本发明属于医药生物技术领域，具体而言，涉及一种具有自噬激活活性的红醇酮类化合物、其制备方法及其制药应用。
背景技术
放线菌(actinomycete)是一类重要的微生物，能够产生结构多样和活性丰富的次级代谢产物，其中链霉素(streptomycin，抗菌药物)、红霉素(erythromycin，抗菌药物)、利福霉素(rifamycin，抗结核病药物)、雷帕霉素(rapamycin，免疫抑制剂；又称为sirolimus，西罗莫司)和道诺霉素(daunomycin或daunorubicin，抗肿瘤药物)等已成为重要的临床药物；但是，很多放线菌的次级代谢产物(包括新结构化合物)，其生物(或生理)活性和用途仍有待挖掘和发现。
自噬(autophagy)是细胞维持自身生理稳态的一种机制。是细胞中的不被使用组分和受损细胞器被降解与再利用的一种基本过程。自噬能快速地为细胞提供燃料以应对能量需求(细胞对饥饿的响应)；自噬可以激活免疫反应，降解侵入细胞内的病原微生物；自噬也影响着胚胎发育和细胞变异等。因此，自噬对细胞具有非常重要的生理功能，自噬活性必须受到严格控制。
细胞自噬活性异常或失控，会导致人体免疫、病原微生物感染、炎症、肿瘤、心血管病、神经退行性病等疾病的发生，而自噬活性调节剂(激活或诱导剂，以及抑制剂)也有望成为治疗肿瘤、病原微生物感染、免疫性疾病、ⅱ型糖尿病和神经退行性疾病(例如帕金森症)等的药物。
细胞自噬对人类皮肤的表皮分化也具有重要的调控作用。皮肤表皮角质细胞的终末分化与细胞自噬具有相似的机制，例如它们都需要有控制地对胞内细胞器进行降解，表明细胞自噬在表皮分化过程中扮演了关键角色。已有报道表明细胞自噬信号途径参与了表皮角质细胞的炎症反应，以及细胞自噬的激活能够部分地通过炎性小体介导的信号途径诱导机体的抗炎症反应。
细胞自噬过程是一个多阶段过程，涉及数十种自噬相关蛋白(atg)的参与。在细胞启动自噬机制时，自噬体和自噬溶酶体的形成均是非常重要的环节。自噬体和自噬溶酶体的形成，与atg12和lc3b这两个泛素化复合物系统的形成和运转密切相关。其中，自噬蛋白atg4b、atg5和atg7参与了atg12和lc3b这两个泛素化复合物系统的形成。因此，细胞中的自噬蛋白例如atg4b、atg5和atg7等的含量变化，以及lc3b-ii/i的比值或lc3b-ii水平的变化(通常将lc3b-ii作为自噬体形成的标志蛋白)等，是检测细胞自噬活性增高或降低的重要指标。p62作为自噬底物的受体，其水平变化再结合lc3b-ii水平的变化，可以作为自噬流是否正常的判断标准。自噬流受阻常出现在一些疾病病理过程中。
细胞的自噬过程受到了上述多种蛋白质和/或蛋白质复合物的调控，影响这些蛋白质和/或蛋白质复合物功能发挥的小分子化合物就成为自噬活性调节剂(regulator)。例如，由链霉菌(属于放线菌)产生的雷帕霉素和衣霉素(tunicamycin)，已被证实是自噬激活剂(activator，inducer)，它们已分别作为药物新用途(适应症)进行开发研究和生化试剂得到应用。
某些放线菌菌株能够产生色彩艳丽的色素类次级代谢产物，它们对实验动物例如小鼠的毒性很低，有望用做天然(或有机)的食品添加剂，例如n.j.palleroni等1978年报道的玉红醇酮(rubrolones，曾译为罗博卢酮)。yijunyan等2016年发现玉红醇酮具有抗氧化和抗自由基活性，并对过氧化氢诱导的乳鼠心肌细胞损伤具有保护作用。xiaofengcai等2017年发现原红醇酮(isarubrolones)具有抗寄生虫leishmaniadonovani(杜氏利什曼虫)活性，以及较低的细胞毒活性；huijuanguo等2018年发现特红醇酮(rubterolones)具有抗炎活性。
