本发明属于天然产物领域，具体涉及一种生物碱类化合物及其制备方法及应用。
背景技术：
自1929年发现医用抗生素青霉素、1958年发现农用抗生素灭瘟素s以来，迄今全世界已发现4000余种抗生素，在人畜疾病防控及农业有害生物防治方面发挥了重要的作用，推动了人类文明和科学技术的进步。
但是，大量广谱抗生素的使用，加速了致病菌的进化，病原体尤其是细菌病原体的耐药性日趋增强，使现有药物的疗效下降。此外，多重耐药菌的种类也在增多。耐药性自革兰阴性杆菌发展到革兰阳性细菌，由院内感染发展到院外感染，细菌耐药问题是21世纪最严重的公共健康问题之一，耐药细菌和多药耐药细菌的不断出现与快速传播，使细菌感染的预防、治疗与控制面临着严峻的挑战。突出表现在耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌和非发酵糖细菌，其中尤以肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等的耐药最为严重，临床治疗困难。虽然学者进行了大量的研究工作，但在过去的30年内，只有噁唑烷酮类和环脂肽类两类抗革兰氏阳性菌药被批准上市，抗革兰氏阴性菌的药物更少，临床用药现状依然不容乐观。面临细菌耐药性不断升级、抗菌药物疗效降低、临床无药可用等棘手的问题，研发新型抗耐药菌药物的工作迫在眉睫。
从微生物次生代谢产物中寻找有活性的化合物作为先导化合物创制新药是世界药学工作者公认的有效途径之一,微生物资源为创新药物研究提供无穷的源泉。微生物丰富多样的次生代谢产物为化学药物新药研究与开发提供了大量极为珍贵的模式结构和药物前体小分子，是药物发现源头创新和持续创新的重要物质基础，对整个创新药物的研究具有决定性意义。
放线菌是微生物药物的主要来源，其中以链霉菌属及一些稀有放线菌属为主。但自70年代以后，从链霉菌中发现新化合物的几率就越来越少，重复率越来越高。疣孢菌、诺卡氏菌等这些目前获得的种类少的放线菌(俗称稀有放线菌)已被日益关注。稀有放线菌的次级代谢产物中蕴藏着大量结构新颖的活性化合物，提高了获得目标活性化合物的几率。
疣孢菌(verrucosispora)属于放线菌目小单孢菌科(micromonosporaceae)。1998年rheims等从沼泽淤泥中最早分离得到疣孢菌之后，科学家们陆陆续续从海洋泥样、红树林、海鞘以及海绵中分离到该属菌株。疣孢菌蕴藏着极其丰富的天然产物资源。正成为微生物药物的一个重要菌源。如2004年，从日本海289m深的沉积物中分离出属于小单孢菌科的verrucosisporamarisab18-032，该菌株能产生抗mrsa、vrsa活性的聚酮类化合物深海素(abyssomicinc)，该化合物具有新的抑菌作用靶点，对寻找新型高效抗生素具有积极意义。bull和stach通过对verrucosisporamarisab18-032的基因组分析，发现其至少包含了20个天然产物合成的基因簇，这与nett等的研究结论一起证明了疣孢菌不但可以合成抗菌的活性物质，而且可以合成更多的天然化合物。2008年，从挪威海250米深的沉积物中分离到的verrucosisporasp.mg-37，该菌株合成抗肿瘤的福安类化合物(proximicins)。2010年，dai等从南海3602米深的沉积物中分离出verrucosisporasediminisms426t，并从该菌株分离到8个环二肽(cyclo-dipetides)和两种诺卡菌胺雷士物(nocardamine-like)，其中有些具有抗细菌与真菌活性。2010年，shirai等从菌株verrucosisporagifhornensisym28-088中分离到了具有抗前列腺癌的两个新的二萜类化合物(gifhornennolonesa和b)。此外，从疣孢菌中还分离到抗肿瘤化合物thiochondrillinec和harrucomicinc等结构新颖、活性优良的化合物。从疣孢菌中筛选结构新颖或者新作用机制的抗菌药物以应对多药耐药菌具有现实可行性。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种具有抑菌活性的生物碱类化合物。
所述的生物碱类化合物，其结构如式(1)所示：
本发明的第二个目的是提供上述生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，所述的生物碱类化合物是从疣孢菌verrucosisporagifhornensisfim06-0025的发酵培养液中分离得到的。
优选，具体步骤如下：
