通用隔断超快扩增铜、钙切割型功能核酸可视化检测方法与流程

本发明涉及生物传感器技术领域，具体地说，涉及一种通用隔断超快扩增的铜、钙切割型功能核酸可视化检测方法。

背景技术

铜是一种过渡元素，化学符号cu，原子序数29，原子量是63.546，属第ib族。纯铜是柔软的金属，表面刚切开时为红橙色带金属光泽，单质呈紫红色。延展性好，导热性和导电性高，正常人体内铜的量为100-200毫克，在人体中铜离子主要以作为许多酶和蛋白的催化辅助因子或结构组成，广泛参与体内许多重要的新陈代谢过程，影响着人体血液的生成、结缔组织的形成，中枢神经系统，胆固醇和葡萄糖的代谢，心脏功能和免疫系统等，人体仅仅需要微量的铜就可以维持正常的生命活动。但是，铜缺乏或铜过量都会对健康产生不利的影响。铜缺乏一般伴随着其他营养元素的缺乏或者其生物拮抗物质的摄取过量，影响细胞内许多酶的正常功能，进而影响细胞的新陈代谢过程。铜过量通常是由于遗传性疾病或者由于环境重金属污染，误食了大量含铜的食物或吸入了含铜量高的气体所造成。铜(cu)及其化合物在环境中所造成的污染主要由于铜锌矿的开采和冶炼、金属加工、机械制造、钢铁生产等产生，其中，冶炼排放的烟尘是大气铜污染的主要来源。

钙是一种金属元素，符号ca，原子序数20，原子量40.078，属第iia族，常温下呈银白色晶体。地壳中钙含量为4.15％，占第五位。主要的含钙矿物有石灰石caco3、白云石caco3·mgco3、石膏caso4·2h2o、萤石caf2、磷灰石ca5(po4)3f等。蛋壳、珍珠、珊瑚、一些动物的壳体和土壤中都含有钙。海水中氯化钙占0.15％。钙可用于合金的脱氧剂、油类的脱水剂、冶金的还原剂、铁和铁合金的脱硫与脱碳剂以及电子管中的吸气剂等。它的化合物在工业上、建筑工程上和医药上用途很大。同时，钙是生物体必需的元素。对人体而言，健康成人体内钙总量约为1-000-1300克，约占体重的1.5％-2.0％。其中99％的钙以骨盐形式存在于骨骼和牙齿中，其余分布在软组织中，细胞外液中的钙仅占总钙量的0.1％。无论肌肉、神经、体液和骨骼中，都有用ca²⁺结合的蛋白质。钙是人类骨、齿的主要无机成分，也是神经传递、肌肉收缩、血液凝结、激素释放和乳汁分泌等所必需的元素。钙参与新陈代谢，每天必须补充钙；人体中钙含量不足或过剩都会影响生长发育和健康。

鉴于铜离子和钙离子在生物体内的重要作用，以及其缺乏或过量会对环境及人体健康会产生巨大的危害，因此，对其进行简单快速、准确的检测就显得尤为重要。

常见的铜离子的检测方法主要有原子光谱法，包括原子吸收光谱、电感耦合等离子体发射光谱法和焚光光谱法，可见分光光度法，流动注射化学发光法和微分电位溶出法等，但是这些检测方法都需要昂贵的仪器和经过专业培训的操作人员，样品前处理也比较繁琐，不具有普遍适用性。水中钙离子的检测方法主要有滴定分析法以及原子光度法，此方法一般需要专业的技术人员将样品采集到实验室进行分析，并且存在着与铜离子检测相同的不足之处。因此，研究出简单快速、成本低廉、可准确定量的检测方法十分必要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种切割型快速检测铜、钙离子的系统。

本发明的另一目的是提供一种通用隔断超快扩增的铜、钙切割型功能核酸可视化检测方法。

为了实现本发明目的，发明人根据铜离子和钙离子的特异性核酶，设计通用隔断引物对其进行超快聚合酶链式反应(superpolymerasechainreaction,spcr)，结合富g序列在k⁺存在条件下形成具有类过氧化物酶活性的g四链体，构建了一种新型的基于隔断引物的铜离子、钙离子切割型功能核酸比色传感器。

