用于同时检测MTHFR和MTRR基因多态性的产品及其方法和应用与流程

本发明涉及分子诊断
技术领域：
，尤其是涉及一种用于同时检测mthfr和mtrr基因多态性的产品及其方法和应用。
背景技术：
叶酸是一种水溶性维生素，即维生素b9，不能在体内合成，只能从外部摄取。叶酸对体内蛋白质和核酸的合成和以及种氨基酸的代谢具有重要的作用，故叶酸对维持个体健康具有重要的作用。叶酸缺乏可造成胎儿神经管畸形、唐氏综合征，唇腭裂和先天性心脏病等；可造成孕妇妊娠高血压、早产、先兆子痫、习惯性流产和巨幼细胞性贫血等疾病。叶酸补充过量可影响锌的吸收，导致胎儿发育异常和新生儿自闭症等；可增加孕妇结肠腺瘤癌变和乳腺癌发病的风险，掩盖维生素b12缺乏，导致孕妇体虚、神经衰弱和恶性贫血等。所以科学合理补充叶酸是保证个体健康和实现优生优育的重要途径。摄入体内的叶酸需要经过一系列的代谢才能发挥作用。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolatereductase，mthfr)和蛋氨酸合成酶还原酶(methioninesynthasereductase，mtrr)是叶酸代谢途径中的两种关键酶，两者共同维持体内叶酸的正常代谢。mthfr催化叶酸代谢途径中5,10-亚甲基四氢叶酸转化成5-甲基四氢叶酸，5-甲基四氢叶酸再通过一系列的催化反应为dna和蛋白质甲基化提供甲基并使血液中的同型半胱氨酸维持稳定的水平。甲硫氨酸合成酶在维生素b12的辅助下催化5-甲基四氢叶酸和同型半胱氨酸生成四氢叶酸和甲硫氨酸。甲硫氨酸合成酶可能由于维生素b12的氧化而失活，mtrr可以通过甲基化的还原反应而产生有活性的蛋氨酸合成酶。所以mthfr和mtrr是叶酸代谢的关键酶。mthfr和mtrr分别由mthfr基因和mtrr基因编码，mthfr和mtrr基因的突变将导致其编码的mthfr和mtrr酶活性降低甚至丧失，进而造成体内叶酸代谢障碍，最终降低叶酸利用率。mthfr基因常见的突变位点为c.665c>t(rs1801133)和c.1286a>c(rs1801131)，mtrr基因常见的突变位点为c.66a>g(rs1801394)。在中国人群中c.665c>t发生的概率为28％，c.1286a>c发生的概率为4％，c.66a>g发生的概率为6％。c.665c>t和c.1286a>c突变导致mthfr酶的热稳定和活性大大降低，进而降低叶酸利用能力。c.66a>g突变导致mtrr酶活性降低，引起同型半胱氨酸血浓度升高。总上所述，实现差异个体最佳的叶酸补充剂量需要考虑两个方面，一方面摄入体内的叶酸剂量；另一方面，摄入体内的叶酸利用率，即叶酸的代谢能力。摄入体内叶酸的剂量是由个体的叶酸代谢能力决定，所以检测个体的叶酸代谢能力，根据检测结果指导个体的叶酸补充剂量是科学合理补充叶酸的有效方法。目前，检测叶酸代谢方法主要有sanger测序法、荧光定量pcr法和芯片杂交法。sanger测序法实验操作过程比较繁琐，实验周期长，成本高，不适合大量样本的检测。芯片杂交法同样存在实验操作过程比较繁琐，实验周期长，成本高等缺点。荧光定量pcr法通常采用taqman探针法，taqmanprobe法由于自身的局限性区分度比较差，检测结果存在假阳性或者假阴性。所以建立一种实验操作方便快捷、检测周期短、检测结果精准度高的方法是目前迫切需要解决的问题。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一个目的在于提供一种用于同时检测mthfr和mtrr基因多态性的引物组合物，本发明的第二个目的在于提供一种用于同时检测mthfr和mtrr基因多态性的试剂，本发明的第三个目的在于提供一种用于同时检测mthfr和mtrr基因多态性的试剂盒，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。本发明的第四个目的在于提供一种同时检测mthfr和mtrr基因多态性的方法，该方法操作简便，普适性强，能够节约大量的人力物力，以保证临床的需要。本发明的第五个目的在于提供上述的引物组合物、试剂、试剂盒或检测的方法在检测叶酸的代谢能力中的应用。