一种个体化用药相关基因多态性检测试剂盒及检测方法与流程

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种个体化用药相关基因多态性检测试剂盒及检测方法。

背景技术

血管内皮生长因子受体2（vegfr2）属于受体酪氨酸激酶超家族，主要分布在血管内皮细胞和淋巴内皮细胞中，是血管内皮生长因子-a促进血管内皮细胞分裂增殖，提高血管通透性的主要调节因子，并且在血管内皮生长因子-a的信号传导中起主导作用。

艾坦（阿帕替尼）是全球第一个在晚期胃癌被证实安全有效的小分子抗血管生成靶向药物，也是晚期胃癌标准化疗失败后，明显延长生存期的单药。同时，该药是胃癌靶向药物中唯一一个口服制剂，可有效提高患者治疗的依从性，并明显降低治疗费用。阿帕替尼高度选择性竞争细胞内vegfr2的atp结合位点，阻断下游信号转导，抑制肿瘤组织新血管生成。vegfr2基因位于染色体4q11-q12，全长47114bp，由30个外显子组成，编码的多肽链包括1356个氨基酸，是iii型酪氨酸激酶受体。vegfr2基因5’调控区有3个单核苷酸多态性位点，-604t/c和-65t/c在启动子区，+32a/g位于5’-utr，其中-65t/c的次要等位基因c的频率为0.04，+32a/g的次要等位基因g的频率为0.02，-604t/c的次要等位基因c的频率为0.28。已有文献报道阿帕替尼主要代谢酶为cyp3a4/5，其次为cyp2d6、cyp2c9、cyp2e1。

细胞色素p450是一大类药物代谢酶，参与许多药物、生物医源物质和内源性物质的代谢，其中cyp3a亚家族在人的肝脏和小肠中表达最丰富，它由细胞色素p4503a4、cyp3a5、cyp3a、cyp3a437组成。50%以上临床常用药物的氧化、还原反应都通过cyp3a4和cyp3a5催化来完成。cyp3a在人体中的表达存在30倍以上差异，这些差异造成许多药物口服生物利用度和清除率不同，特别是治疗指数窄的的药物。

目前，在现有已公开报道的文献中，只有针对cyp450基因多态性检测的试剂盒，但是还没有vegfr2基因多态性的试剂盒。因此本发明提供一种准确性高、特异性强、耗时短、成本低的个体化相关cyp3a4、cyp3a5、vegfr2的基因多态性检测的试剂盒及检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种操作简单、检测快速的个体化用药基因多态性检测的试剂盒及检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、试剂盒的制备

(1)引物的设计与合成：使用pyromarkassaydesign2.0软件设计引物,所得引物经过扩增子长度，二聚体形成，gc含量和melting解链温度差异分析，得分96~100分（满分100分）。表明所涉及的引物稳定性强、特异性好。

其中seqidno.1、no.6、no.9、no.14、no.18、no.21的5’端为生物素标记。

基因突变位点和类型如表1所示，扩增引物与测序引物序列如表2所示。

表1突变位点与类型

表2扩增引物与测序引物序列

2、利用上述试剂盒进行个体化用药相关基因单核苷酸多态性(snp)位点的检测

(1)dna提取

1）从患者血液样本中获取dna，采用天根生化科技（北京）有限公司生产的dp318试剂盒进行提取；

2）吸掉血清，在红细胞及血清界面处，吸取白细胞血样200μl，加入300μl细胞裂解液cl，颠倒混匀，12,000rpm离心1min，吸去上清，向沉淀中加200μl缓冲液gs，振荡至彻底混匀；

3）加入200μl缓冲液gb和20μlproteinasek，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次；

4）加无水乙醇200μl，轻轻颠倒混匀，出现絮状沉淀；

5）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中（吸附柱cb3放入收集管中），12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb3放入收集管中；

6）向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb3放入收集管中；

7）向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb3放入收集管中；

8）重复操作步骤（7）。

9）12,000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱cb3置于室温放置5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10）将吸附柱cb3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μl洗脱缓冲液tb，室温放置5min，12,000rpm离心2min，即得dna。

（2）pcr扩增反应

25μl反应体系各主要成分如下：2×easytaqpcrsupermix12.5μl、正反向扩增引物各1μl、模板1μl，其余为超纯水。

cyp3a4*19、cyp3a4*18、cyp3a5*3、vegfr2*2的pcr反应程序：（1）95℃，15min，1个循环；（2）94℃，30s，58℃，30s，72℃，45s，30个循环；（3）72℃，10min，1个循环；（4）4℃，holding。

vegfr2*1、vegfr2*3的pcr反应程序：（1）95℃，15min，1个循环；（2）94℃，30s，56℃，30s，72℃，45s，30个循环；（3）72℃，10min，1个循环；（4）4℃，holding。

扩增完成后，琼脂糖凝胶电泳检测pcr结果，结果显示为单一明亮条带，说明所设计的引物及采用的扩增体系效率高、灵敏度高、特异性好，用以进行下一步焦磷酸测序。

（3）焦磷酸测序

按照焦磷酸测序标准操作规程进行测序操作，主要步骤为：样品的制备与纯化，然后将纯化后的样品加入含有退火液和测序引物的mix中上机测序。焦磷酸测序仪试剂仓中加入运行程序相应的datp、dttp、dctp、dgtp、酶混合物、底物混合物。

