本发明涉及一种乳酸季鏻型生物相容离子液体及其制备方法和应用，尤其是在植物甾醇全细胞生物转化过程中的应用。
背景技术
雄甾-4-烯-3,17-二酮(ad)是重要的甾体药物中间体，可用于合成上百种甾体激素类药物。以自然界中丰富的植物甾醇为底物，通过生物转化法制备ad具有广阔的应用前景。然而，分枝杆菌降解植物甾醇侧链得到ad需经过11种功能酶系协同催化的16步反应历程，迄今为止只能在全细胞中完成。存在着两个主要问题：(1)甾醇底物的低水溶性；(2)疏水性产物ad在胞内对细胞活性的抑制甚至毒性，以及析出后对底物颗粒和细胞的包结。通常，基于溶剂工程策略构建非水/水两相生物转化体系或以非水溶剂作为共(助)溶剂，能够促进底物/产物溶解，提高过程转化效率。
随着人们对绿色过程开发的要求越来越迫切，一种新型的绿色溶剂——离子液体以其独特的理化性质逐渐进入人们的视野。离子液体(ionicliquid,il)是由阳离子和阴离子构成的在临界温度(一般为100℃)下呈液态的有机盐。目前常用的离子液体主要是由9类阳离子(烷基咪唑类、烷基吡啶类、季铵、季鏻、吡咯烷、哌啶、吗啉、胍类等)和28类阴离子(卤素类、六氟磷酸型、四氟硼酸型、硝酸型、磺酸型、羧酸型、亚胺型等)构成，主要用于有机合成和催化、萃取分离、电化学、功能材料等领域，将生物相容性差的离子液体直接用作生物催化反应介质会带来催化效率低、资源浪费、生态毒性等问题。因此，针对生物催化反应过程设计特定结构的离子液体是提高过程效率、实现绿色催化的途径之一。
在生物技术领域，已有学者致力于合成生物相容性较好的离子液体用于生物质的预处理和萃取分离等。yao等(angewandtechemieinternationaledition.2016,55:7934-7938)合成了peg功能化离子液体[peg800(mim)2][ntf2]2，并将其用于非均相液/液体系萃取蛋白质，对研究的多种蛋白质(细胞色素c、肌红蛋白、血红蛋白、溶菌酶和木瓜蛋白酶)，该功能化离子液体的单步萃取率都超过了95％(rscadvances.2017,7:11297-11303)。tzani等(journalofmolecularliquids.2016,224:366-376)合成了16种羟基铵羧酸盐质子型离子液体，评估了其生物可降解性和生物毒性，这些离子液体的5天生物降解量达到41～64％，并且对丰年虾a.salina的无节幼虫表现为无毒或低毒。hou等(plosone.2013,8:e59145)合成了一系列氨基酸胆碱型离子液体，并将其用于生物质的预处理，证实了这些天然可再生的氨基酸型离子液体对测试菌株表现为低毒性。
离子液体用于全细胞生物催化过程的历史可以追溯到2000年(biotechnologyandbioengineering.2000,69:227-233)，但是时至今日，大多数研究依然集中在从已有的商业化离子液体中筛选合适的离子液体(主要是咪唑类和吡咯烷类离子液体)(journalofchemicaltechnologyandbiotechnology.2016,91:2631-2637)，鲜有报道针对特定的生物转化过程设计合成新型生物相容性离子液体。针对商业化离子液体对甾醇溶解性差和对细胞生物相容性的不足(acssustainablechemistry&engineering.2017,5:10702-10709)，结合甾醇的疏水性和氢键酸性及全细胞作为催化剂这两大特点，考虑以生物相容性好、氢键碱性强的生物分子乳酸为阴离子供体，生物相容性和溶解性能均较好的季鏻盐为阳离子供体合成新型离子液体，从而提高植物甾醇全细胞生物转化过程效率。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种乳酸季鏻型生物相容离子液体及其制备方法和应用，尤其是在植物甾醇全细胞生物转化过程中的应用。
提供了一种由季鏻阳离子和乳酸根阴离子构成的生物相容性离子液体。
其阳离子结构式如下：
其阴离子结构如下：
其中r1,r2,r3,r4为含4～14个碳原子的烷基。
提供了所述离子液体的制备方法，包括以下步骤：
(a)四烷基溴化鏻([pa,b,c,d][br])通过强碱性阴离子交换层析柱得到四烷基氢氧化鏻([pa,b,c,d][oh])；
(b)用步骤(a)得到的[pa,b,c,d][oh]与等摩尔量的乳酸混合，在圆底烧瓶中搅拌反应至完全中和；
(c)将步骤(b)得到的溶液通过加热搅拌伴随空气吹扫直至恒重，以除去溶剂，得到离子液体。