本发明提供了一种用于同时检测mthfr和mtrr基因多态性的引物组合物，所述引物组包括用于检测mthfr基因rs1801133位点的引物组、用于检测mthfr基因rs1801131位点的引物组和用于检测mtrr基因rs1801394位点的引物组；所述用于检测mthfr基因rs1801133位点的引物组包括：如seqidno.1所示的rs1801133位点的上游引物、如seqidno.2所示的rs1801133位点的下游引物、如seqidno.3所示的rs1801133位点的突变型特异性探针和如seqidno.4所示的rs1801133位点的野生型特异性探针；所述用于检测mthfr基因rs1801131位点的引物组包括：如seqidno.5所示的rs1801131位点的上游引物、如seqidno.6所示的rs1801131位点的下游引物、如seqidno.7所示的rs1801131位点的突变型特异性探针和如seqidno.8所示的rs1801131位点的野生型特异性探针；所述用于检测mtrr基因rs1801394位点的引物组包括：如seqidno.9所示的rs1801394位点的上游引物、如seqidno.10所示的rs1801394位点的下游引物、如seqidno.11所示的rs1801394位点的突变型特异性探针和如seqidno.12所示的rs1801394位点的野生型特异性探针；其中，所述突变型特异性探针和野生型特异性探针均分别修饰有荧光标记；所述rs1801133位点的突变型特异性探针序列的第10位碱基g上修饰有锁核酸，所述rs1801131位点的野生型特异性探针序列的第8位碱基g上修饰有锁核酸。进一步地，所述rs1801133位点的突变型特异性探针的5’端修饰有fam，3’端修饰有mgb；所述rs1801133位点的野生型特异性探针的5’端修饰有joe，3’端修饰有mgb；所述rs1801131位点的突变型特异性探针的5’端修饰有joe，3’端修饰有mgb；所述rs1801131位点的野生型特异性探针的5’端修饰有fam，3’端修饰有mgb；所述rs1801394位点的突变型特异性探针的5’端修饰有joe，3’端修饰有mgb；所述rs1801394位点的野生型特异性探针的5’端修饰有fam，3’端修饰有mgb。本发明还提供了一种用于同时检测mthfr和mtrr基因多态性的试剂，所述试剂包括上述的引物组合物。本发明还提供了一种用于同时检测mthfr和mtrr基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组合物或试剂。进一步地，所述试剂盒还包括2×genotypingmastermix、野生型对照、突变型对照、杂合型对照和水；优选地，所述2×genotypingmastermix包括2×pcrbuffer、1mmmgcl2、0.4mmdntp和0.1u/μlmastertaqhsdnapolymerase。进一步地，所述野生型对照包括rs1801133cc野生型质粒、rs1801131aa野生型质粒和rs1801394aa野生型质粒；所述突变型对照包括rs1801133tt突变型质粒、rs1801131cc突变型质粒和rs1801394gg突变型质粒；所述杂合型对照包括rs1801133ct杂合型质粒、rs1801131ac杂合型质粒和rs1801394ag杂合型质粒。进一步地，所述杂合型质粒由相应位点的野生型质粒与突变型质粒等体积混匀制备而成；优选地，所述野生型质粒、突变型质粒和杂合型质粒的浓度为5-15pg/μl，优选为10pg/μl。本发明还提供了一种同时检测mthfr和mtrr基因多态性的方法，应用上述的引物组合物、试剂或试剂盒，以待测样本的dna为模板，进行pcr扩增反应并进行基因分型。进一步地，所述基因分型检测结果根据allelicdiscriminationplot和amplificationplot共同判定。本发明还提供了上述的引物组合物、试剂、试剂盒或方法在检测叶酸的代谢能力中的应用。本发明提供的用于同时检测mthfr和mtrr基因多态性的引物组合物，包括用于检测mthfr基因rs1801133位点的引物组、用于检测mthfr基因rs1801131位点的引物组和用于检测mtrr基因rs1801394位点的引物组，可同时检测不同种的与叶酸代谢相关的基因多态位点，检测全面，应用广泛，同时具有特异性强、灵敏度高的效果，能够将每个位点的三个基因型分别准确区分，并且检测最低浓度能够达到1ng/μl，检测结果可用于临床指导用药。并且，在探针中引入锁核酸修饰，筛选到长度足够短且分型效果佳的探针，同时探针的各项参数符合其设计原则，能够有效提高检测结果精准度，达到最佳的分型效果。