上述玉红醇酮、原红醇酮和特红醇酮均具有非常相似的化学结构，即化合物的分子中均含有由6-脱氧己糖(6-deoxyhexose，a环)、呋喃(furan，b环)、环庚三烯酮(tropolone，c环)、环戊酮(cyclopentanone，d环)和吡啶(pyridine，e环)稠合五环组成的核心结构。这些化合物的结构差异出现在核心上的1-3个侧链取代基不同，以及2个手性碳原子的构型不同；例如与原红醇酮相比，玉红醇酮的a环上的2个羟基取代碳原子立体构型有变化且1个羟基缺失甲基化(r1)，特红醇酮的a环上的1个羟基氧原子有当归酸(angelicacid)侧链取代(r1＝ch3ch＝ch(ch3)co-)且e环上连接的1个烷基侧链较短(r2＝ch3-)。总体上，这类化合物核心结构的e环上n原子连接的侧链取代基(r)有很多变化。
根据这类化合物所共同具有的颜色(红色)和化学结构特点(含醇羟基和酮基等)，本发明人将这类化合物统称为红醇酮类化合物(redolones，化学结构通式见图1)。由于分子中含有环庚三烯酮环(c环)，因此红醇酮类化合物属于含环庚三烯酮环的天然产物。
在自然界中，具有环庚三烯酮环的天然产物很多，其生物活性或用途多样。例如，秋水仙素(colchicine)是一种生物碱，来自百合科植物秋水仙，具有抑制真核细胞有丝分裂的生物学功能；秋水仙素是一种治疗和预防急性痛风性关节炎的临床药物，它还被广泛应用于细胞学和遗传学研究以及植物育种。再例如，桧木醇(hinokitiol)是一种单萜类化合物，来自松柏科植物，具有良好的抗菌、保湿和忌避害虫效果。与其他含环庚三烯酮环的天然产物相比，红醇酮类化合物的显著结构特点是含有如上所述的稠合五环(abcde)核心结构；而红醇酮类化合物的生物活性，除了已知的抗氧化、抗炎症、抗自由基和抗寄生虫等之外，还有待挖掘与发现。
yijunyan等和xiaofengcai等在对红醇酮类化合物生物合成机制的研究过程中，分别报道了伯胺化合物(r-nh2)可以与红醇酮类化合物的前体发生非酶催化反应，前体分子中的吡喃环开环，然后与r-nh2中的n原子等生成红醇酮类化合物中的吡啶环(e环；图23)。这里的前体，在本发明中统称为黄醇酮类化合物(flavolones，通常为黄色物质；化学结构通式见图23)，包括原黄醇酮(isatropolones)和特黄醇酮(prerubterolones)等。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一类具有稠合五环(6-脱氧己糖，a环；呋喃，b环；环庚三烯酮，c环；环戊酮，d环；吡啶，e环)核心结构的红醇酮类化合物，它们具有激活细胞自噬的生物活性，以及基于红醇酮类化合物的激活细胞自噬的生物活性将其作为药物或药物组合物中的活性成分，用于治疗或预防肿瘤、病原微生物感染、免疫性疾病、ⅱ型糖尿病和神经退行性老年疾病等，以及紫外线照射/炎症导致的皮肤损伤或衰老。
本发明人对从北京市密云区的土壤中分离得到的一株链霉菌的次级代谢产物进行了研究(该菌株已于2018年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。该菌株的分类名称为streptomycessp.，保藏编号为cgmccno.15540)。经分离纯化和化学结构解析，确定该菌株所产生的主要次级代谢产物属于红醇酮类化合物，为原红醇酮c-f(isarubrolonesc-f)组分，其中原红醇酮e和f的分子中均含有1个新的含氮氧原子六元杂环，属于未见文献报道的新化合物；在此基础上，通过体内定向生物合成(invivodirectedbiosynthesis)和化学半合成等方法，理性化提高了原红醇酮e和f的发酵水平，以及获得了具有预期或特定r侧链的原红醇酮新组分化合物。
本发明首先涉及一组具有自噬激活活性的红醇酮类化合物，所述的红醇酮类化合物的化学结构如下式(ⅰ)所示，
其中，其核心结构为稠合五环；
其中，a环为6-脱氧己糖、b环为呋喃、c环为环庚三烯酮、d环为环戊酮、e环为吡啶；