所述的[pa,b,c,d][br]为溶解到乙醇溶剂中得到的浓度为10～30vol.％的乙醇溶液。交换柱为500×20mm的玻璃柱，填料为dowexmonosphere550aupw(oh)强碱性阴离子交换树脂，树脂的湿体积载量为1.1meqml-1。乙醇作为流动相，冲洗柱子1h后上样，流速为1mlmin-1。离子交换完成后用0.1mhno3+agno3溶液检测无沉淀，则表明br-被完全取代。需要指出的是，若所需的[pa,b,c,d][oh]可直接购买，则该阴离子交换过程即步骤(a)可省略。
所述的[pa,b,c,d][oh]的乙醇溶液浓度由0.1mhcl通过酸碱中和滴定法标定，乳酸水溶液的浓度由2mnaoh通过酸碱中和滴定法标定。然后在集热式恒温磁力搅拌器中进行酸碱中和反应，反应温度为40～50℃，反应时间为12～24h。继续升温至60～70℃，伴随空气吹扫，以除去水和乙醇。
该制备方法通过简单的酸碱中和反应即可完成，操作简便，收率高。所得的离子液体具有较弱的极性和极强的氢键碱性，因而对甾醇(羟基作为氢键供体)表现出优异的溶解性能，有利于其用于甾醇等具有氢键供体的生物活性物质的溶解和萃取过程。
该方法制备得到的离子液体具有良好的生物相容性，对微生物细胞的葡萄糖代谢活性影响较小，有利于其作为反应介质应用于全细胞催化转化过程。
该方法制备得到的生物相容离子液体可应用于构建合适的溶剂体系(作为水相共溶剂或两相体系的非水相)，以强化分枝杆菌催化的植物甾醇侧链降解过程，促进底物/产物溶解，缓解植物甾醇生物转化过程中的两大难题，提高过程转化效率。
所述的分枝杆菌为mycobacteriumsp.nrrlb-3683(菌种编号atcc29472)。所述植物甾醇为白色粉末，主要成分为β-谷甾醇(45％)、豆甾醇(26.2％)、菜油甾醇(23.5％)和菜籽甾醇(3.2％)，纯度≥95％。
附图说明
图1为合成的离子液体三己基十四烷基鏻乳酸盐([p6,6,6,14][lac])的1hnmr(500mhz,dmso-d6)谱图；
图2为合成的离子液体三己基十四烷基鏻乳酸盐([p6,6,6,14][lac])的13cnmr(500mhz,dmso-d6)谱图；
图3为合成的离子液体四丁基鏻乳酸盐([p4,4,4,4][lac])的1hnmr(500mhz,dmso-d6)谱图；
图4为合成的离子液体四丁基鏻乳酸盐([p4,4,4,4][lac])的13cnmr(500mhz,dmso-d6)谱图。
具体实施方式
以下的具体实施例对本发明展开了详细的描述，但本发明并不限制于以下实施例。
实施例1：三己基十四烷基鏻乳酸盐([p6,6,6,14][lac])离子液体的合成和表征
首先制备[p6,6,6,14][br]相对应的碱[p6,6,6,14][oh]。具体地，将[p6,6,6,14][br]溶解到乙醇中，得浓度为30vol.％的乙醇溶液。用dowexmonosphere550aupw(oh)强碱性阴离子交换树脂(湿体积载量1.1meqml-1)填充交换柱(500×20mm)，以乙醇为流动相冲洗柱子1h后上样，流速1mlmin-1。离子交换完成后用0.1mhno3+agno3溶液检测无沉淀则表明br-被完全取代，即得到相应碱[p6,6,6,14][oh]的乙醇溶液。然后利用中和法合成离子液体。具体地，先用2mhcl溶液标定(酸碱中和滴定法)[p6,6,6,14][oh]乙醇溶液的摩尔浓度，将其加入圆底烧瓶中，再向其中加入等摩尔量的乳酸。将此混合溶液在45℃下搅拌反应12h至完全中和，继续在70℃下搅拌，伴随空气吹扫直至恒重，以除去乙醇溶剂和水，即得到室温下呈透明液体的离子液体[p6,6,6,14][lac]。
用核磁氢谱1hnmr和碳谱13cnmr表征合成的[p6,6,6,14][lac]。1hnmrδ/ppm(500mhz,dmso-d6):0.84-0.90(12h,m；p-cn-ch3),1.05-1.07(3h,d；coo-co-ch3),1.15-1.41(48h,m；p-c-(ch2)n),2.15-2.21(8h,m；p-ch2),3.45-3.49(1h,q；coo-ch).13cnmrδ/ppm(500mhz,dmso-d6):13.23(s；p-c4),17.09-17.47(d；p-c1),21.61(s；coo-c3),22.62-22.65(d；p-c3),23.28-23.40(d；p-c2),66.95(s；coo-c2),176.30(s；coo-c1)。谱图如图1和2所示。分析表明合成的离子液体结构无误且具有较高的纯度。