第一方面，本发明提供一种快速检测铜、钙离子的系统，包括：(1)切割体系，(2)spcr扩增体系，(3)hcr体系，(4)包含abts显色液的检测体系。

所述检测体系用于对待测样品依次经由所述切割体系、spcr扩增体系和hcr体系进行反应后所得产物进行显色检测；

其中，所述切割体系包括底物链i和酶链i以及底物链ii和酶链ii：

底物链i：5′-agcttctttctaatacgg-cttacc-3′

酶链i：5′-ggtaagcctgggcctctttctttttaagaaagaac-3′

其中，-表示铜离子切割位点；

底物链ii：5′-gtcacgagtcactatra-ggaagatggcgaaa-3′

酶链ii：5′-tttcgccatcttctctcagcgagacgaaatagtgactcgtgac-3′

其中，ra表示核糖核酸；-表示钙离子切割位点；

所述spcr扩增体系包括：正向隔断引物i、反向引物i、正向隔断引物ii、反向引物ii、模板：

正向隔断引物i：5′-agtctaggattcggcgtcccttaa-隔断物-ttaagggacgccgaatcctagacttcatcgcaccgtcaaaggaacc-3′

反向引物i：5′-cttaccttggggggggggtt-3′

正向隔断引物ii：5′-agacgaagcactggttgaaactcc-隔断物-ggagtttcaaccagtgcttcgtcttcatcgcaccgtcaaaggaacc-3′

反向引物ii：5′-ggaagatggcgaaattgggg-3′

模板：5′-tcatcgcaccgtcaaaggaacctcagtatcagtgctatacgtcgatcagtaaaccccccccccaaggtaagccccaatttcgccatcttcc-3′；

所述hcr体系包括4条探针：

探针1：5′-agggcgggtgggttaagggacgccgaatcctagactcaaagtagtctaggattcggcgtcgggt-3′

探针2：5′-gggtagtctaggattcggcgtcccttaagacgccgaatcctagactactttgagggcgggtggg-3′

探针3：5′-agggcgggtgggtggagtttcaaccagtgcttcgtctccccagacgaagcactggttgatgggt-3′

探针4：5′-tgggtagacgaagcactggttgaaactcctcaaccagtgcttcgtctggggtgggtagggcggg-3′。

其中，所述正向隔断引物中的隔断物为聚六乙二醇。其它能够阻止pcr延伸的隔断结构也可用于本发明。

所述dna聚合酶为extaqdna聚合酶，所述缓冲液为10×extaqbuffer，二者与所述dntp均购自赛默飞科技(thermoscientificlifetechnologies)。

本发明所述的检测体系包括：酶活缓冲液，氯高铁血红素溶液。

其中，所述酶活缓冲液为：100mmtris、120mmnacl、10mmmgcl2、100mmkcl，ph8.4。

所述氯高铁血红素溶液为20mm的氯高铁血红素原液与上述酶活缓冲液按照2μl：1ml的比例混合后的氯高铁血红素稀释溶液。

本发明还提供前述系统在检测铜、钙离子方面中的应用，所述检测可表现为定性检测或定量检测。

第二方面，本发明提供了一种基于前述系统的通用隔断超快扩增铜、钙切割型功能核酸可视化定性检测方法，包括如下步骤：

s1、向所述切割体系中加入待测样品，进行切割反应；

s2、将s1所得切割产物加入所述spcr扩增体系中进行超快聚合酶链式反应，得spcr产物；

s3、将所述spcr产物加入所述hcr体系中进行hcr反应，得hcr产物；

s4、利用所述检测体系对所述hcr产物进行检测。

s1具体如下：将底物链与酶链按等摩尔比例混合，用缓冲液稀释至浓度1μm-2μm，85℃-95℃加热15min，然后降温至25-37℃，得到核酶液；向35μl所述核酶液中加入待测样品溶液，形成40μl体系，于36-38℃孵育4-6min，然后加入4-6μl终止液，得到切割产物。

进一步地，所述检测体系包括酶活缓冲液和氯高铁血红素稀释溶液，将酶活缓冲液、氯高铁血红素稀释溶液和hcr产物按体积比为8:1:1混匀(总体积为100μl)，在35-38℃条件下反应20-40min，加入与前述混合物等体积的abts显色液，混匀，35-38℃避光孵育，肉眼进行监测。

第三方面，本发明提供了一种基于前述系统的通用隔断超快扩增铜、钙切割型功能核酸可视化定量检测方法，包括如下步骤：

si、制作标准曲线：

利用已知浓度的铜、钙离子溶液，构建具有不同铜、钙离子浓度的切割体系，spcr扩增、hcr反应与检测步骤与前述定性检测的步骤相同；

以铜、钙离子浓度为横坐标，以od415值为纵坐标，绘制标准曲线；

sii、按照前述定性检测方法对待测样品进行检测，将测得的od415值代入标准曲线，计算得到待测样品中铜、钙离子的含量，实现对铜、钙离子的定量检测。

本发明提供一种通用隔断超快扩增的铜、钙切割型功能核酸可视化检测方法，具体如下：

a)设计铜离子特异性核酶，包括底物链i和酶链i，将底物链i与酶链i进行杂交形成具有特异性铜离子切割活性的核酶i，当铜离子存在的条件下发生切割反应，切割下来的核酸片段作为反向引物i(即目标引发分子)，与正向隔断引物i一起对模板进行pcr扩增反应，所得pcr产物i的一端带有一段单链核酸序列；所述pcr产物i在k⁺存在条件下，形成g四链体，催化h2o2和abts显色，进而完成对铜离子的快速可视化检测；或者