本发明提供的用于同时检测mthfr和mtrr基因多态性的试剂和试剂盒，包括本发明提供的引物组合物，其成本低、效率高，能够快速、准确地检测mthfr和mtrr基因多态性，灵敏度高、特异性强。本发明提供的同时检测mthfr和mtrr基因多态性的方法，应用本发明提供的引物组合物、试剂或试剂盒，以待测样本的dna为模板，进行pcr扩增反应并进行基因分型。该方法操作简单，成本低廉，对仪器要求不高，耗时短，可有效提高检测效率，且检测结果精准度高，临床应用范围广。附图说明图1a为本发明实施例1提供的rs1801133位点阴性对照的扩增曲线图；图1b为本发明实施例1提供的rs1801133位点cc型的扩增曲线图；图1c为本发明实施例1提供的rs1801133位点ct型的扩增曲线图；图1d为本发明实施例1提供的rs1801133位点tt型的扩增曲线图；图2a为本发明实施例1提供的rs1801131位点阴性对照的扩增曲线图；图2b为本发明实施例1提供的rs1801131位点aa型的扩增曲线图；图2c为本发明实施例1提供的rs1801131位点ac型的扩增曲线图；图2d为本发明实施例1提供的rs1801131位点cc型的扩增曲线图；图3a为本发明实施例1提供的rs1801394位点阴性对照的扩增曲线图；图3b为本发明实施例1提供的rs1801394位点aa型的扩增曲线图；图3c为本发明实施例1提供的rs1801394位点ag型的扩增曲线图；图3d为本发明实施例1提供的rs1801394位点gg型的扩增曲线图；图4a为本发明实施例1提供的rs1801133位点的分型图谱；图4b为本发明实施例1提供的rs1801131位点的分型图谱；图4c为本发明实施例1提供的rs1801394位点的分型图谱；图5a为本发明实施例2提供的rs1801133位点的扩增曲线结果图；图5b为本发明实施例2提供的rs1801131位点的扩增曲线结果图；图5c为本发明实施例2提供的rs1801394位点的扩增曲线结果图；图6a为本发明实施例2提供的rs1801133位点的sanger测序结果图；图6b为本发明实施例2提供的rs1801131位点的sanger测序结果图；图6c为本发明实施例2提供的rs1801394位点的sanger测序结果图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明提供了一种用于同时检测mthfr和mtrr基因多态性的引物组合物，所述引物组包括用于检测mthfr基因rs1801133位点的引物组、用于检测mthfr基因rs1801131位点的引物组和用于检测mtrr基因rs1801394位点的引物组。其中，用于检测mthfr基因rs1801133位点的引物组包括：用于检测mthfr基因rs1801131位点的引物组包括：用于检测mtrr基因rs1801394位点的引物组包括：本发明提供的用于同时检测mthfr和mtrr基因多态性的引物组合物，可同时检测不同种的与叶酸代谢相关的基因多态位点，检测全面，应用广泛，同时具有特异性强、灵敏度高的效果，检测结果可用于临床指导用药。其中rs1801133-tt-probe序列中“ixna_g”为锁核酸修饰的g碱基，rs1801131-aa-probe序列中“ixna_g”同样为锁核酸修饰的g碱基。由于rs1801133和rs1801131位点上下游序列gc含量比较少，筛选的taqmanmgbprobe不满足其设计原则且分型效果差，导致检测结果不准确。在两条探针中引入锁核酸修饰目的是在保证taqmanmgbprobe足够短且tm值达到mgbprobe的设计原则要求，以便达到最佳的分型效果。本发明提供的用于同时检测mthfr和mtrr基因多态性的试剂盒包括本发明提供的引物组合物或试剂。本发明提供的用于同时检测mthfr和mtrr基因多态性的试剂和试剂盒，成本低、效率高，能够快速、准确地检测mthfr和mtrr基因多态性，灵敏度高、特异性强。在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括2×genotypingmastermix、野生型对照、突变型对照、杂合型对照和水。优选地，所述2×genotypingmastermix包括2×pcrbuffer、1mmmgcl2、0.4mmdntp和0.1u/μlmastertaqhsdnapolymerase。