本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种利用属特异性引物定量检测污损早期不同涂层表面6种污损微生物菌属附着程度的方法。该方法为检测样品中污损微生物群落结构动态变化提供了高效、快速的技术手段，能够应用于检测不同海洋工程表面涂层污损微生物的附着程度。
背景技术：
海洋生物污损给全世界海洋产业的发展带来严重危害，极大程度上限制了人类对于海洋资源的开发和利用，海洋防污成为亟待解决的重要问题。很多研究表明，海洋早期污损微生物群落对于污损后期大型污损生物幼虫的定性附着具有重要影响。因此，定量检测污损早期不同涂层表面损微生物菌属附着程度非常重要，对污损生物早期附着的过程的研究是防污损技术开发的重要基础。目前关于污损生物的研究大多集中于污损生物生态学和防污技术方面，对于污损生物早期附着的过程的研究仍然不足。而想要对污损早期涂层表面污损微生物附着过程进行检测，分子标记方法成为首选的技术手段。该方法能够避开生物形态结构差异的干扰，直接通过检测生物体内大分子包含的稳定遗传信息，定量描述、分析附着情况，在相当程度上提高了鉴定主要海洋污损早期生物物种的准确度和效率。污损微生物菌属的附着程度检测至少在如下几个方面非常重要:(1)快速比较一批防污涂层在海洋污损早期抑制污损微生物附着能力的差异；(2)比较某个涂层在室内微生物纯培养体系中污损微生物附着率与实际海水中污损微生物附着率的差异。(3)优质涂层抑制海洋污损的机制研究。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种利用属特异性引物定量检测污损早期不同涂层表面6种污损微生物菌属附着程度的方法。测定的特异性是由6种与之对应的特异性引物来保障的。通过这些引物可以确保污损微生物菌属扩增的特异性。扩增结果可以通过qpcr或一般pcr结束后的凝胶扫描来实现定量检测。本发明是通过以下技术方案来实现：(1)以海上挂板表面样品中测得的6种菌属为对象，设计对应的特异性引物；(2)污损早期，不同涂层表面海水污损样本的采集和基因组提取；(3)利用6种特异性引物对上述基因组样本进行pcr扩增来定量检测6种对应菌属的附着程度。6种菌属的特异性引物设计方法如下：查找6种海洋污损微生物的全基因组，以全基因组中的特异性序列为基础，以属或种的分类学地位划分找到每个属或种的特异性基因片段，根据这段特异性基因片段，利用软件设计只可以扩增出该属或种片段的特异性引物。通过这些引物可以确保污损微生物菌属扩增的特异性。扩增结果可以通过qpcr或一般pcr结束后的凝胶扫描来实现定量检测。上述有关步骤的具体内容如下：(1)设计6类污损微生物菌属对应的特异性引物：首先从integratedmicrobialgenomes(img)【ballarinia，segatan，huttenhowerc，etal.simultaneousquantificationofmultiplebacteriabythebactochipmicroarraydesignedtotargetspecies-specificmarkergenes[j].plosone，2013，8(2)：e55764.】数据库获得并下载所有细菌和古细菌的核酸序列,共2887条。为了保证获得的是全基因组数据，需要对这些序列进行一个筛选。首先，序列的长度要大于50000nt，编码基因序列的个数也要大于50。除此之外，编码基因占编码序列的百分比也需要大于75％，同时该序列在ncbi的分类学标识必须能够确定在属和种的层面上。经过以上四个条件的筛选，初步确定获得的是细菌和古细菌的全基因组数据，最终筛选出共计2834个基因组序列。对于这些得到的每一个基因组，第一步，找出该基因组的所有的编码基因，聚集成一个基因群集。这个基因群集代表了这个基因组。把基因群集中的基因进行分组，形成一个个的genecore(核心基因家族)；所有物种的基因组只基因群集都进行这些genecores的分组。然后找出来各个物种在不同genecores中的特异性基因。对于一个给定的物种，使用uclust[17]工具计算该物种的基因组的‘cores’与所有其他基因组的同源性。为了增加genecore识别的鲁棒性，每一个分支特异的核心基因家族要与所有的原始基因组进行blast比对，目的是识别核心基因中一些在该分支中不是特异性的，同时把他们从后续标记基因列表中删除。用这种方法，我们可以排除掉一些基因，比如16srrna以及其他一些在分类学上普遍存在的基因。为了对基因的特异性进行一个比较，我们设置了一些blast比对参数，(1)1e-50<e-value<1e-5，(2)20<minimumalignmentlength<50。