通过pcr产物i促发hcr反应，使得hcr产物i在k⁺存在条件下形成g四链体，催化h2o2和abts显色，进而完成对铜离子的快速可视化检测；

所述底物链i和酶链i的碱基序列如下：

底物链i：5′-agcttctttctaatacgg-cttacc-3′

酶链i：5′-ggtaagcctgggcctctttctttttaagaaagaac-3′

其中，-表示铜离子切割位点；

所述正向隔断引物i的5′端具有发夹结构，两段反向互补碱基序列之间至少设有一阻断物，所述阻断物可阻断pcr延伸；

b)设计钙离子特异性核酶，包括底物链ii和酶链ii，将底物链ii与酶链ii进行杂交形成具有特异性钙离子切割活性的核酶ii，当钙离子存在的条件下发生切割反应，切割下来的核酸片段作为反向引物ii(即目标引发分子)，与正向隔断引物ii一起对模板进行pcr扩增反应，所得pcr产物ii的一端带有一段单链核酸序列；所述pcr产物ii在k⁺存在条件下，形成g四链体，催化h2o2和abts显色，进而完成对钙离子的快速可视化检测；或者

通过pcr产物ii促发hcr反应，使得hcr产物ii在k⁺存在条件下形成g四链体，催化h2o2和abts显色，进而完成对钙离子的快速可视化检测；

所述底物链ii和酶链ii的碱基序列如下：

底物链ii：5′-gtcacgagtcactatra-ggaagatggcgaaa-3′

酶链ii：5′-tttcgccatcttctctcagcgagacgaaatagtgactcgtgac-3′

其中，ra表示核糖核酸；-表示钙离子切割位点；

所述正向隔断引物ii的5′端具有发夹结构，两段反向互补碱基序列之间至少设有一阻断物，所述阻断物可阻断pcr延伸；

其中，步骤a)和步骤b)中涉及的切割反应可以在各自独立的体系中进行，也可以在同一体系中进行；步骤a)和步骤b)中涉及的pcr扩增反应可以在各自独立的体系中进行，也可以在同一体系中进行；步骤a)和步骤b)中涉及的显色反应可以在各自独立的体系中进行，也可以在同一体系中进行；步骤a)和步骤b)中涉及的hcr反应可以在各自独立的体系中进行，也可以在同一体系中进行。

本发明中，显色液可用tmb替代。

优选地，所述正向隔断引物i和/或正向隔断引物ii的发夹结构上具有富g碱基序列，或者具有打开hcr发卡结构的互补序列。当所述正向隔断引物的发夹结构上设计有富g碱基序列时，则无需借助hcr反应，即可实现对铜离子的快速可视化检测。

前述的方法，对于铜离子检测，hcr的反应体系中至少含有一条带发夹结构的单链核酸探针，所述发夹结构的碱基组成与所述正向隔断引物i发夹结构的碱基序列基本相同，使得所述pcr产物i能够促发hcr反应。

对于钙离子检测，hcr的反应体系中至少含有一条带发夹结构的单链核酸探针，所述发夹结构的碱基组成与所述正向隔断引物ii发夹结构的碱基序列基本相同，使得所述pcr产物ii能够促发hcr反应。

优选地，对于铜离子检测，所述底物链i的3′端添加有一段可增加所述反向引物i与模板结合tm值的碱基序列，使得pcr退火温度控制在50-60℃。优选所添加的序列为ttggggggtt。

对于钙离子检测，所述底物链ii的3′端添加有一段可增加所述反向引物ii与模板结合tm值的碱基序列，使得pcr退火温度控制在50-60℃。优选所添加的序列为ttgggg。

优选地，所述阻断物为聚六乙二醇。

前述的方法，铜离子检测中所用的底物链i、酶链i、正向隔断引物i、反向引物i、模板和2条探针的碱基序列如下：

底物链i：5′-agcttctttctaatacgg-cttaccttggggggtt-3′

酶链i：5′-aaaaaaaaggtaagcctgggcctctttctttttaagaaagaac-3′

正向隔断引物i：5′-agtctaggattcggcgtcccttaa-聚六乙二醇-ttaagggacgccgaatcctagacttcatcgcaccgtcaaaggaacc-3′

反向引物i：5′-cttaccttggggggggggtt-3′

模板：5′-tcatcgcaccgtcaaaggaacctcagtatcagtgctatacgtcgatcagtaaaccccccccccaaggtaagccccaatttcgccatcttcc-3′