其中，2×pcrbuffer包括40mmtris-hcl(ph8.3at25℃),40mmkcl，10mm(nh4)2so4和8mmmgcl2。在一些优选的实施方式中，所述野生型对照包括rs1801133cc野生型质粒、rs1801131aa野生型质粒和rs1801394aa野生型质粒；所述突变型对照包括rs1801133tt突变型质粒、rs1801131cc突变型质粒和rs1801394gg突变型质粒；所述杂合型对照包括rs1801133ct杂合型质粒、rs1801131ac杂合型质粒和rs1801394ag杂合型质粒。通过设置严格阳性标准品和阴性标准品作为对照，一方面通过标准品的扩增曲线和荧光信号强度指示2×genotypingmastermix的扩增效率是否满足检测实验要求，是否存在阴性污染等问题，最终确定2×genotypingmastermix是否可以用于后续待检样本的检测实验。另一方面每个标准品对应位点的基因型已经过sanger测序，其基因型为已知，将本发明检测标准品的基因型结果与sanger测序结果进行比较，如果两种方法检测结果一致，表明本发明的引物组和2×genotypingmastermix可以用于后续待检样本的检测。如果两种方法检测结果不一致，需要查找引物组和2×genotypingmastermix存在的问题，待问题解决之后，才能用于后续待检样本的检测。在一个具体的实施方式中，以人的基因组dna为模板，以设计的对应位点的引物进行pcr扩增，扩增产物sanger测序之后选择对应snp位点的基因型为野生型和突变型的pcr产物ta克隆，挑选对应snp位点的野生型和突变型的质粒，吸取一部分对应snp位点的野生型和突变型质粒，分别稀释至10ng/μl，然后将稀释至10ng/μl对应snp位点的野生型和突变型质粒等体积混合，即获得对应snp位点的杂合性质粒。然后将对应snp位点的野生型、杂合型和突变型质粒稀释至10pg/μl作为标准品的基因检测的工作液。本发明还提供了同时检测mthfr和mtrr基因多态性的方法，应用上述的引物组合物、试剂或试剂盒，以待测样本的dna为模板，进行pcr扩增反应并进行基因分型。该方法操作简单，成本低廉，对仪器要求不高，耗时短，可有效提高检测效率，且检测结果精准度高，临床应用范围广。在一些优选的实施方式中，基因分型检测结果根据allelicdiscriminationplot和amplificationplot共同判定。allelicdiscriminationplot和amplificationplot均为仪器生成的实验结果。“allelicdiscriminationplot”根据标准品的检测结果区分成野生型、杂合型和突变型三组，待检样本分属到哪一组就可以判定待检样本的基因型。然后再通过“amplificationplot”比较待检样本的扩增曲线和标准品的扩增曲线，进一步确认待检样本的基因型。同时应用两个不同维度进行基因分型结果的判定，更全面准确，能够有效避免假阳性或假阴性导致的实验结果的误差。在一个具体的实施方式中，rs1801133位点的检测反应体系为：componentsntccctypecttypetttype检测样本2×genotypingmastermix12.5μl12.5μl12.5μl12.5μl12.5μlrs1801133引物和探针混合物5μl5μl5μl5μl5μlrs1801133cc野生型质粒-1μl---rs1801133ctheterozygousplasmid--1μl--rs1801133tt突变型质粒---1μl-待检样本基因组dna(25ng/μl)----1μlpcr-gradewater7.5μl6.5μl6.5μl6.5μl6.5μltotalvolume25μl25μl25μl25μl25μlrs1801131位点的检测反应体系为：componentsntcaatypeactypecctype检测样本2×genotypingmastermix12.5μl12.5μl12.5μl12.5μl12.5μlrs1801131引物和探针混合物5μl5μl5μl5μl5μlrs1801131aa野生型质粒-1μl---rs1801131acheterozygousplasmid--1μl--rs1801131cc突变型质粒---1μl-待检样本基因组dna(25ng/μl)----1μlpcr-gradewater7.5μl6.5μl6.5μl6.5μl6.5μltotalvolume25μl25μl25μl25μl25μlrs1801394位点的检测反应体系为：在一个具体的实施方式中，rs1801133、rs1801131和rs1801394位点的检测反应程序如下：另外，本发明还提供了上述引物组合物、试剂、试剂盒或方法在检测叶酸的代谢能力中的应用。