对每一个物种，重复执行以上三步，我们最终得到所有物种的特异性基因，再从特异性基因名单中随机选择第一个基因并利用primer-blast网站设计1-3对特异性的引物。合成这1-3对引物并使用海洋污损样本进行pcr扩增，扩增产物经过测序确定就是该目标物种的话，则对应的引物才可以定为该物种的物种特异性引物。使用上述步骤也可以把引物设计到属的层面上得到属特异性引物。但是属特异性引物扩增出来的pcr产物需要经过ta克隆【】得到一批阳性克隆的菌落，通过进一步的菌落pcr扩增和测序(至少对15个克隆进行测序)判断这些阳性克隆中的插入序列都是目标属的物种序列才可以满足属特异性引物的要求。利用上述文献提供的方法流程，得到具有全基因组污损生物物种共78个，其中细菌界(原核生物)有67个，真菌界有5个，真核动物有6个。对他们进行特异性基因寻找，结果如表格1.表1有特异性基因的物种及特异性基因个数序号有属特异性基因的物种名单序列个数序号有种特异性基因的物种名单序列个数1rhodococcus161polaribacterirgensii3322pantoea842pseudomonasfluorescens373oscillatoria3043pseudomonasaeruginosa2844pseudomonas634vibrioharveyi2945octadecabacter3385loktanellavestfoldensis3266rhodobacter256agrobacteriumtumefaciens3307roseobacter3517acinetobacterjohnsonii3508sulfitobacter3468acinetobacterlwoffii3489lyngbya3399aeromonashydrophila35010brevundimonas3610bacilluscereus3711caulobacter13712delftia34213arthrobacter3614agrobacterium33115jannaschia35016cellulophaga2817flavobacterium3018acinetobacter3719glaciecola35020cytophaga69721exiguobacterium37针对上述属特异性基因和种特异性基因各设计一对引物(共21+10＝31对)，经过特异性检测，得到最佳的6对引物满足属特异性要求(表格2)。具体的引物序列见权利要求部分。表26个菌属特异性引物信息(2)特异性引物的合成与稀释设计好的引物由上海生工公司完成合成。引物稀释具体操作如下：1)合成的引物为干粉状，在加水溶解前需离心，使贴于管壁与管盖的引物沉淀在管底，离心条件为8,000rpm，1min；2)按照生工提供的数据加入对应的无菌水，使得引物的终浓度为20μm；充分溶解后，使用无菌水稀释5倍，使引物终浓度为2μm；3)取其中的5μl进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为1.5％，根据凝胶电泳确认引物的大致浓度；4)稀释后的引物分装于-20℃冰箱冷冻保存，留后续实验使用。(3)污损早期海水污损样本的采集和(宏)基因组提取适用于海上现场取样或室内纯培养体系中的污损样本取样。海上早期污损样本的现场采集和宏基因组提取可采用热酚氯仿抽提法，其具体步骤为：1)将污损样品在海上(现场)刮下来约200微升，内含各种海洋生物及附着的污损微生物(纯培养体系中就只有污损微生物)，添加600微升饱和酚(ph8)，剧烈震荡一分钟，带回实验室。2)75℃水浴震荡10分钟后，室温静置3min，10000r/min离心10min；3)吸取上原清液至新ep管中并加入等体积酚，剧烈震荡1min后10000r/min离心10min；4)取其上层清液再加入等体积酚氯仿(1:1)，混匀1min后10000r/min离心15min；5)取上层清液再加入等体积的氯仿，混匀1min后10000r/min离心15min；取上清即为样品的(宏)基因组。也可以使用其他合适的宏基因组提取试剂盒。(4)利用菌属特异性引物对上述(宏)基因组样本进行一般pcr扩增来测定污损微生物的附着以上述(宏)基因组样品作为pcr扩增模板，以设计得到的6对菌属特异性引物为扩增引物进行pcr扩增反应。反应体系与反应条件如表3至表4所示。