探针1：5′-agggcgggtgggttaagggacgccgaatcctagactcaaagtagtctaggattcggcgtcgggt-3′

探针2：5′-gggtagtctaggattcggcgtcccttaagacgccgaatcctagactactttgagggcgggtggg-3′

其中，-表示铜离子切割位点；酶链下划线处碱基是为了区分底物链与酶链长度。

钙离子检测中所用的底物链ii、酶链ii、正向隔断引物ii、反向引物ii、模板和2条探针的碱基序列如下：

底物链ii：5′-gtcacgagtcactatra-ggaagatggcgaaattgggg-3′

酶链ii：5′-tttcgccatcttctctcagcgagacgaaatagtgactcgtgac-3′

正向隔断引物ii：5′-agacgaagcactggttgaaactcc-聚六乙二醇-ggagtttcaaccagtgcttcgtcttcatcgcaccgtcaaaggaacc-3′

反向引物ii：5′-ggaagatggcgaaattgggg-3′

模板：5′-tcatcgcaccgtcaaaggaacctcagtatcagtgctatacgtcgatcagtaaaccccccccccaaggtaagccccaatttcgccatcttcc-3′

探针3：5′-agggcgggtgggtggagtttcaaccagtgcttcgtctccccagacgaagcactggttgatgggt-3′

探针4：5′-tgggtagacgaagcactggttgaaactcctcaaccagtgcttcgtctggggtgggtagggcggg-3′

其中，ra表示核糖核酸；-表示钙离子切割位点。

本发明还提供与上述方法配套的检测试剂盒，所述试剂盒至少包括以下成分：底物链i和ii、酶链i和ii、正向隔断引物i和ii、模板、探针1、探针2、探针3和探针4等。

本发明试剂盒的检测分析原理：首先将底物链与酶链进行杂交形成具有特异性金属离子切割活性的核酶，当金属离子存在的条件下发生切割反应，切割下来的核酸片段可以与模板结合进行pcr延伸，由于引物的隔断作用阻碍了聚合酶的延伸，使得pcr产物是带有促发hcr的特定序列，hcr产物在适宜的缓冲条件下(缓冲液中含有k⁺)形成g四链体，催化h2o2和abts显色，进而完成对金属离子的快速可视化检测。

具体检测方法如下：

①单独检测铜离子：

a1)核酶i的构建：将底物链i与酶链i按等摩尔比例混合，用缓冲液i稀释至浓度1μm-2μm，85-95℃加热15min，然后缓慢降至25-37℃(大约耗时45min)，即得核酶液i；

a2)切割反应：向35μl上述核酶液i中加入待测样品溶液，形成40μl体系，于37℃孵育4-6min，然后加入4-6μl终止液，得到切割产物i；

a3)超速pcr反应：配制由正向隔断引物i、切割产物i、模板、dna聚合酶、dntp、反应缓冲液和ddh2o组成的pcr反应体系，设置如下反应程序：90-95℃2s，55-60℃3s，30-40个循环，进行pcr反应，得到pcr产物i；

a4)hcr反应：构建由探针1、探针2、pcr产物i和自组装缓冲液组成的hcr反应体系，于37℃反应30-60min，得到hcr产物i；

a5)显色反应：将80μl酶活缓冲液、10μl氯高铁血红素溶液与10μlhcr产物i混合，于37℃反应30min，加入100μlabts显色液，混匀，37℃避光孵育5-10min，根据加入显色液前后溶液颜色的变化来判断待测样品中是否含有铜离子以及铜离子浓度的高低；可通过肉眼直接观察溶液颜色的变化，或利用酶标仪测定溶液的od值变化。或者，

②单独检测钙离子：

b1)核酶ii的构建：将底物链ii与酶链ii按等摩尔比例混合，用缓冲液ii稀释至浓度1μm-2μm，85-95℃加热15min，然后缓慢降至25-37℃(大约耗时45min)，即得核酶液ii；

b2)切割反应：向35μl上述核酶液ii中加入待测样品溶液，形成40μl体系，于37℃孵育4-6min，然后加入4-6μl终止液，得到切割产物ii；

b3)超速pcr反应：配制由正向隔断引物ii、切割产物ii、模板、dna聚合酶、dntp、反应缓冲液和ddh2o组成的pcr反应体系，设置如下反应程序：90-95℃2s，55-60℃3s，30-40个循环，进行pcr反应，得到pcr产物ii；

b4)hcr反应：构建由探针1、探针2、pcr产物ii和自组装缓冲液组成的hcr反应体系，于37℃反应30-60min，得到hcr产物ii；

b5)显色反应：将80μl酶活缓冲液、10μl氯高铁血红素溶液与10μlhcr产物ii混合，于37℃反应30min，加入100μlabts显色液，混匀，37℃避光孵育5-10min，根据加入显色液前后溶液颜色的变化来判断待测样品中是否含有钙离子以及钙离子浓度的高低；可通过肉眼直接观察溶液颜色的变化，或利用酶标仪测定溶液的od值变化。或者，