为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。如未特殊说明，本发明实施例所用的试剂和仪器如下：配置2×genotypingmastermix中所用dntp和mastertaqhsdnapolymerase从thermofisher公司购买。本发明中所述的所有引物和mgbprobe均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成部合成。所用realtimepcr仪为7500real-timepcrsystem，从appliedbiosystems公司购买。实施例1以下是采用本发明对构建的rs1801133、rs1801131和rs1801394三个位点的野生型、杂合型和突变型标准品基因检测的具体实施情况。1、三个snp位点的野生型、杂合型和突变型标准品的构建按照
发明内容中的描述构建每个位点野生型、杂合型和突变型标准品。即首先从ncbi(nationalcenterforbiotechnologyinformation)数据库中查找rs1801133、rs1801131和rs1801394三个snp位点的序列，然后以查找的序列为靶序列设计引物，每个位点的正反引物的位置距对应的snp位点在100-300bp范围内。其中，rs1801133cc野生型质粒和rs1801133tt突变型质粒的构建首先以人的基因组dna为模板，以rs1801133-clone-f和rs1801133-clone-r为引物进行pcr扩增，采用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(产品编号：b518131-0050)对pcr产物进行纯化，纯化产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序部sanger测序，分析测序结果，筛选rs1801133位点的基因型为cc型和tt型纯化的pcr产物，按照pmd18-tvectorcloningkit说明书将对应的pcr产物克隆测序，将rs1801133位点为cc型的质粒称为rs1801133cc野生型质粒，并吸取一部分稀释至10ng/μl备用。将rs1801133位点为tt型的质粒称为rs1801133tt突变型质粒，并吸取一部分稀释至10ng/μl备用。rs1801133ctheterozygousplasmid是将10ng/μlrs1801133cc野生型质粒和10ng/μlrs1801133tt突变型质粒等体积充分混匀制备而成。分别将rs1801133cc野生型质粒、rs1801133ctheterozygousplasmid和rs1801133tt突变型质粒三种质粒稀释至10pg/μl作为rs1801133位点检测反应体系的工作液。rs1801131aa野生型质粒和rs1801131cc突变型质粒的构建首先以人的基因组dna为模板，以rs1801131-clone-f和rs1801131-clone-f为引物进行pcr扩增，采用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(产品编号：b518131-0050)对pcr产物进行纯化，纯化产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序部sanger测序，分析测序结果，筛选rs1801131基因型为aa型和cc型纯化的pcr产物，按照pmd18-tvectorcloningkit说明书克隆测序，将rs1801131位点为aa型的质粒称为rs1801131aa野生型质粒，并吸取一部分稀释至10ng/μl备用。将rs1801131位点为cc型的质粒称为rs1801131cc突变型质粒，并吸取一部分稀释至10ng/μl备用。rs1801131acheterozygousplasmid是将10ng/μlrs1801131aa野生型质粒和10ng/μlrs1801131cc突变型质粒等体积充分混匀制备而成。