取代基r1为-h、-ch3和-co(ch2ch＝chch3)；
取代基r2为碳原子数1～5的烷基或支链烷基，以及碳原子数1～5并带有1个羟基取代基的烷基或支链烷基；
取代基r源自通式为r-nh2所示的伯胺化合物，所述的伯胺化合物为nh3、胺类，氨基酸类；所述的胺类化合物优选为烷胺或芳胺。
并且，当r2基团含有羟基取代基且r基团含有羰基或羧基时，r2基团上的羟基与r基团的羰基或羧基可以发生环化反应，形成1个与吡啶环(e环)稠合的含氧氮杂原子的六元环(f环)。
优选的，所述f环为二氢噁嗪环；
最优选的，所述的含二氢噁嗪环的原红醇酮类化合物为原红醇酮e或原红醇酮f：
本发明还涉及所述化合物在制备具有自噬激活活性的制剂或药物中的用途。所述的激活自噬活性是指：
(1)剂量依赖性地上调细胞自噬蛋白atg4b、atg5和atg7等的水平，激活自噬泛素化系统，促进lc3b-i向lc3b-ii的转化，促进自噬体的形成和自噬流的畅通；
和(2)剂量依赖性地提高lc3b-ii/i的比值和选择性减少载体蛋白p62的水平，增强自噬溶酶体的功能。
所述的药物包括但不限于治疗如下疾病的药物：肿瘤、病原微生物感染、免疫性疾病、ⅱ型糖尿病、神经退行性疾病或紫外线照射/炎症导致的皮肤损伤及皮肤衰老。
本发明还涉及一种通过发酵产红醇酮类化合物的链霉菌生产所述红醇酮类化合物的方法，所述的方法包括如下步骤：
(1)种子培养；
(2)固态或液态发酵所述链霉菌，发酵过程中向培养基中加入伯胺化合物(r-nh2)，所述的伯胺化合物为nh3、烷胺类、芳香胺类、酮胺类、醇胺类、氨基酸类等；
(3)从发酵产物中分离纯化所述的红醇酮类化合物。
所述的链霉菌优选为链霉菌cgmccno.15540或刺孢红链霉菌streptomycesechinorubercgmcc4.1707t；最优选为链霉菌cgmccno.15540。
所述的固态或液态发酵的时间为6～8天。
所述的种子培养的方法为：
将零下80℃冷冻保藏的链霉菌cgmccno.15540孢子悬液，接种于斜面培养基，28℃培养7-10d，成为富含新鲜成熟孢子的斜面种子；
所述的斜面培养基为：可溶性淀粉10.0g/l，酵母提取物4.0g/l，麦芽提取物10.0g/l，葡萄糖4.0g/l，琼脂15.0g/l，ph6.0-7.0。
所述的固态发酵方法为：
取富含链霉菌cgmccno.15540新鲜成熟孢子的斜面种子，用无菌水或20％甘油将孢子洗下，振荡分散后取适量孢子悬液均匀涂布于isp2培养基平板，28℃培养8天；
所述的isp2培养基为：酵母提取物4.0g/l，麦芽提取物10.0g/l，葡萄糖4.0g/l，琼脂15.0g/l，ph6.0-7.0。
所述的液态发酵方法为：
取富含链霉菌cgmccno.15540新鲜成熟孢子的斜面种子，挖块接种于装有液体发酵培养基的摇瓶中，28℃摇床振荡培养6天，收集发酵液，经离心或过滤后得到发酵上清液；
所述的液体发酵培养基为：酵母提取物4.0g/l，麦芽提取物10.0g/l，葡萄糖4.0g/l，ph6.0-7.0。
所述的伯胺化合物(r-nh2)的加入浓度为1-40g/l(质量浓度)或10～1000mm(摩尔浓度)；
所述的芳香胺类化合物包括但不限于苯乙胺，色胺，组胺，酪胺等；
所述的酮胺类类化合物包括但不限于氨基丙酮，2-氨基-1-苯基-1-丙酮，5-氨基酮戊酸；
所述的醇胺类化合物包括但不限于例如乙醇胺，正丙醇胺，异丙醇胺，2-氨基正丁醇；
所述的氨基酸类化合物除常规的20种氨基酸外，还包括γ-氨基丁酸，α-氨基己二酸，邻氨基苯甲酸，5-氟-邻氨基苯甲酸，5-氯-邻氨基苯甲酸，间氨基苯甲酸，对氨基苯甲酸，3-氨基-2-甲基苯甲酸，3-羟基-2-氨基苯甲酸。
优选的，生产原红醇酮e、f和g时，添加的所述伯胺化合物分别为甘氨酸、苏氨酸或3-氨基-2-甲基苯甲酸，添加浓度为甘氨酸2.0g/l，苏氨酸12.0g/l，或3-氨基-2-甲基苯甲酸2.0g/l。