③铜离子和钙离子双重检测：

s1)核酶i及核酶ii的构建：将底物链i与酶链i按等摩尔比例混合，用缓冲液i稀释至浓度1μm-2μm；将底物链ii与酶链ii按等摩尔比例混合，用缓冲液ii稀释至浓度1μm-2μm，85-95℃加热15min，然后缓慢降至25-37℃(大约耗时45min)，即得核酶液；

s2)切割反应：向35μl上述核酶液中加入待测样品溶液，形成40μl体系，于37℃孵育4-6min，然后加入4-6μl终止液，得到切割产物；

s3)双重超速pcr反应：配制由正向隔断引物i、正向隔断引物ii、切割产物、模板、dna聚合酶、dntp、反应缓冲液和ddh2o组成的pcr反应体系，设置如下反应程序：90-95℃2s，55-60℃3s，30-40个循环，进行pcr反应，得到pcr产物；

s4)hcr反应：构建由探针1、探针2、探针3、探针4、pcr产物和自组装缓冲液组成的hcr反应体系，于37℃反应30-60min，得到hcr产物；

s5)显色反应：将80μl酶活缓冲液、10μl氯高铁血红素溶液与10μlhcr产物混合，于37℃反应30min，加入100μlabts显色液，混匀，37℃避光孵育5-10min，根据加入显色液前后溶液颜色的变化来判断待测样品中是否含有铜离子和钙离子；可通过肉眼直接观察溶液颜色的变化，或利用酶标仪测定溶液的od值变化。

其中，核酶构建中所用缓冲液i的配方为：250mmhepes缓冲液，ph＝7.0，2.5mnacl,500mm抗坏血酸和2.5mkcl。

缓冲液ii的配方为：50mmmes,ph6.0，25mmlicl。

切割反应中所用终止液的配方为：0.2medta，2mnacl,0.5mtris。

hcr反应中所用自组装缓冲液的配方为：8mmna2hpo4,2.5mmnah2po4,0.15mnacl,2mmmgcl2,ph7.4。

显色反应中所用酶活缓冲液的配方为：100mmtris、120mmnacl、10mmmgcl2、100mmkcl，ph8.4。

所述氯高铁血红素溶液的配制方法为：用dmso配制浓度为20mm的氯高铁血红素原液，将2μl氯高铁血红素原液与1ml所述酶活缓冲液混合，即得。

优选地，pcr反应体系如下：

单独检测铜离子：

单独检测钙离子：

铜离子和钙离子双重检测：

hcr反应体系的构建方法如下：

①单独检测铜离子：将探针1、探针2分别用水溶解至100μm，于90-95℃加热5min，然后缓慢降至室温备用；将pcr产物i加入终浓度为2μm-3um的探针1和探针2的混合液中，并加入自组装缓冲液至总体积50μl。

②单独检测钙离子：将探针3、探针4分别用水溶解至100μm，于90-95℃加热5min，然后缓慢降至室温备用；将pcr产物ii加入终浓度为2μm-3μm的探针3和探针4的混合液中，并加入自组装缓冲液至总体积50μl。

③铜离子和钙离子双重检测：将探针1、探针2、探针3和探针4分别用水溶解至100μm，于90-95℃加热5min，然后缓慢降至室温备用；将pcr产物加入终浓度为2μm-3μm的探针1、探针2、探针3和探针4的混合液中，并加入自组装缓冲液至总体积50μl。

配制一系列浓度的铜离子标准溶液，按照上述方法进行检测，并利用酶标仪测定溶液od415值来判断显色情况，并根据溶液颜色变化绘制显色的标准曲线：y＝0.0088x+0.011，r²＝0.9993，从而可实现对铜离子的定量检测。

本方法的铜离子检测限是10-100nm。

配制一系列浓度的钙离子标准溶液，按照上述方法进行检测，并利用酶标仪测定溶液od415值来判断显色情况，并根据溶液颜色变化绘制显色的标准曲线：y＝0.0061x+0.0385，r²＝0.9948，从而可实现对钙离子的定量检测。

本方法的钙离子检测限是10-100nm。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明通过建立一种隔断快速扩增铜离子、钙离子切割型功能核酸比色传感器，用于铜离子、钙离子的快速可视化检测。根据金属离子的特异性核酶，设计隔断引物对其进行超快聚合酶链式反应，结合富g序列在k⁺存在条件下形成具有类过氧化物酶活性的g四链体，构建了一种新型的基于通用隔断引物的金属离子切割型功能核酸比色传感器，并提供了一种快速、可视的铜离子、钙离子双重检测新方法。使样品的检测时间大大缩短，检出限达nm级，而且本发明成功解决了pcr产物的可视化问题，对解决现场实时快速检测具有重要的现实意义。

