸0.25g/l；柠檬醛0.25g/l；其余为水。发酵过程中，用含氨13.5mol/l的水溶液调控ph，使其发酵过程中ph维持在5.0-5.5之间。
发酵培养基中的乳糖水解液的制备方法：取1156g乳糖溶于2l水中，再加入9.8gβ-半乳糖苷酶，在ph为5.5，50℃的条件下水解5h，水解率在92％，将所有的乳糖水解液混入发酵培养基中，发酵培养基的初始体积为20l，使乳糖水解液中葡萄糖和半乳糖与发酵培养基的质量体积比分别为28：1(g/l)。
从发酵培养15h开始直至发酵结束，持续性流加550g/l乳糖水解液、550g/l甘油水溶液、550g/l蔗糖水溶液和55％(v/v)乙醇水溶液，每小时的流加体积为发酵培养基初始体积20l的0.3％，从发酵培养39h开始直至发酵结束，持续性流加400g/l酵母浸粉水溶液、400g/l蛋白胨水溶液和400g/l谷氨酸钠水溶液，每小时的流加体积为发酵培养基初始体积20l的0.1％，发酵培养51h后，一次性补加棕榈酸异丙酯和油酸，补加的体积分别为发酵培养基初始体积20l的5％；发酵培养120h后，结束发酵，获得含青蒿酸的发酵液。
流加的乳糖水解液的制备方法为：取11000g乳糖溶于20l水中，再加入232gβ-半乳糖苷酶，在ph为5.5，50℃的条件下水解5h，酶解率在95％，即得550g/l的乳糖水解液。
(5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经hplc检测得青蒿酸发酵产量为39.4g/l。