所述的从发酵产物中分离纯化所述的红醇酮类化合物的方法为：
1)发酵产物粗提获得一级产物；
2)使用ods中压色谱柱提纯一级产物，获得粗产物；
3)使用反相hplc提纯粗产物，分离不同组分，获得原红醇酮类化合物纯品。
所述的发酵产物粗提获得一级产物的方法是：
有机溶剂萃取固态发酵产物或大孔吸附树脂吸附液态发酵产物；
所述的有机溶剂优选为乙酸乙酯；
所述的大孔吸附树脂优选daionhp-20，使用甲醇-水、乙醇-水或丙酮-水解吸附目标化合物；
所述使用ods中压色谱柱提纯一级产物的方法中，洗脱系统为甲醇-水(含1‰hac)或乙醇-水(含1‰hac)；
所述的反相hplc提纯粗产物的方法中，洗脱系统为甲醇-水(含1‰hac)或乙腈-水(含1‰hac)。
本发明所述的红醇酮类化合物，最初来自微生物(例如放线菌)的次级代谢产物。例如，对于原红醇酮(isarubrolones)，可以通过链霉菌streptomyces
本发明人对多个红醇酮类化合物的生物活性进行了研究，发现它们均具有激活细胞自噬的生物活性。基于红醇酮类化合物化学结构的高度相似性，预期所有的红醇酮类化合物均具有激活细胞自噬的生物活性。尤其是红醇酮类化合物的细胞毒活性很低，因此基于其激活细胞自噬的生物活性，红醇酮类化合物有望作为药物或药物组合物中的活性成分，用于治疗或预防肿瘤、病原微生物感染、免疫性疾病、ⅱ型糖尿病和神经退行性老年疾病(例如帕金森症)等，以及紫外线照射/炎症导致的皮肤损伤或衰老。
为了获得本发明所述的红醇酮类化合物，以及测定其激活细胞自噬的生物活性，本发明采取了以下技术路线和步骤。
产生红醇酮类化合物的链霉菌(或其他放线菌)的培养与发酵：可以分别采用液态或固态模式：(1)液态模式，将链霉菌(或放线菌)的新鲜斜面(含丰富成熟孢子)，转接于液体种子培养基，在摇床上振荡培养一段时间后，转入液体发酵培养基，继续振荡培养一段时间后，收集发酵培养液。(2)固态模式，将链霉菌(或放线菌)的新鲜斜面种子(含丰富成熟孢子)用无菌水洗下，振荡分散后取适量孢子悬液均匀涂布于固态发酵培养基，静置培养一段时间后，收集发酵培养物。
为了提高发酵培养过程中的红醇酮类化合物产量，在发酵培养基中需要含有丰富碳源与氮源。碳源包括各种单糖(例如葡萄糖、果糖和核糖)、双糖(例如麦芽糖和蔗糖)和多糖(例如淀粉和糊精)等；氮源、特别是有机氮源，包括氨基酸、多肽和蛋白胨(动物、植物或微生物来源)、黄豆饼粉、棉籽饼粉、酵母粉、玉米浆和花生饼粉等。这些培养基成分除了为红醇酮类化合物产生菌的生长提供所必需的营养物质和能量之外，还用于提供菌体生物合成红醇酮类化合物分子骨架结构所需的各种前体物等。
为了获得具有特定或预期r侧链的红醇酮类化合物，在红醇酮类化合物产生菌的发酵培养基中或培养过程中，可以加入具有不同取代基(或侧链)的伯胺化合物(r-nh2)，包括但不限于烷胺类、芳香胺类(例如苯乙胺，色胺，组胺，酪胺等)、酮胺类(例如氨基丙酮，2-氨基-1-苯基-1-丙酮，5-氨基酮戊酸)、醇胺类(例如乙醇胺，正丙醇胺，异丙醇胺，2-氨基正丁醇)、氨基酸类(例如甘氨酸，丙氨酸，β-丙氨酸，苏氨酸，赖氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，色氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，精氨酸，脯氨酸，甲硫氨酸，半胱氨酸，γ-氨基丁酸，α-氨基己二酸，邻氨基苯甲酸，5-氟-邻氨基苯甲酸，5-氯-邻氨基苯甲酸，间氨基苯甲酸，对氨基苯甲酸，3-氨基-2-甲基苯甲酸，3-羟基-2-氨基苯甲酸)，这些伯胺化合物可以与黄醇酮类化合物发生反应，生成具有特定或预期r侧链的红醇酮类化合物(即体内定向生物合成)；体内定向生物合成还可以理性化提高具有特定或预期r侧链的红醇酮类化合物的发酵水平。此外，通过化学半合成方法，也就是以黄醇酮类化合物为前体，与伯胺化合物反应，也可以获得具有特定或预期r侧链的红醇酮类化合物。