(一)本方法首次构建了隔断引物，对模板进行超快扩增，将耗时3小时左右的传统pcr过程缩减到10分钟，显著减少了pcr反应的用时。

(二)引物的隔断作用阻碍了聚合酶的延伸，获得单链核酸序列。可以促发hcr反应，使得产物在适宜的条件下(缓冲液中含有k⁺)形成具有类过氧化物酶活性的g四链体。

(三)pcr产物或hcr产物与abts发生颜色变化，解决了传统pcr产物难于可视化检测的难题。

(四)本方法可实现铜离子、钙离子的大批量、快速检测。

附图说明

图1为本发明实施例1中铜离子核酶制备并切割验证的结果；其中，泳道1：核酶-cu；泳道2-4：切割体系。

图2为本发明实施例1中钙离子核酶制备并切割验证的结果；其中，泳道1：核酶-ca；泳道2-4：切割体系。

图3为本发明实施例1中超速pcr仪的外观结构。

图4为本发明实施例1中超速pcr扩增产物的胶图；其中，泳道1：dnamarker2000；泳道2：铜离子超速pcr产物；泳道3：钙离子超速pcr产物；泳道4：双重超速pcr产物。

图5为本发明实施例1中pcr产物自组装的阵列排列顺序；其中，1为2μmhairpin1和2μmhairpin2；2为2μmhairpin3和2μmhairpin4；3为2μmhairpin1，2μmhairpin2，2μmhairpin3和2μmhairpin4；4为阴性对照水。

图6为本发明实施例1中根据不同浓度铜离子及溶液颜色变化绘制显色的标准曲线。

图7为本发明实施例1中根据不同浓度钙离子及溶液颜色变化绘制显色的标准曲线。

图8-图10为本发明实施例2中检测方法的特异性考察结果。

图11为本发明实施例4中hcr反应时间的优化结果；其中，m：dnamarker2000；1：2μmhairpin1；2：2μmhairpin2；3：2μmhairpin1+2μmhairpin2+pcr产物10min；4：2μmhairpin1+2μmhairpin2+pcr产物20min；5：2μmhairpin1+2μmhairpin2+pcr产物30min；6：2μmhairpin1+2μmhairpin2+pcr产物40min；7：2μmhairpin1+2μmhairpin2+pcr产物50min。

图12为本发明实施例4中hcr反应时间优化实验结果；其中，m：dnamarker2000；1：hairpin3，2：hairpin4，3-6:hairpin3+hairpin4+pcr产物分别反应15min，30min，45min，1h。

图13为本发明实施例5中hcr反应中发夹探针序列的优化结果；其中，1-4对应于组3，1：hairpin5；2：hairpin6；3-4：hairpin5+hairpin6+促发子；5-8对应于组2，1：hairpin3；2：hairpin4；7-8：hairpin3+hairpin4+促发子；9-12对应于组1，1：hairpin1；2：hairpin2；11-12：hairpin1+hairpin2+促发子。

图14为本发明实施例5中发夹探针序列优化实验结果；其中，m：dnamarker2000；1-4是组3，1：hairpin5′；2：hairpin6′；3-4：hairpin5′+hairpin6′+促发子；5-8是组2，1：hairpin3′；2：hairpin4′；7-8：hairpin3′+hairpin4′+促发子；9-12是组1，1：hairpin1′；2：hairpin2′；11-12：hairpin1′+hairpin2′+促发子。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明中，abts显色液的配方为：1mldnazyme底物缓冲液，柠檬酸0.933g，蒸馏水100ml，5μlabts底物溶液，1μl30％h2o2。

dnazyme底物缓冲液：即为ph3.6的柠檬酸盐缓冲液，配方为：na2hpo4.12h2o1.843g，柠檬酸0.933g，蒸馏水100ml。

abts底物溶液：取20mg2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐粉末(购自sigma公司)溶于1mldmso，即得。

实施例1通用隔断超快扩增的铜、钙切割型功能核酸可视化检测方法

1、实验材料

sybrgold核酸染料、核酸分子量标准ultra-lowrangednaladder、dntp、extaqdna聚合酶、10×taqbuffer、氯高铁血红素、氯化铜、氯化钙、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺盐(abts)、h2o2、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)、mes、licl、tris、氯化钾，氯化钠，氯化镁，乙二胺四乙酸二钠，硫酸，四甲基联苯胺，尿素，均购自赛默飞科技(thermoscientificlifetechnologies)。实验用水均来自milli-q纯水系统。