分别将rs1801131aa野生型质粒、rs1801131acheterozygousplasmid和rs1801131cc突变型质粒三种质粒稀释至10pg/μl作为rs1801131位点检测反应体系的工作液。所述的rs1801394aa野生型质粒和rs1801394gg突变型质粒的构建首先以人的基因组dna为模板，以rs1801394-clone-f和rs1801394-clone-r为引物进行pcr扩增，采用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(产品编号：b518131-0050)对pcr产物纯化，纯化产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序部sanger测序，分析测序结果，筛选rs1801394基因型为aa型和gg型纯化的pcr产物，按照pmd18-tvectorcloningkit说明书克隆测序，将rs1801394位点为aa型的质粒称为rs1801394aa野生型质粒，并吸取一部分稀释至10ng/μl备用。将rs1801394位点为gg型的质粒称为rs1801394gg突变型质粒，并吸取一部分稀释至10ng/μl备用。rs1801394agheterozygousplasmid是将10ng/μlrs1801394aa野生型质粒和10ng/μlrs1801394gg突变型质粒等体积充分混匀制备而成。分别将rs1801394aa野生型质粒、rs1801394agheterozygousplasmid和rs1801394gg突变型质粒三种质粒稀释至10pg/μl作为rs1801394位点检测反应体系的工作液。2、三个snp位点的野生型、杂合型和突变型标准品的基因检测1)rs1801133位点的检测反应体系为：2)rs1801131位点的检测反应体系为：componentsntcaatypeactypecctype2×genotypingmastermix12.5μl12.5μl12.5μl12.5μlrs1801131引物和探针混合物5μl5μl5μl5μlrs1801131aa野生型质粒-1μl--rs1801131acheterozygousplasmid--1μl-rs1801131cc突变型质粒---1μl待检样本基因组dna(25ng/μl)----pcr-gradewater7.5μl6.5μl6.5μl6.5μltotalvolume25μl25μl25μl25μl3)rs1801394位点的检测反应体系为：componentsntcaatypeagtypeggtype2×genotypingmastermix12.5μl12.5μl12.5μl12.5μlrs1801394引物和探针混合物5μl5μl5μl5μlrs1801394aa野生型质粒-1μl--rs1801394agheterozygousplasmid--1μl-rs1801394gg突变型质粒---1μl待检样本基因组dna(25ng/μl)----pcr-gradewater7.5μl6.5μl6.5μl6.5μltotalvolume25μl25μl25μl25μl4)上述所有检测反应体系的反应程序如下：3、rs1801133、rs1801131和rs1801394标准品检测结果分析rs1801133、rs1801131和rs1801394标准品检测结果分为扩增曲线和分型图谱，扩增曲线的结果如图1a、1b、1c、1d、图2a、2b、2c、2d和图3a、3b、3c、3d所示，分型图谱如图4a、4b和4c所示。以rs1801133位点为例，当检测反应体系中未加入标准品时，扩增曲线没有起峰、对应分型图谱中黑色实心方块；当检测反应体系中只加入rs1801133cc野生型质粒时，只有rs1801133-cc-probe有信号，对应rs1801133分型图谱中红色实心圆点，判定该标准品的基因型为cc型；当检测反应体系中只加入rs1801133tt突变型质粒时，只有rs1801133-tt-probe有信号，对应rs1801133分型图谱中蓝色实心圆点，判定该标准品的基因型为tt型；当检测反应体系中加入rs1801133ct杂合型质粒时，两条探针都有信号，对应rs1801133分型图谱中绿色实心圆点，判定该标准品的基因型为ct型。