红醇酮类化合物的分离纯化，根据固态或液态两种发酵模式，分别采用以下两种分离纯化流程：(1)固态发酵，发酵培养物用低级醇或酯提取，减压旋蒸提取液除去低级醇或酯，获得红醇酮类化合物粗提物；粗提物上ods中压制备色谱柱分离，洗脱系统为甲醇-水或乙醇-水，减压旋蒸除去洗脱溶剂，得到红醇酮类化合物半纯品；最后，经过制备型反相c18色谱柱hplc精制，洗脱系统为甲醇-水或乙腈-水，获得红醇酮类化合物(例如原红醇酮类化合物)纯品。(2)液态发酵，发酵液经离心或过滤除去菌体后，上清液用大孔吸附树脂(例如daionhp-20或d101)吸附，然后用乙醇-水、甲醇-水或丙酮-水洗脱，得到含有红醇酮类化合物的洗脱液，减压旋蒸除去洗脱溶剂，获得红醇酮类化合物粗提物；粗提物上ods中压制备色谱柱分离，洗脱系统为甲醇-水或乙醇-水，减压旋蒸除去洗脱溶剂得到红醇酮类化合物半纯品；最后，经过制备型反相c18色谱柱hplc精制，洗脱系统为甲醇-水或乙腈-水，获得红醇酮类化合物纯品。
将分离纯化得到的红醇酮类化合物纯品溶于氘代试剂中，通过nmr确定其化学结构。或者，将含红醇酮类化合物纯品(或半纯品、粗提物)，通过lc-ms测定，初步确定化学结构。本发明人对链霉菌cgmccno.15540产生的原红醇酮c-f的化学结构(见图2)进行了nmr确证或解析(nmr谱图见图3-22，核磁数据见表1-2)；对刺孢红链霉菌cgmcc4.1707t产生的玉红醇酮a，以及对原红醇酮g-j等进行了lc-ms确证。
本发明的有益效果：红醇酮类化合物具有由6-脱氧己糖(a)、呋喃(b)、环庚三烯酮(c)、环戊酮(d)和吡啶(e)组成的稠合五环核心结构，红醇酮类化合物具有激活细胞自噬的生物活性。利用红醇酮类化合物的激活细胞自噬生物活性，将其作为药物或药物组合物中的活性成分，应用于医药领域中治疗或预防肿瘤、病原微生物感染、免疫性疾病、ⅱ型糖尿病和神经退行性老年疾病等，以及紫外线照射/炎症导致的皮肤损伤或衰老。
附图说明
图1红醇酮类化合物的结构通式；
图2原红醇酮c-f的化学结构(虚线显示r侧链)；
图3原红醇酮c的1h核磁谱图；
图4原红醇酮c的13c核磁谱图；
图5原红醇酮c的1h-1hcosy核磁谱图；
图6原红醇酮c的hsqc核磁谱图；
图7原红醇酮c的hmbc核磁谱图；
图8原红醇酮d的1h核磁谱图；
图9原红醇酮d的13c核磁谱图；
图10原红醇酮d的1h-1hcosy核磁谱图；
图11原红醇酮d的hsqc核磁谱图；
图12原红醇酮d的hmbc核磁谱图；
图13原红醇酮e的1h核磁谱图；
图14原红醇酮e的13c核磁谱图；
图15原红醇酮e的1h-1hcosy核磁谱图；
图16原红醇酮e的hsqc核磁谱图；
图17原红醇酮e的hmbc核磁谱图；
图18原红醇酮f的1h核磁谱图；
图19原红醇酮f的13c核磁谱图；
图20原红醇酮f的1h-1hcosy核磁谱图；
图21原红醇酮f的hsqc核磁谱图；
图22原红醇酮f的hmbc核磁谱图；
图23黄醇酮类化合物与伯胺化合物(r-nh2)反应生成红醇酮类化合物的途径；
图24蛋白质免疫印迹法测定原红醇酮c的自噬激活活性；
图25蛋白质免疫印迹法测定原红醇酮f的自噬激活活性；
图26原红醇酮e和f的合成途径。
具体实施方式
实施例1、链霉菌cgmccno.15540的培养发酵(生产原红醇酮c-f)
斜面培养基：isp2(可溶性淀粉10.0g/l，酵母提取物4.0g/l，麦芽提取物10.0g/l，葡萄糖4.0g/l，琼脂15.0g/l，ph6.0-7.0)。
固体发酵培养基：isp2。
液体发酵培养基：酵母提取物4.0g/l，麦芽提取物10.0g/l，葡萄糖4.0g/l，ph6.0-7.0。
1、斜面(种子)：