实施例2：离子液体[p6,6,6,14][lac]的基础理化性质
在30℃下，用质量体积法测得离子液体的密度为0.92gcm-3；用ndj-8s旋转黏度计测得离子液体的黏度为249cp，离子液体饱和水溶液的黏度为1.0cp；用辛醇-水分配系数表征离子液体疏水性参数logp为1.4；用溶剂化显色探针reichardt染剂测得离子液体极性参数ent为0.43；用kamlet-taft溶剂化显色法测得离子液体氢键碱性参数β为1.12。当离子液体/水两相体系达到平衡状态时，离子液体在水中的溶解度为5.9wt.％，而水在离子液体中溶解度为15.9wt.％，可见此离子液体在水体系中含量大于5.9wt.％时才会与水形成两相体系。
实施例3：离子液体[p6,6,6,14][lac]对甾体化合物的溶解性能
为测定植物甾醇在离子液体中的溶解度，将过量的植物甾醇在超声波作用下充分溶解到离子液体中，然后在30℃震荡30min，离心后取出离子液体上清液并用甲醇稀释10,000倍，用硫磷铁显色法测定植物甾醇浓度，得到植物甾醇在离子液体中的溶解度为493gl-1。用相同的方法可测得植物甾醇在水饱和的离子液体中的溶解度为484gl-1。为测定ad在离子液体中溶解度，将过量的ad标准品在恒温混匀仪中40℃，1200rpm条件下振荡8h至ad充分溶解，在30℃继续保持30min，离心后取出离子液体上清液用色谱甲醇稀释100倍，有机滤膜过滤后用hplc测定ad浓度，得到ad在离子液体中的溶解度为2.02gl-1。用相同的方法可测得ad在水饱和的离子液体中的溶解度提高到33.1gl-1。据文献报道，ad在水中的溶解度仅为0.087gl-1，植物甾醇在水中的溶解度则低至0.011gl-1。结果表明，该离子液体对2种甾体化合物的溶解性能优越。
实施例4：离子液体[p6,6,6,14][lac]对甾体化合物的萃取能力
将20gl-1ad标准品溶解到100μl离子液体中，然后与1ml超纯水混合，在恒温混匀仪中30℃，1200rpm条件下振荡1h，静置12h至两相充分分层。取上相(离子液体相)用色谱甲醇稀释50倍和下相(水相)分别进行hplc分析，得到两相中ad浓度，从而计算出ad在两相间分配系数的对数logd为1.2。用相同的方法得到植物甾醇在离子液体/水两相间分配系数的对数logd为1.3。结果表明，该离子液体对2种甾体化合物的萃取能力很强。
实施例5：离子液体[p6,6,6,14][lac]的生物相容性
离子液体的生物相容性由葡萄糖代谢活性保留率(mar)来表征，即在离子液体存在下的分枝杆菌细胞mycobacteriumsp.nrrlb-3683对葡萄糖的消耗速率。向装有10mltris-hcl缓冲液(0.1m,ph7.5)的50ml锥形瓶中依次加入5vol.％离子液体、2gl-1葡萄糖及20gl-1分枝杆菌湿细胞，以不含离子液体的体系作为对照。在恒温振荡培养箱中30℃，200rpm培养4h，离心去除细胞后，上清液用dns显色法测定残余葡萄糖浓度，从而计算出单位时间的葡萄糖消耗速率mar为288mgl-1h-1，接近于对照样缓冲液体系中的mar(260mgl-1h-1)。结果表明，在5vol.％浓度下，该离子液体对细胞活性几乎没有不利影响。
实施例6：[p6,6,6,14][lac]-缓冲液体系中植物甾醇生物转化制备ad
取出预先培养并在-20℃冷冻储存的分枝杆菌mycobacteriumsp.nrrlb-3683静息细胞作为生物催化剂。为提高催化速率，在进行生物转化反应前，先将50gl-1湿细胞和2gl-1葡萄糖添加到ph7.5的tris-hcl缓冲液中，在30℃和200rpm条件下活化7h。向体系中添加3gl-1植物甾醇和0.1vol.％的离子液体，进行生物转化，以不添加离子液体的缓冲液体系作为对照。间隔2h取样测定ad浓度，计算出ad时空产率(转化速率)为72mgl-1h-1，高于对照缓冲液体系中的ad产率(54mgl-1h-1)。
实施例7：四丁基鏻乳酸盐([p4,4,4,4][lac])离子液体的合成和表征