将疣孢菌v.gifhornensisfim06-0025的发酵培养液分离出菌丝体和上清液，菌丝体用体积比1:1的甲醇/丙酮提取，提取液浓缩去除甲醇和丙酮，得到浸膏1，将浸膏1和上清液合并后用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后得到浸膏2，浸膏2经c18反相硅胶柱层析，用甲醇/水体积比为30:100、50:100、70:100为洗脱剂进行梯度洗脱，收集甲醇/水洗脱浓度为70:100的组分，得到组分a-1，组分a-1经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇从体积比9:1～1:1进行梯度洗脱，分部收集洗脱液，经tlc检测，展开剂为氯仿/甲醇体积比10:1，碘为显色剂，合并相同组分，收集tlc检测rf值为0.55的组分3，再经sephadexlh-20柱层析，以甲醇/乙腈1:1，v:v为洗脱剂，洗脱流份经tlc检测，展开剂为氯仿/甲醇体积比10:1，收集rf值为0.57的组分，获得单体化合物fw252。
所述的疣孢菌v.gifhornensisfim06-0025的发酵培养液是将疣孢菌v.gifhornensisfim06-0025接种到发酵培养基中，经发酵获得；
所述的发酵培养基每升含有可溶性淀粉20.0g，k2hpo40.5g，kno35.0g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，feso4·7h2o0.01g，caco31.0g，余量为海水，ph7.2～7.5。
所述的经发酵获得，其发酵条件为：26℃，240rpm条件下培养。
本发明的第三个目的是提供上述生物碱类化合物在制备抗菌药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种抗菌药物，其特征在于，含有上述生物碱类化合物作为活性成分。
所述的抗菌药物是抗革兰氏阴性菌幽门螺杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌以及革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和屎肠球菌的药物。
本发明的第五个目的是提供疣孢菌verrucosisporagifhornensisfim06-0025，保藏号为：cgmccno.15242
本发明的第六个目的是提供疣孢菌v.gifhornensisfim06-0025在制备上述生物碱类化合物中的应用。
本发明从疣孢菌v.gifhornensisfim06-0025分离得到了一个结构新颖的生物碱类化合物，其具有较好的抗菌活性，因此可以用于制备抗菌药物。
本发明的verrucosisporagifhornensisfim06-0025于2018年01月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：cgmccno.15242。
附图说明：
图1是菌株fim06-0025在营养琼脂培养基中的单菌落形态；
图2是菌株fim06-0025的扫描电镜图；
图3是化合物fw252的hresi-tof-ms谱；
图4是化合物fw252的ir谱；
图5是化合物fw252的1h-nmr谱；
图6是化合物fw252的1h-1hcosy谱；
图7是化合物fw252的hmbc谱；
图8是化合物fw252的13c-nmr谱；
图9是化合物fw252的hsqc谱；
图10是化合物fw252的noesy谱；
图11是化合物fw252的化学结构以及主要的1h-1hcosy和hmbc相关
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
本发明人从福建东海海绵中获得一个菌株，命名为：fim06-0025，其分类学特征如下：
1.1、菌株的理化性质
菌株fim06-0025在营养琼脂培养基中的单菌落形态(图1)。从菌株fim06-0025的电镜扫描图可见，基内菌丝体发育良好，分枝有隔，直径0.4μm，单个孢子着生于短孢子梗上，孢子有柄，表面有疣状突起(图2)。
无菌条件下，将菌株fim06-0025用接种环接种到isp1－isp7琼脂斜面培养基上，32℃培养2～5d，观察记录fim06-0025在不同培养基中的培养特征(表1)。
营养琼脂培培养基(g/l)：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，酵母膏2.0，氯化钠5.0，琼脂12.0，蒸馏水1000ml，灭菌前ph为7.2-7.5。
表1fim06-0025在不同培养基中的培养特征
注：+++表示生长良好；++表示生长一般；+表示生长差；-表示不生长；颜色与色值参照iscc-nbc标准。
isp1培养基(g/l)：胰胨0.5，酵母膏0.3，琼脂2，蒸馏水1l，灭菌前ph7.2～7.5。
isp2培养基(g/l)：酵母膏0.4，麦芽膏1，葡萄糖0.4，琼脂2，蒸馏水1l，灭菌前ph7.3。
isp3培养基(g/l)：燕麦粉2，琼脂2，微量元素1ml，琼脂2，蒸馏水1l，灭菌前ph7.4。
isp4培养基(g/l)：可溶性淀粉10.0，k2hpo41.0，mgso41.0，nacl1.0，(nh4)2so42.0，caco32.0，微量元素1ml，琼脂2，蒸馏水1l，灭菌前ph7.2.