上述三种标准品的检测结果与实际基因型完全一致，说明本发明对标准品的检测结果准确。对于rs1801131和rs1801394位点，本发明对于每个位点的三种标准品的检测结果都与实际基因型一致，说明本发明对标准品的检测结果准确。另外，本发明可以检测低至pg基本的阳性质控品，说明本发明检测的灵敏度高。实施例2以下是采用本发明对ty-1唾液样本rs1801133、rs1801131和rs1801394三个位点检测的具体实施情况，同时采用每个位点的标准品作为阳性质控品。1、三个snp位点的野生型、杂合型和突变型标准品的构建具体构建如实施例1中所述。2、yt-1唾液样本基因组dna提取yt-1唾液样本基因组dna提取严格按照生工生物(上海)股份有限公司的磁珠法唾液、尿液基因组dna抽提试剂盒(产品编号：b518766-0050)说明书进行操作。获得基因组dna采用微量分光光度计测定浓度和琼脂糖凝胶电泳检测质量符合要求时，吸出一部分稀释至25ng/μl备用。3、yt-1唾液样本检测反应体系的建立1)yt-1唾液样本rs1801133位点的检测反应体系componentsntccctypecttypetttype检测样本2×genotypingmastermix12.5μl12.5μl12.5μl12.5μl12.5μlrs1801133引物和探针混合物5μl5μl5μl5μl5μlrs1801133cc野生型质粒-1μl---rs1801133ctheterozygousplasmid--1μl--rs1801133tt突变型质粒---1μl-ty-1唾液样本基因组dna(25ng/μl)----1μlpcr-gradewater7.5μl6.5μl6.5μl6.5μl6.5μltotalvolume25μl25μl25μl25μl25μl2)yt-1唾液样本rs1801131位点的检测反应体系为：componentsntcaatypeactypecctype检测样本2×genotypingmastermix12.5μl12.5μl12.5μl12.5μl12.5μlrs1801131引物和探针混合物5μl5μl5μl5μl5μlrs1801131aa野生型质粒-1μl---rs1801131acheterozygousplasmid--1μl--rs1801131cc突变型质粒---1μl-yt-1唾液样本基因组dna(25ng/μl)----1μlpcr-gradewater7.5μl6.5μl6.5μl6.5μl6.5μltotalvolume25μl25μl25μl25μl25μl3)yt-1唾液样本rs1801394位点的检测反应体系为：4)上述检测反应体系的反应程序检测反应程序按照实施例1所述。4、ty-1唾液样本基因检测结果分析ty-1唾液样本的基因检测结果分为扩增曲线和分型图谱，扩增曲线的结果如图5a、5b和5c所示，分型图谱如图4a、4b和4c所示。扩增曲线表明ty-1唾液样本rs1801133位点rs1801133-cc-probe和rs1801133-tt-probe两条探针都有信号，分型图谱的位置与标准品rs1801133ct杂合型质粒分为一组，说明ty-1唾液样本rs1801133位点的基因型为ct杂合型；ty-1唾液样本rs1801131位点的扩增曲线只有rs1801131-aa-probe有信号，分型图谱的位置与标准品rs1801131aa野生型质粒分为一组，说明ty-1唾液样本rs1801131位点的基因型为aa型；ty-1唾液样本rs1801394位点的扩增曲线只有rs1801394-gg-probe有信号，分型图谱的位置与标准品rs1801394gg突变型质粒分为一组，说明ty-1唾液样本rs1801394位点的基因型为gg型。采用本发明对ty-1唾液样本的三个snp位点基因检测结果如表1所示。表1ty-1唾液样本基因分型结果统计表5、ty-1唾液样本rs1801133、rs1801131和rs1801394基因分型结果验证sanger测序是检测snp位点基因分型的金标准。为了验证本发明对唾液样本ty-1rs1801133、rs1801131和rs1801394位点检测结果的准确性，本发明中同时对ty-1唾液样本的rs1801133、rs1801131和rs1801394三个位点进行sanger测序，比较两种检测方法结果的一致性。