将零下80℃冷冻保藏的链霉菌cgmccno.15540孢子悬液，接种于斜面培养基，28℃培养7-10d，成为富含新鲜成熟孢子的斜面种子。
2、培养发酵：
固态培养发酵：将上述链霉菌cgmccno.15540富含新鲜成熟孢子的斜面种子，用无菌水或20％甘油将孢子洗下，振荡分散后取适量孢子悬液均匀涂布于isp2培养基平板，平板直径约15cm，每个平板倒入约45ml培养基，28℃培养8d，收集发酵培养物，用于分离纯化原红醇酮c-f。
液态培养发酵：将上述链霉菌cgmccno.15540富含新鲜成熟孢子的斜面种子，挖块接种于装有液体发酵培养基的摇瓶(每个500ml摇瓶装有约100ml发酵培养基)中，28℃摇床振荡(200rpm)培养6d，收集发酵液，经离心或过滤后得到发酵上清液，用于分离纯化原红醇酮c-f。
实施例2、原红醇酮c-f的分离纯化
1、发酵产物粗提：
对于固态发酵培养物，取实施例1中固态发酵培养物约45l，加入等体积乙酸乙酯并搅拌，提取24-48h，收集乙酸乙酯提取液；如此反复提取2-3次，合并乙酸乙酯提取液。减压浓缩除去乙酸乙酯，得到约150g粗提物。
对于液态发酵培养物，采用离心(3500rpm，15-20min)或过滤等方法获得发酵上清液；将发酵上清液通过daionhp-20或d101大孔吸附树脂柱，吸附其中的红醇酮类化合物，然后用乙醇-水、甲醇-水或丙酮-水解吸附，经减压旋蒸除去解吸附溶剂后得到粗提物。
2、ods色谱柱分离半纯品：
用100-150ml甲醇复溶上述150g粗提物，与ods填料(200-300g，粒径50μm，货号aag12s50，日本ymc公司)拌匀后装入上样柱(内径41mm，长度230mm)中，ods色谱柱(内径49mm，长度460mm)分离；洗脱系统为甲醇-水(含1‰hac)，恒定流速25ml/min；洗脱梯度为：
10％甲醇-水洗脱30min，
30％甲醇-水洗脱40min，
60％甲醇-水洗脱40min，
70％甲醇-水洗脱60min，
90％甲醇-水洗脱60min，
100％甲醇洗脱30min。
每95ml收集1管，经tlc分析后合并相同组分收集管，得到20个合并组分(f1-f20)。经lc-ms分析，确定4个合并组分(f9、f12、f11和f10)分别主要含有原红醇酮c-f组分；经减压旋蒸除去洗脱溶剂后，得到原红醇酮c半纯品150mg、原红醇酮d半纯品7mg、原红醇酮e半纯品36mg和原红醇酮f半纯品34mg。
3、反相hplc制备纯品：
分别对上述原红醇酮c-f半纯品进行hplc精制，采用ymc-packods-a柱(250mm×10mm,s-5μm,12nm；色谱柱货号aa12s05-2510wt，日本ymc公司产品)分离制备。收集目标洗脱峰，经减压旋蒸除去洗脱溶剂后得到原红醇酮c纯品53.8mg、d纯品2.2mg、e纯品10.7mg和f纯品9.5mg。hplc洗脱条件如下：
原红醇酮c：50％甲醇-水(含1‰hac)等度洗脱，流速2.0ml/min，保留时间30min；
原红醇酮d：27％乙腈-水(含1‰hac)等度洗脱，流速1.5ml/min，保留时间40min；
原红醇酮e：27％乙腈-水(含1‰hac)等度洗脱，流速1.0ml/min，保留时间9min；
原红醇酮f：51％甲醇-水(含1‰hac)等度洗脱，流速1.5ml/min，保留时间36min。
原红醇酮c、d、e、f的nmr核磁数据分别见表1、表2所示。
表1、原红醇酮c、d的nmr核磁数据
表2、原红醇酮e、f的nmr核磁数据
实施例3体内定向生物合成原红醇酮e、f和g
isp2培养基：酵母提取物4.0g/l，麦芽提取物10.0g/l，葡萄糖4.0g/l，琼脂15.0g/l，ph6.0-7.0；
发酵培养基：isp2。
1、准备链霉菌cgmccno.15540种子(孢子悬液)：
链霉菌cgmccno.15540的新鲜孢子斜面(使用isp2培养基)，用无菌水或20％甘油将孢子洗下，振荡分散后获得孢子悬液。