序列设计如下(seqidno:1-13)：

注：核酶切割目标产物和扩增模板3’端序列互补；

核酶底物链末端所添加的加粗碱基序列是为了增加与模板结合tm值；切割位点用“-”表示；

17ev1核酶底物链-cu和核酶酶链-cu共同组成铜离子的特异性核酶(核酶-cu)；17e核酶底物链-ca和核酶酶链-ca共同组成钙离子的特异性核酶(核酶-ca)。

2、核酶的构建及切割反应体系的验证

(1)将4μl核酶底物链-cu(10μm母液)与4μl核酶酶链-cu(10μm母液)用缓冲液(250mmhepes缓冲液(ph＝7.0)，2.5mnacl,500mm抗坏血酸和2.5mkcl)稀释至40μl，95℃加热15min，然后缓慢降至37℃，大约耗时45min。

加入5μl氯化铜溶液(1μm母液)，形成40μl体系，于37℃下孵育5分钟，在40μl体系中加入5μl终止液(浓度为0.2medta，2mnacl,0.5mtris)，混匀后4摄氏度保存。用20％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，得到铜离子核酶切割后的小片段，证明铜离子核酶的制备与切割成功(图1)。

(2)将4μl核酶底物链-ca(10μm母液)与4μl核酶酶链-ca(10μm母液)用缓冲液(终浓度为50mmmes,ph6.0，25mmlicl)稀释至40μl，95℃加热15min，然后缓慢降至37℃，大约耗时45min。

加入5μl氯化钙溶液(1μm母液)，形成40μl体系，于37℃下孵育6分钟，在40μl体系中加入5μl终止液(浓度为0.2medta，2mnacl,0.5mtris)，混匀后4摄氏度保存。用20％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，得到钙离子核酶切割后的小片段，证明钙离子核酶的制备与切割成功(图2)。

3、超速pcr装置的搭建以及超速pcr反应体系的建立与验证

超速pcr装置的主要结构如图3所示，其具体的结构、连接方式和工作原理、工作过程包括：超速pcr装置的温度变化经由一个95℃的高温水浴锅和一个58℃的中温水浴锅来实现。采用lightcycler型号的毛细管(20μl，04929292001，roche)作为pcr样品室。通过快速离心的方式，样品会分别聚集到各个毛细管一端；离心完成后带有样品的毛细管被固定在一个专用的塑料支架上。

铜离子超速pcr体系如下：

钙离子超速pcr体系如下：

双重超速pcr体系如下：

在实际检测中，切割产物是指上述切割反应体系中，用待测样品替换标样。

在冰上配制10μl反应体系，迅速置于超速pcr反应装置中进行温度控制。超速pcr反应程序：95℃2s，58℃3s，36个循环，总计3min。

完成双重超速pcr反应过程，使用2％琼脂糖凝胶电泳验证超速pcr反应体系的扩增效果，反应条件：120v0.5h，拍照系统：molecularimagergeldocxr(bio-rad)。

实验结果表明，在切割目标产物分别存在或者同时存在时都可以进行模板在短时间内进行扩增(图4)。

4、pcr产物自组装

发夹探针hairpin1，hairpin2，hairpin3，hairpin4分别用超纯水溶解至100μm，于95℃加热5min，后缓慢降至室温，备用；按照超速pcr反应体系和反应过程完成超速pcr反应，将超速pcr反应产物加入不同组成的阵列中，使得阵列终浓度为2μm的hairpin1，hairpin2，hairpin3和hairpin4中，加入自组装缓冲液(8mmna2hpo4,2.5mmnah2po4,0.15mnacl,2mmmgcl2,ph7.4)，使得每个反应体系的总体积为50μl，37℃，30min，进行hcr反应。阵列排列顺序见图5。根据阵列的排列顺序，可以对钙离子、铜离子是否是单独存在，还是共存做出判断，在依据产物催化abts的颜色变化，再对其进行单独定量。

5、显色模块的建立与验证

80μl酶活缓冲液(100mmtris、120mmnacl、10mmmgcl2、100mmkcl，ph8.4)，10μl氯高铁血红素溶液与10μlhcr产物，混匀后37℃反应30min，使hcr产物结合氯高铁血红素形成具有类过氧化物酶活性的g四链体结构，加入100μlabts显色液，混匀，37℃避光孵育10min，酶标仪测定od415。

所述氯高铁血红素溶液的配制方法为：用dmso配制浓度为20mm的氯高铁血红素原液，将2μl氯高铁血红素原液与1ml所述酶活缓冲液混合，即得。

6、双重金属离子的超灵敏、可视化的快速检测

根据上述优化体系，分别加入不同浓度的10、20、50、80、100nm的cu²⁺和ca²⁺的切割产物进行超快pcr，将pcr进行自组装，在适宜的缓冲条件下进行显色，根据颜色变化绘制显色的标准曲线，cu²⁺标准曲线见图6，ca²⁺标准曲线见图7。

cu²⁺检测范围是10-100nm(可在此范围内实现定量检测)，最低检出限是2.6nm。

ca²⁺检测范围是10-100nm(可在此范围内实现定量检测)，最低检出限是0.2nm。

实施例2检测方法的特异性考察

按照实施例1(1)构建的生物传感器，分别将10nmcu²⁺、10μm的mg²⁺、cd²⁺、ca²⁺、zn²⁺、cr³⁺、pb²⁺、fe²⁺加入到体系中进行检测，结果表明，所建立的cu²⁺生物传感器具有较好的特异性(图8)。