下述一般性pcr试剂盒npk02和npk62qpcr试剂盒等试剂属于威海晓东生物技术有限公司产品【参考文献：(1)anewnanopcrmolecularassayfordetectionofporcinebocavirus.jvirolmethods.2014jun；202:106-11.(2)ananoparticle-assistedpcrassaytoimprovethesensitivityforrapiddetectionanddifferentiationofwild-typepseudorabiesvirusandgene-deletedvaccinestrains.jvirolmethods.2013nov；193(2):374-8】表3pcr反应体系表4pcr反应条件(循环数为25-30，不超过30)pcr扩增产物的检测通过1.5％琼脂糖凝胶电泳显示。依据全部的检测结果，通过样品扩增出特应性条带和已扩增出条带的亮度初步分析各个小钢板表面原核生物群落随时间的变化。(5)利用菌属特异性引物对上述(宏)基因组样本进行qpcr扩增来测定污损微生物的附着：上述表格3中的一般pcr体系也可以添加合适的荧光染料后以qpcr的方式进行(npk62试剂盒)，这样进行的qpcr是针对样品中附着污损微生物的全基因组序列的总拷贝数的定量方法，而非包括的污损微生物细胞的详细个数。这样的定量测定也有其一定的实用价值。定量所使用的标准物质每个属使用自己的扩增产物定量测定浓度并依据扩增序列的平均分子量计算摩尔浓度后作为标准使用即可。按10倍稀释至10-10次作为qpcr定量的标准样本。因为被测样品扩增的是污损微生物同一个属中不同物种的长度非常接近的混合产物，所以标准样品的浓度必须使用摩尔浓度(或分子个数)，被测样品测定出来的结果也是摩尔浓度(或分子个数，每升多少个分子)。特异性的扩增保证qpcr产物的融解曲线只有一个单峰或融解温度非常接近(相差一般不超过3-5℃)的一组峰；扩增产物的特异性和污损微生物标准样品的配置将可以保证qpcr定量的有效性。附图说明1.图1为小钢板表面污损生物附着变化情况；<11个小钢板表面(a-k)污损附着情况>2.图2至7为特异性引物pcr扩增结果；图2不动杆菌属(acinetobacter)特异性引物pcr扩增结果。m为生工分子量marker产品md(100，250，500，750，1000，2000bp),下同。图3黄杆菌属(flavobacterium)特异性引物pcr扩增结果图4超微细菌属(glaciecola)特异性引物pcr扩增结果图5简纳西氏菌属(jannaschia)特异性引物pcr扩增结果图6红球菌属(rhodococcus)特异性引物pcr扩增结果图7亚硫酸盐杆菌属(sulfitobacter)特异性引物pcr扩增结果3.图8至12为特异性引物pcr扩增结果数据的进一步处理；图8黄杆菌属(flavobacterium)在2类材料表面特异性基因片段扩增条带光密度值平均值分析图9超微细菌属(glaciecola)在2类材料表面特异性基因片段扩增条带光密度值平均值分析图10简纳西氏菌属(jannaschia)在2类材料表面特异性基因片段扩增条带光密度值平均值分析图11红球菌属(rhodococcus)在2类材料表面特异性基因片段扩增条带光密度值平均值分析图12亚硫酸盐杆菌属(sulfitobacter)在2类材料表面特异性基因片段扩增条带光密度值平均值分析具体实施方式实施案例1.海洋污损样本的制备为了探究加入不同纳米材料的防污涂层表面的微生物群落进行挂板试验，模拟船体在海水的状态，从而得到海洋污损生物群落样品。(1)纳米材料的选取：选用的纳米材料如表5所示：表5纳米材料(2)涂板：将上表所示4种纳米材料按不同种类、不同浓度组合与底漆混合均匀后涂于钢板表面，共11种表面，编号为a-k，室温下晾干。实验中所用的钢板其材质与厚度均与威海船厂制造船底的钢板一致，基本可以达到模拟船底在海水中的效果。小钢板表面混合涂层中纳米材料浓度如表6所示：表6小钢板表面混合涂层纳米材料组合在威海小石岛海域挂板，测定不同纳米材料在与底漆混合均匀后形成的涂层表面对污损微生物附着程度的影响。钢板表面污损样本分别在第5天、第10天和第15天进行采集。其中，a、b、d、e、j、k为六种促进牡蛎生长的纳米材料表面，c、f、g、h、i为五种抑制牡蛎生长的纳米材料表面。污损附着情况见附图1。实施案例2.利用特异性引物扩增结果半定量评估海水污损样本中6个属微生物的附着将筛选出的6对属特异性引物应用到促进牡蛎生长材料表面和抑制牡蛎生长材料表面的微生物群落，依据pcr扩增结果及对应引物信息从而测定群落生物多样性的差异。