isp5培养基(g/l)：l-天冬素1.0，k2hpo41.0，甘油10.0，琼脂20.0，微量元素1ml，琼脂2，蒸馏水1l，灭菌前ph7.2-7.4。
isp6培养基(g/l)：胨-铁-琼脂36.0，酵母膏1.0，琼脂2，蒸馏水1l，灭菌前ph7.2-7.4。蛋白胨酵母膏铁琼脂。
isp7培养基(g/l)：甘油1.5，l-酪氨酸0.05，l-天冬素0.1，k2hpo40.05，mgso40.05，nacl0.05，微量元素1ml/l，琼脂1.5，蒸馏水1l，灭菌前ph7.2-7.4。
微量元素溶液(g/l)：feso4·7h2o0.1，mncl·4h2o0.1，znso4·7h2o0.1，蒸馏水100ml。
以微生物在单一碳源条件下的生长速率来表征微生物对这种碳源的利用强度。选用isp9基础培养基进行测试。21种碳源，包括蜜二糖、棉籽糖、d-甘露糖、l-木糖、肌醇、水杨素、l-鼠李糖、卫矛醇、山梨醇、二硫苏糖醇、d-半乳糖、甜醇、七叶苷、赤藓醇、纤维二糖、阿东糖醇、松三糖、海藻糖、l-阿拉伯糖、d-葡萄糖和甲壳素。每种碳源添加0.8g/l，以不加碳源作为对照，每个处理3个重复。无菌条件下，将菌株fim06-0025用接种环接种到上述含有不同碳源的isp9基础培养基培养皿平板上，32℃倒置培养，不同培养时间记录结果并同空白比较，分析碳源利用的结果(表2)。
isp9基础培养基(g/l)：k2hpo45.65，kh2po42.38，(nh4)2so42.64，mgso4·7h2o1.0，琼脂12.0，碳源1.0，微量元素1ml，蒸馏水1000ml，ph7.5。微量元素配制：cuso4·5h2o0.64g，feso4·7h2o0.11g，znso4·7h2o0.15g，mncl2·4h2o0.79g，蒸馏水100ml。
表2菌株fim06-0025碳源利用情况
注：+表示可以完全利用；±表示可以部分利用；-表示完全不能利用。
1.2菌株16srrna鉴定
取培养至对数生长期的fim06-0025菌液5ml，8000r/min离心15min，倾去上清液，收集菌体。采用ctab/nacl法提取菌体基因组dna。步骤如下：菌体中加入1.35mlte溶液(ph8.0)，悬浮，加入0.3ml10％十二烷基硫酸钠(sds)和150μl100mg/ml溶菌酶和150μl100mg/ml蛋白酶k，混匀，60℃水浴1h，加0.25ml5mol/lnacl和0.2mlctab/nacl溶液，65℃水浴10min，以等体积的苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇各抽提3次，10000r/min离心10min，吸取上清液，加入0.6倍体积异丙醇，放置于-20℃沉淀dna，dna溶于50μlte中，-20℃保存备用。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组dna完整性。采用16srrna基因的通用引物27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(5'-ggttaccttgttacgactt-3')对提取的dna进行pcr扩增。将扩增后的dna产物送至上海生物工程有限公司进行测序，其16srrna序列如seqidno.1所示。用blast软件与ncbi的genbank数据库收录的16srrna序列进行比对分析，blast搜索同源序列。菌株fim06-0025与疣胞菌verrucosisporagifhornensisdsm44337t的16srrna基因序列的相似性为99％，综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，确定菌株fim06-0025为疣胞菌verrucosispora。将该菌株命名为：疣胞菌verrucosisporagifhornensisfim06-0025，其于2018年01月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：cgmccno.15242。
1.3菌株的发酵
取一铂环菌株verrucosisporagifhornensisfim06-0025高氏天冬素琼脂斜面培养物接入种子培养基中，26℃，240rpm条件下摇床培养培养2～3d，得到v.gifhornensisfim06-0025的种子培养液。将菌株fim06-0025的种子培养液以体积分数5～10％的接种量接种到发酵培养基中，26℃，240rpm条件下摇床培养培养4～5d，得到v.gifhornensisfim06-0025的发酵培养液。