按照实施例1(2)构建的生物传感器，分别将10nmca²⁺、10μm的mg²⁺、cd²⁺、cu²⁺、zn²⁺、cr³⁺、pb²⁺、fe²⁺加入到体系中进行检测，结果表明，所建立的ca²⁺生物传感器具有较好的特异性(图9)。

按照实施例1(3)构建的生物传感器，分别将10nmcu²⁺、10nmca²⁺、10μm的mg²⁺、cd²⁺、cu²⁺、zn²⁺、cr³⁺、pb²⁺、fe²⁺加入到体系中进行检测，结果表明，所建立的cu²⁺、ca²⁺生物传感器具有较好的特异性(图10)。

实施例3加标实验

取高纯水用实施例1构建的生物传感器进行检测，cu²⁺、ca²⁺无检出，对其进行加标实验，连续测定多次所得结果见表1。

表1加标回收实验结果

实施例4hcr反应时间的优化

按照实施例1构建的生物传感器，将探针1、探针2分别用水溶解至100μm，于95℃加热5min，然后缓慢降至室温备用；将pcr产物加入终浓度为2μm的探针1和探针2的混合液中，并加入自组装缓冲液至总体积50μl。hcr反应时间分别是10min、20min、30min、40min、50min。结果见图11，由图11可以看出，30min内就可以形成足够的长双链，因此确定反应时间为30min。

按照实施例1构建的生物传感器，将探针3、探针4分别用水溶解至100μm，于95℃加热5min，然后缓慢降至室温备用；将pcr产物加入终浓度为2μm的探针3和探针4的混合液中，并加入自组装缓冲液至总体积50μl。hcr反应时间分别是15min30min、45min、60min。结果见图12，由图12可以看出，30min内就可以形成足够的长双链，因此确定反应时间为30min。

实施例5hcr反应中发夹探针序列的优化

按照实施例1构建的生物传感器，设计如下铜离子发夹探针组合实验组(表2)。所用促发子的碱基序列如下：5′-agtctaggattcggcgtcccttaa-3′。

表2

结果见图13，由图13可以看出，实验组1促发hcr的效果最好，因此本发明选择将发夹探针组合hairpin1+hairpin2作为hcr促发序列。

按照实施例1构建的生物传感器，设计如下钙离子发夹探针组合实验组(表3)。所用促发子的碱基序列如下：5′-agacgaagcactggttgaaac-3′。

表3

结果见图14，由图14可以看出，实验组1促发hcr的效果最好，因此本发明选择将发夹探针组合hairpin1′+hairpin2′作为hcr促发序列。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>通用隔断超快扩增铜、钙切割型功能核酸可视化检测方法

<130>khp181111551.4

<160>13

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

agcttctttctaatacggcttaccttggggggtt34

<210>2

<211>43

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aaaaaaaaggtaagcctgggcctctttctttttaagaaagaac43

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cttaccttggggggggggtt20

<210>4

<211>70

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

agtctaggattcggcgtcccttaattaagggacgccgaatcctagacttcatcgcaccgt60

caaaggaacc70

<210>5

<211>64

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

agggcgggtgggttaagggacgccgaatcctagactcaaagtagtctaggattcggcgtc60

gggt64

<210>6

<211>64

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gggtagtctaggattcggcgtcccttaagacgccgaatcctagactactttgagggcggg60

tggg64

<210>7

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gtcacgagtcactataggaagatggcgaaattgggg36

<210>8

<211>43

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

tttcgccatcttctctcagcgagacgaaatagtgactcgtgac43

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

ggaagatggcgaaattgggg20

<210>10

<211>70

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

agacgaagcactggttgaaactccggagtttcaaccagtgcttcgtcttcatcgcaccgt60

caaaggaacc70

<210>11

<211>64

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

agggcgggtgggtggagtttcaaccagtgcttcgtctccccagacgaagcactggttgat60

gggt64

<210>12

<211>64

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

tgggtagacgaagcactggttgaaactcctcaaccagtgcttcgtctggggtgggtaggg60

cggg64

<210>13

<211>91

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

tcatcgcaccgtcaaaggaacctcagtatcagtgctatacgtcgatcagtaaaccccccc60

cccaaggtaagccccaatttcgccatcttcc91