ty-1唾液样本三个snp位点的sanger测序结果如图6a、6b和6c所示。比较本发明和sanger测序两种检测方法的结果发现两种检测方法的结果一致，说明本发明的检测方法准确高效。实施例3为了进一步验证本发明检测结果的准确性，分别采用本发明和sanger测序法对50例血样基因组dna的rs1801133、rs1801131和rs1801394基因分型，比较本发明和sanger测序法两种检测方法结果的一致性。1、三个snp位点的野生型、杂合型和突变型标准品的构建具体构建流程如实施例1中所述。2、50例血样基因组dna检测反应体系的建立50例血样基因组dna的rs1801133、rs1801131和rs1801394反应体系的建立如实施例2中所述的ty-1唾液样本的基因组dna反应体系一样，每个位点的反应体系同样设置阴性对照和对应位点三种基因型的阳性对照。3、上述检测反应体系的反应程序检测反应程序按照实施例2所述。4、50例血样基因组dna基因分型结果分析每例血样基因组dnars1801133、rs1801131和rs1801394位点基因分型结果的判定如实施例2中ty-1唾液样本基因组dna判定方法一致，综合每例样本每个位点的扩增曲线和分型图谱两方面进行判定。5、50例血样基因组rs1801133、rs1801131和rs1801394基因分型结果验证如实施例2所述，sanger测序是检测snp位点基因分型的金标准。为了验证本发明对50例血样基因组dnars1801133、rs1801131和rs1801394位点检测结果的准确性，同时对50例血样基因组dna的rs1801133、rs1801131和rs1801394三个位点进行sanger测序，比较两种检测方法结果的一致性。采用本发明和sanger测序法检测50例血样基因组dna三个snp位点的基因型的比较结果如表2所示。比较结果可知，本发明的分型结果与sanger测序分型结果一致，说明本发明的检测方法准确性高。另外，50例血样基因组dna质量参差不齐，有些样本dna存在降解现象，有些样本浓度很低。当样本dna的浓度低至1ng/μl时，本发明的分型结果同样准确，说明本发明检测的灵敏度比较高。表250例血样基因组dna两种检测方法检测结果比较表最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。sequencelisting<110>生工生物工程（上海）股份有限公司<120>用于同时检测mthfr和mtrr基因多态性的产品及其方法和应用<160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1ggctgacctgaagcacttgaa21<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2ttcacaaagcggaagaatgtgt22<210>3<211>13<212>dna<213>人工序列<400>3tctgcgggagtcg13<210>4<211>13<212>dna<213>人工序列<400>4cgggagccgattt13<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列<400>5agagcaagtcccccaagga19<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<400>6ctttgtgaccattccggtttg21<210>7<211>14<212>dna<213>人工序列<400>7accagtgaagcaag14<210>8<211>12<212>dna<213>人工序列<400>8cagtgaagaaag12<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9tgccttgaagtgatgaggagg21<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<400>10acggctctaaccttatcgga20<210>11<211>14<212>dna<213>人工序列<400>11cagaagaaatgtgt14<210>12<211>14<212>dna<213>人工序列<400>12cagaagaaatatgt14当前第1页12