高氏天冬素琼脂斜面培养基：可溶性淀粉20.0g，天冬素0.5g，海盐16.5g，nacl0.5g，kno31.0g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，caco31.0g，琼脂12.0g，海水1000ml，自然ph值，其制备方法是将各组分按其含量混合均匀，121℃高温灭菌30min，备用。
种子培养基的制备：可溶性淀粉15.0g，酵母粉5.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖5.0g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，(nh4)2so40.5g，caco31.0g，1l海水配制，其制备方法是将各组分按其含量混合均匀，灭菌前ph7.5。121℃高温灭菌30min，备用。
发酵培养基的制备：可溶性淀粉20.0g，k2hpo40.5g，kno35.0g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，feso4·7h2o0.01g，caco31.0g，海水1000ml，其制备方法是将各组分按其含量混合均匀，ph7.2～7.5。121℃高温灭菌30min，备用。
1.4化合物的制备
将上述海洋v.gifhornensisfim06-0025的发酵培养液(50l)在4500rpm条件下离心得到的菌丝体和上清夜,菌丝体用1.5～2.0倍体积的甲醇/丙酮(1：1，v:v)超声提取2次，超声温度低于40℃，超声时间30min。提取液在低于40℃减压浓缩去除甲醇和丙酮得到浸膏1(210g)，将浸膏1与上清液合并，合并液用1.5～2.0倍体积的乙酸乙酯萃取2次，乙酸乙酯萃取液低于40℃减压浓缩去除乙酸乙酯得到浸膏2(169g)。浸膏2经c18反相硅胶柱层析，用甲醇/水体积比为30:100、50:100、70:100为洗脱剂梯度洗脱，合并甲醇/水洗脱浓度为70:100的组分，得到组分a-1(110mg)。组分a-1用100～200目硅胶拌样，干法装柱后，用氯仿/甲醇从体积比9:1～1:1进行梯度洗脱，分部收集器收集洗脱液，经tlc检测，展开剂为氯仿/甲醇体积比10:1，碘为显色剂，合并相同组分，得到五种组分(rf值分别为0.27、0.39、0.55、0.67和0.75)，组分3(30mg、tlc检测rf值为0.55的组分)再经sephadexlh-20柱层析，以甲醇/乙腈1:1，v:v为洗脱剂，洗脱流份经tlc检测，展开剂为氯仿/甲醇体积比10:1，收集rf值为0.57的组分，获得单体化合物fw252(6.5mg)。
1.5、结构鉴定
对化合物fw252进行质谱、紫外光谱、红外光谱和核磁共振等数据测试，从而确定化合物的结构。
化合物fw252：淡粉色粉末。
1hnmr(图5)显示有1个甲基质子[δh1.70(d,j＝6.5hz,3h)]信号，2个亚甲基质子[δh3.94(dd,j＝12.0,3.5hz,1h))、3.81(dd,j＝12.0,3.0hz,1h)]信号，2个次甲基质子信号[δh4.27(m,1h)、5.38(m,1h)]，2个-oh的氢质子[δh(12.3，4.9)]信号以及4个苯基质子[δh7.95(dd,j＝8.5,2.0hz,1h)、7.12(ddd,j＝8.5,8.5,2.0hz,1h)、7.72(ddd,j＝8.5,8.0,1.0hz,1h)和7.16(dd,j＝8.0,1.0hz,1h)]信号。从4个苯基质子信号的耦合常数可以看出化合物中含有1个邻位取代的苯环，1h-1hcosy和hmbc波谱进一步验证了上述结论(图6、图7)。13c-nmr和dept135(dmso-d6,125mhz)(图8、图9)显示化合物含有11个碳信号，其中包括1个甲基(δc20.2),1个亚甲基(δc61.6)，6个次甲基(δc140.0、132.3、121.7、118.0、107.8、84.9和67.7)和3个季碳(δc170.5、161.9和107.8)。核磁数据表明化合物含有1个邻位取代的苯环以及1个四个碳的长链片段结构(ch3-c10-c8-c7)，在hmbc谱中8-h(δ3.90)、10-h(δ4.68)与9-c(δc164.4)酰胺碳的相关性可知片段ch3-c10-c8-c7与酰胺基团通过与n原子形成三元环结构进行连接，再则，通过2-h(δh7.60)与9-c(δ170.5)的酰胺碳的耦合关系可将上述结构片段同苯环基团相连接。综合以上分析，并结合hsqc(图10)和hmbc谱图，得到化合物fw252的全部碳信号和氢信号归属(表4)。最后依据不饱和度、分子量以及noesy谱(图11)确定了化合物fw252的化学结构如式(2)所示，化学命名为：(2-(hydroxymethyl)-3-(2-(hydroxymethyl)-3-methylaziridin-1-yl)(2-hydroxyphenyl)methanone。经scifinder和inspec等数据库检索，未发现有与其相同结构的化合物，因而确定fw252是一个新结构的生物碱类化合物。fw252的化学结构和主要1h-1hcosy和hmbc相关如图11。