3、检测结果在个体化用药中的应用

cyp3a4*19、cyp3a4*18促进代谢，所以这类基因变异个体需要适当加大服药量以维持药效；而cyp3a5*3会延缓代谢，所以这类基因变异个体在同样剂量下会延长药效时间，建议适当减少服药量以免发生药物不良反应；vegfr2*1、vegfr2*2、vegfr2*3将影响作用于血管内皮细胞生长因子受体药物的结合效率，进而影响疗效，该类基因变异个体服用相关药物时需要注意观察是否有药效，以免延误治疗时机。

本发明的优点在于：

本发明的试剂盒可以实现高效率、高灵敏度、低成本、稳定性强、特异性好的基因多态性位点的检测，检测结果不仅能对差异碱基定性，还能定量，检测结果还能实时观察，能快速出具检测结果，从而达到对个体化用药剂量量化的控制。

附图说明

图1为正常人cyp3a4*19基因的焦磷酸测序结果图。

图2为患者cyp3a4*19基因的焦磷酸测序结果图。

图3为正常人cyp3a4*18基因的焦磷酸测序结果图。

图4为患者cyp3a4*18基因的焦磷酸测序结果图。

图5为正常人cyp3a5*3基因的焦磷酸测序结果图。

图6为患者cyp3a5*3基因的焦磷酸测序结果图。

图7为正常人vegfr2*1基因的焦磷酸测序结果图。

图8为患者vegfr2*1基因的焦磷酸测序结果图。

图9为正常人vegfr2*2基因的焦磷酸测序结果图。

图10为患者vegfr2*2基因的焦磷酸测序结果图。

图11为正常人vegfr2*3基因的焦磷酸测序结果图。

图12为患者vegfr2*3基因的焦磷酸测序结果图。

具体实施方式

实施例1：试剂盒的制备

引物和探针的设计与合成使用pyromarkassaydesign2.0软件设计引物，所得引物经过扩增子长度，二聚体形成，gc含量，melting解链温度差异分析，得分96~100分（满分100分）。表明所涉及的引物稳定性强、特异性好。

其中seqidno.1、no.6、no.9、no.14、no.18、no.21的5’端为生物素标记。

基因突变位点和类型如表1所示，扩增引物与测序引物序列如表2所示。

表1突变位点与类型

表2扩增引物与测序引物序列

实施例2：利用上述试剂盒进行个体化用药相关基因snp位点的检测

1、dna提取

（1）从患者血液样本中获取dna，采用天根生化科技（北京）有限公司生产的dp318试剂盒进行提取。

（2）吸掉血清，在红细胞及血清界面界面处，吸取白细胞血样200μl，加入300μl细胞裂解液cl，颠倒混匀，12,000rpm离心1min，吸去上清，向沉淀中加200μl缓冲液gs，振荡至彻底混匀。

（3）加入200μl缓冲液gb和20μlproteinasek，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次。

（4）加无水乙醇200μl，轻轻颠倒混匀，出现絮状沉淀。

（5）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中（吸附柱cb3放入收集管中），12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

（6）向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

（7）向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

（8）重复操作步骤（7）。

（9）12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

（10）将吸附柱cb3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μl洗脱缓冲液tb，室温放置5min，12,000rpm离心2min，即得dna。

2、pcr扩增反应

25μl反应体系各主要成分如下：2×easytaqpcrsupermix12.5μl、正反向扩增引物各1μl、模板1μl，其余为超纯水。

cyp3a4*19、cyp3a4*18、cyp3a5*3、vegfr2*2的pcr反应程序：（1）95℃，15min，1个循环；（2）94℃，30s，58℃，30s，72℃，45s，30个循环；（3）72℃，10min，1个循环；（4）4℃，holding。

vegfr2*1、vegfr2*3的pcr反应程序：（1）95℃，15min，1个循环；（2）94℃，30s，56℃，30s，72℃，45s，30个循环；（3）72℃，10min，1个循环；（4）4℃，holding。

扩增完成后，琼脂糖凝胶电泳检测pcr结果，结果显示为单一明亮条带，说明所设计的引物及采用的扩增体系效率高、灵敏度高、特异性好，用以进行下一步焦磷酸测序。

3、焦磷酸测序

按照焦磷酸测序标准操作规程进行测序操作，主要步骤为：样品的制备与纯化，然后将纯化后的样品加入含有退火液和测序引物的mix中上机测序。焦磷酸测序仪试剂仓中加入运行程序相应的datp、dttp、dctp、dgtp、酶混合物、底物混合物。

4、样品的检测结果报告

图1、图2均是cyp3a4*19的纯合型，说明患者基因在该位点不存在突变。

图3是cyp3a4*18的纯合型，图4是cyp3a4*18的突变杂合型，说明患者基因在该位点发生了突变。

图5、图6均是cyp3a5*3的杂合型，说明患者基因在该位点不存在突变。

图7是vegfr2*1的杂合型，图8是vegfr2*1的突变纯合型，说明患者基因在该位点发生了突变。

图9是vegfr2*2的杂合型，图10是vegfr2*2的突变纯合型，说明患者基因在该位点发生了突变。

图11、图12是vegfr2*3的纯合型，说明患者基因在该位点不存在突变。

实施例3：检测结果在个体化用药中的应用

cyp3a4*19、cyp3a4*18促进代谢，所以这类基因变异个体需要适当加大服药量以维持药效；而cyp3a5*3会延缓代谢，所以这类基因变异个体在同样剂量下会延长药效时间，建议适当减少服药量以免发生药物不良反应；vegfr2*1、vegfr2*2、vegfr2*3将影响作用于血管内皮细胞生长因子受体药物的结合效率，进而影响疗效，该类基因变异个体服用相关药物时需要注意观察是否有药效，以免延误治疗时机。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建省医学科学研究院

<120>一种个体化用药相关基因多态性检测试剂盒及检测方法

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