2、链霉菌cgmccno.15540的定向发酵培养：
将孢子悬液涂布于添加了甘氨酸、苏氨酸或3-氨基-2-甲基苯甲酸的发酵培养基平板(平板直径约15cm，每个平板倒入约45ml培养基)上，28℃培养3-4d，收集发酵培养物。发酵培养基配方为：在isp2培养基基础上，分别添加甘氨酸2.0g/l(26.67mm)，苏氨酸12.0g/l(100.84mm)，或3-氨基-2-甲基苯甲酸2.0g/l(13.25mm)。
3、红醇酮类化合物的分离纯化：
采用实施例2中的分离纯化方法，获得具有特定或预期r侧链的红醇酮类化合物。
4、实验结果(表3)：
(1)在培养基中添加甘氨酸，理性化提高了原红醇酮e的水平(与不添加甘氨酸比较，提高了2.7倍)。原红醇酮e化学结构见表3，合成途径见图26。其中，甘氨酸的氨基与原黄醇酮c的开环中间体，更具体地是1,5-二酮结构单元，化学反应形成吡啶环(e环)，而来自甘氨酸的羧基与r2侧链上的羟基反应形成二氢噁嗪环(dihydro-1,4-oxazine，f环)。
表3体内定向生物合成原红醇酮(虚线显示r取代基)
(2)在培养基中添加苏氨酸，理性化提高了原红醇酮f的水平(与不添加苏氨酸比较，提高了7.1倍)。原红醇酮f化学结构见表3，合成途径见图26。其中，苏氨酸首先发生生物脱羧反应，所生成的氨基丙酮酸中的氨基与原黄醇酮c的开环中间体，更具体地是1,5-二酮结构单元，化学反应形成吡啶环(e环)，而来自氨基丙酮酸的酮基与r2侧链上的羟基反应形成二氢噁嗪环(dihydro-1,4-oxazine，f环)。
(3)在培养基中添加3-氨基-2-甲基苯甲酸，得到了预期的原红醇酮g(化学结构见表3)。
实施例4、化学半合成原红醇酮h、i和j
1、底物配制：
称取适量(200-500mg)甘氨酸、组氨酸或赖氨酸，溶于适量水或四氢呋喃中，用naoh溶液调节ph至弱碱性(ph8.0)，配制浓度均为100.0mm溶液。称取10-15mg原黄醇酮c纯品溶于适量四氢呋喃中，配制浓度20.0mm溶液。
2、化学反应：
分别取上述80.0μl甘氨酸、组氨酸或赖氨酸溶液，与上述20.0μl原黄醇酮c溶液混合，再加入2000μl水，混匀后37℃温育0.5-5.0h。
3、产物检测：
取20.0μl上述每种反应混合液进行lc-ms分析，检测具有特定或预期r侧链的原红醇酮化合物。lc条件为15％-70％乙腈-水(含1‰hac)系统洗脱20min，流速1.0ml/min，pda检测器(254、310、430和546nm)；ms条件为离子源esi(±)、碎裂电压120v等。
4、实验结果：
甘氨酸、组氨酸和赖氨酸均与原黄醇酮c发生了体外化学反应，产生具有特定或预期r侧链的原红醇酮化合物(表4)。其中：
(1)甘氨酸中的氨基与原黄醇酮c反应形成吡啶环(e环)，甘氨酸分子中的其余部分成为所生成的原红醇酮h的r侧链。
(2)组氨酸分子中的氨基与原黄醇酮c反应形成吡啶环(e环)，组氨酸分子中的其余部分成为所生成的原红醇酮i的r侧链。
(3)赖氨酸主要是分子中的ε-氨基与原黄醇酮c反应形成吡啶环(e环)，赖氨酸分子中的其余部分成为所生成的原红醇酮j的r侧链。
表4体外化学反应半合成原红醇酮(虚线显示r取代基)
对上述反应体系放大(10-100倍)并采用实施例2中的分离纯化方法，可以制备用于nmr分析，以及激活细胞自噬活性测定的化合物纯品。
实施例4红醇酮类化合物的激活细胞自噬生物活性测定
采用蛋白质免疫印迹法对2个红醇酮类化合物(原红醇酮c和f)处理的肝癌细胞株hepg2的自噬体泛素化相关蛋白和自噬流标志蛋白进行含量检测，以未经化合物处理的hepg2细胞为对照，通过对这些蛋白水平变化的综合分析，评价这2个红醇酮类化合物对细胞自噬活性的影响。原红醇酮c和f的母液浓度均为10mm，检测浓度均设置为1、5、10和20μm。按照以下程序完成细胞自噬活性测定。