表3化合物fw252的1hnmr(inmethanol-d4,400mhz)和13c-nmr(inmethanol-d4,100mhz)数据
1.6、抗菌活性测试
采用微量肉汤稀释法，以头孢噻肟钠为阳性对照品，测试化合物fw252的最小抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration,mic)。测试菌包括革兰氏阴性菌：幽门螺杆菌(h.pylori)atcc43504、肺炎克雷伯菌(k.pneumoniae)atcc4352、大肠杆菌(e.coli)atcc25922、铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)atcc27853和鲍曼不动杆菌(a.baumanniiin)atcc17978以及革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(s.aureus)atcc25923、白色念珠菌(c.albicans)atcc90028和屎肠球菌(e.faecium)atcc35667(表5)。
具体操作步骤如下：
1)mh肉汤培养基配制：称取mh肉汤培养基21.0g，加入到1l蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装于试管中，121℃高压灭菌15min,备用。
2)测试菌前期培养：无菌条件下，将测试菌接种到100mlmh肉汤培养基中，置于35℃培养箱培养12h备用。
3)贮存液制备：分别称取适量待测样品和阳性对照品，阳性对照品用1ml无菌水溶解，待测样品用1ml甲醇溶解。各自贮存液的初浓度应该大于1000μg/ml。
4)测试菌溶液的制备：无菌条件下，将上述培养好的测试菌用mh肉汤校正到0.5麦氏单位浊度标准后按1:20的比例进行稀释，此时菌液浓度约为5×106cfu/ml，备用。
5)贮存液稀释和接种测试菌：无菌操作，取无菌的96孔板一个。除第一孔加入160μlmh肉汤外，其余每孔均加入mh肉汤100μl，在第1孔加入待测样品原液40μl混匀，然后吸取100μl至第2孔，混匀后在吸取100μl至第3孔混匀，如此连续倍比稀释至倒数第3孔，并从倒数第3孔总吸取100μl弃去。倒数第2孔为不含药物的生长对照，最后1孔为未接种的对照。然后在每孔中加入上述制备好的测试菌接种物个10μl，使每孔最终的菌液浓度约为5×105cfu/ml。
6)孵育：将已接种测试菌的96孔板盖好盖子，置35℃生化培养箱中培育16-20h，记录结果。
7)mic终点判读：用肉眼在96孔板中所见能完全抑制细菌生长的为该样品对该种细菌的最低抑制浓度。
结果如表4所示，化合物fw252对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有广谱抑制活性(mic值为3.4-200μg·ml-1)，尤其对革兰氏阴性菌幽门螺杆菌和肺炎克雷伯氏菌以及革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌具有较强的抑制活性。
表4抑菌试验测定结果
序列表
<110>福建省微生物研究所
<120>一种具有多样抑菌活性的生物碱类化合物及其制备方法及应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1397
<212>dna
<213>疣孢菌fim06-0025(verrucosisporagifhornensisfim06-0025)
<400>1
tgcttacacatgcaagtcgagcggaaggcccttcggggtactcgagcggcgaacgggtga60
gtaacacgtgagcaacctgccctaggctttgggataaccctcggaaacgggggctaatac120
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