为此，从保存各个小钢板样品洗脱液的管中均取出等体积的洗脱液于新管中，对样品进行标号，第1次取样样品标号为a1、b1、d2、e2、f2、g2、h2、i2、j2、k2、空，第2次取样样品标号为a2、b2、d2、f2、g2、空，第3次取样样品标号为a3、b3、c3、d3、e3、f3、g3、h3、i3、j3、k3(“空”代表空白组，即表面不含纳米材料的小钢板样品)；提取上述样本的宏基因组，然后分别使用6对属特异性引物进行扩增，电泳结果如附图2至7所示。(1)不动杆菌属(acinetobacter)特异性引物：依据pcr扩增结果图2看，只有样品a2扩增出条带，其他样品均未扩增出条带。(2)黄杆菌属(flavobacterium)特异性引物：依据pcr扩增结果图3看，其中样品a3、b2、c2、c3、d3、e3、f1、f2、f3、g1、g2、g3、h3、i3、j3、k3扩增出条带，并且条带亮度有差异，说明黄杆菌属在不同材料表面群落有差异。(3)超微细菌属(glaciecola)特异性引物：依据pcr扩增结果图4看，其中样品a2、a3、b3、c2、c3、d1、d2、d3、e1、e3、f1、f2、f3、g1、g2、g3、h1、h2、h3、i3、j2、j3、k1、k2、k3、空2扩增出条带，并且条带亮度有差异，说明超微细菌属在不同材料表面群落有差异。(4)简纳西氏菌属(jannaschia)特异性引物：依据pcr扩增结果图5看，其中样品a2、a3、b2、b3、c2、c3、d2、d3、e2、e3、f2、f3、g1、g2、g3、h1、h2、h3、i2、i3、j2、j3、k2、k3、空1扩增出条带，并且条带亮度有差异，说明超微细菌属在不同材料表面群落有差异。但其中e3样品扩增的条带长度与理论扩增长度不符将不纳入到群落分析中。(5)红球菌属(rhodococcus)特异性引物：依据pcr扩增结果图6看，其中样品a1、a2、a3、b1、b2、b3、c2、c3、d1、d2、d3、e3、f1、f2、g1、g2、g3、h1、h2、h3、i1、i3、j1、j2、j3、k1、k2、k3、空1、空2扩增出条带，并且条带亮度有差异，说明红球菌属在不同材料表面群落有差异。(6)亚硫酸盐杆菌属(sulfitobacter)特异性引物：依据pcr扩增结果图7看，其中样品a2、b2、b3、c3、d2、d3、e2、e3、f1、f2、f3、g2、g3、h2、h3、i2、i3、j2、j3、k1、k2、k3、空1扩增出条带，并且条带亮度有差异，说明亚硫酸盐杆菌属在不同材料表面群落有差异。实施案例3.钢板表面微生物群落特征的若干分析以目前设计筛选出的6对特异性引物与促进牡蛎生长纳米材料表面和抑制纳米材料表面所有样品pcr扩增结果，包括是否扩增出条带以及条带亮度等信息全部整合在一起进行群落分析。根据分析结果可知，促进牡蛎生长材料表面与抑制牡蛎生长材料表面均有黄杆菌属(flavobacterium)、超微细菌属(glaciecola)、简纳西氏菌属(jannaschia)、红球菌属(rhodococcus)、亚硫酸盐杆菌属(sulfitobacter)生长。依据扩增产物的条带亮度，明显可看出简纳西氏菌属(jannaschia)在促进牡蛎生长的材料表面比在抑制牡蛎生长的材料表面生长繁殖旺盛，生物量多。而其他4种菌属在两种类型的材料表面生长繁殖程度无明显差异。此外，不动杆菌属(acinetobacter)和红杆菌属(rhodobacter)仅出现在促进牡蛎生长的e钢板材料表面。实施案例4.利用特异性引物扩增结果和pcr条带光密度值分析几个属在不同涂层表面的相对附着量使用bio-rad公司的quantityone软件对电泳显示的条带进行去背景值后的光密度值检测，以条带的光密度值代表生物量，对钢板表面均有生长的5个菌属进行差异分析。以3次取样的样品pcr产物光密度值的平均值代表15天内该菌属在涂层表面的整体生物量情况。(1)从图8中可以看出，黄杆菌属(flavobacterium)在2类材料涂层表面生物量都非常低，两者之间差异很小，可忽略不计。(2)从图9中可以看出，超微细菌属(glaciecola)在2类材料涂层表面生物量相当，只有k板表面出现较大变化，生物量较大。(3)从图10中可以看出，简纳西氏菌属(jannaschia)在2类材料涂层表面生物量有明显差异，在促进牡蛎生长涂层表面明显多于抑制牡蛎生长涂层表面。(4)从图11中可以看出，红球菌属(rhodococcus)在2类材料涂层表面生物量都相对比较少，且生物量相当，无特别明显差异。(5)从图12中可以看出，亚硫酸盐杆菌属(sulfitobacter)在2类材料涂层表面生物量都相对比较少，两者生物量之间存在差异，但是差异不是特别明显。当前第1页12