1、细胞培养和测试化合物处理：
(1)细胞复苏：从液氮罐中将冻存的人肝癌细胞hepg2细胞取出，迅速置于37℃水浴中，直至冻存细胞完全融化。
(2)细胞培养：将hepg2细胞悬液加入适量mem(10％fbs)细胞培养液，混匀后置于5％co2培养箱中，37℃培养。
(3)细胞传代：待细胞达到70％-80％融合后，弃培养液，加入pbs缓冲液洗涤2次，0.05％胰蛋白酶37℃消化2min，加入含血清培养基终止消化；收集细胞悬液置于离心管中，800rpm离心5min，弃上清，加入新培养液重悬细胞，按1:3的比例传代。
(4)红醇酮类化合物处理细胞：将hepg2细胞培养至80％左右的汇合度，分别给予不同浓度的测试化合物，同时以未给测试化合物的细胞为对照，继续培养24h；吸除培养液，pbs缓冲液洗两次，0.25％胰酶消化收集细胞，pbs缓冲液洗2次。
2、westernblot检测：
(1)蛋白样品制备：采用试剂盒提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度；取上样蛋白量加入上样缓冲液，100℃加热10min；涡旋、离心，去上清，可-80℃长期保存或准备上样。
(2)sds-page电泳：参照《蛋白质技术手册》(汪家政等，2000年)制备sds-聚丙烯酰胺凝胶。电泳条件：初始电压80v、约30min后样品进入分离胶，然后将电压调至120v进行电泳，直至电泳结束。
(3)转膜：与胶同样大小的6张滤纸、1张硝酸纤维素膜(nc)浸入转移缓冲液中平衡15min；将sds-page胶板置于转移缓冲液中平衡5min；将凝胶放在6层滤纸之间、与nc膜(其下方)相邻，各层之间去气泡和皱折。在恒流200ma，冰浴条件下转膜1.5h。
(4)抗体杂交：转移后的nc膜在10％脱脂奶粉/tbst中封闭1h；tbst洗膜1-2次，10min/次；分别加入不同一抗与nc膜温育，抗体分别为：
抗人的atg4a(抗atg4a，兔igg；cellsignalingtechnology)；
抗人的atg4b(抗atg4b，兔igg；cellsignalingtechnology)；
抗人的atg5(抗atg5，兔igg；novusbiologicals)；
抗人的atg7(抗atg7，兔igg；cellsignalingtechnology)；
抗人的p62(抗p62，兔igg；mbl)；
抗人的lc3b(抗lc3b，小鼠igg；mbl)；
以及对照：抗人的gapdh(三磷酸甘油醛脱氢酶)抗体(anti-gapdh，中国zsgb-bioco.)。
然后放于平缓摇动摇床上，4℃过夜。tbst洗涤。将滤膜置于新的平皿中，加入二抗：
偶联辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠igg，
偶联辣根过氧化物酶的山羊抗兔igg，
偶联辣根过氧化物酶的兔抗山羊igg；中国zsgb-bioco.，
室温温育1h；tbst洗涤数次；把滤膜置于一新的平皿中，加入化学发光显色液
(5)ecl显影：在铝箔包裹的1.5ml离心管中，等体积混合ecl反应试剂盒中的a和b液；将上述反应液滴满膜表面，曝光后保存图像。
3、实验结论：
原红醇酮c和f均可浓度依赖性地上调hepg2细胞中的自噬蛋白atg4b、atg5和atg7的水平1-3倍，以及上调(即升高)lc3b-ii/i的比值1-3倍，并同时降低自噬蛋白atg4a和p62的水平(图24-25)，表明它们具有显著的激活细胞自噬和促进细胞自噬流畅通的生物活性。
最后需要说明的是，以上实施例仅帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用做对本发明保护范围的限定。
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