由于原料四丁基氢氧化鏻([p4,4,4,4][oh])水溶液(～40wt.％)可直接购买，因此省却阴离子交换步骤，直接利用中和法合成离子液体。具体地，先用2mhcl溶液标定(酸碱中和滴定法)[p4,4,4,4][oh]水溶液的摩尔浓度，将其加入圆底烧瓶中，再向其中加入等摩尔量的乳酸。将此混合溶液在45℃下搅拌反应12h至完全中和，继续在70℃下搅拌，伴随空气吹扫直至恒重，以除去水，即得到室温下呈透明液体的离子液体[p4,4,4,4][lac]。
用核磁氢谱1hnmr和碳谱13cnmr表征合成的[p4,4,4,4][lac]。1hnmrδ/ppm(500mhz,dmso-d6):0.90-0.93(12h,t；p-c3-ch3),1.04-1.05(3h,d；coo-co-ch3),1.37-1.50(16h,m；p-c-(ch2)2),2.18-2.24(8h,m；p-ch2),3.40-3.44(1h,q；coo-ch),4.51(1h,s；coo-c-oh).13cnmrδ/ppm(500mhz,dmso-d6):13.23(s；p-c4),17.09-17.47(d；p-c1),21.61(s；coo-c3),22.65-22.65(d；p-c3),23.28-23.40(d；p-c2),66.95(s；coo-c2),176.30(s；coo-c1)。谱图如图3和4所示。分析表明合成的离子液体结构无误且具有较高的纯度。
实施例8：离子液体[p4,4,4,4][lac]的基础理化性质
在30℃下，用质量体积法测得离子液体的密度为0.96gcm-3；用ndj-8s旋转黏度计测得离子液体的黏度为283cp，10vol.％的离子液体水溶液的黏度为1.6cp；用溶剂化显色探针reichardt染剂测得离子液体极性参数ent为0.43；用kamlet-taft溶剂化显色法测得离子液体氢键碱性参数β为1.11；用辛醇-水分配系数表征离子液体疏水性参数logp为-0.6，该离子液体呈现很强的亲水性，可与水大量互溶。
实施例9：离子液体[p4,4,4,4][lac]对甾体化合物的溶解性能
为测定植物甾醇在离子液体中的溶解度，将过量的植物甾醇在超声波作用下充分溶解到离子液体中，然后在30℃震荡30min，离心后取出离子液体上清液并用甲醇稀释1000倍，用硫磷铁显色法测定植物甾醇浓度，得到植物甾醇在离子液体中的溶解度为40gl-1。用相同的方法可测得植物甾醇在10vol.％离子液体水溶液中的溶解度为0.69gl-1。为测定ad在离子液体中溶解度，将过量的ad标准品在恒温混匀仪中40℃，1200rpm条件下振荡8h至ad充分溶解，在30℃继续保持30min，离心后取出上清液用色谱甲醇稀释100倍，有机滤膜过滤后用hplc测定ad浓度，得到ad在离子液体中的溶解度为32gl-1。用相同的方法可测得ad在10vol.％离子液体水溶液中的溶解度为0.27gl-1。据文献报道，ad在水中的溶解度仅为0.087gl-1，植物甾醇在水中的溶解度则低至0.011gl-1。结果表明，该离子液体对2种甾体化合物的促溶性能优越。
实施例10：离子液体[p4,4,4,4][lac]的生物相容性
离子液体的生物相容性由葡萄糖代谢活性保留率(mar)来表征，即在离子液体存在下的分枝杆菌细胞mycobacteriumsp.nrrlb-3683对葡萄糖的消耗速率。向装有10mltris-hcl缓冲液(0.1m,ph7.5)的50ml锥形瓶中依次加入5vol.％离子液体、2gl-1葡萄糖及20gl-1分枝杆菌湿细胞，以不含离子液体的体系作为对照。在恒温振荡培养箱中30℃，200rpm培养4h，离心去除细胞后，上清液用dns显色法测定残余葡萄糖浓度，从而计算出单位时间的葡萄糖消耗速率mar为84mgl-1h-1，明显低于对照样缓冲液体系中的mar(260mgl-1h-1)。结果表明，在5vol.％浓度下，该离子液体对细胞活性有一定影响。
实施例11：[p4,4,4,4][lac]-缓冲液体系中植物甾醇生物转化制备ad
取出预先培养并在-20℃冷冻储存的分枝杆菌mycobacteriumsp.nrrlb-3683静息细胞作为生物催化剂。为提高催化速率，在进行生物转化反应前，先将50gl-1湿细胞和2gl-1葡萄糖添加到ph7.5的tris-hcl缓冲液中，在30℃和200rpm条件下活化7h。向体系中添加3gl-1植物甾醇和0.2vol.％的离子液体作为共溶剂，进行生物转化，以不添加离子液体的缓冲液体系作为对照。间隔2h取样测定ad浓度，计算出ad时空产率(转化速率)为70mgl-1h-1，高于对照缓冲液体系中的ad产率(54mgl-1h-1)。