一种抗虫基因T-DNA载体及其应用的制作方法

文档序号：16270611发布日期：2018-12-14 22:13阅读：187来源：国知局

本发明涉及一种抗虫基因t-dna载体的构建及其应用。

(二)背景技术

害虫给全球农业生产带来每年约80亿美元的损失，害虫的防治目前主要依靠使用化学农药，但是农药的残留会对人体健康和环境带来不良影响。利用生物技术方法培育含有抗虫基因的转基因抗虫农作物，可以大幅度降低化学杀虫剂的使用，有效保护农作物免受害虫为害，目前转基因抗虫玉米、棉花等已经大量推广种植。

转基因作物抗虫的关键技术是获得性能优良的杀虫蛋白质，杀虫蛋白质有多种。比较常用的是bt杀虫晶体蛋白，如cry1ab、cry1c等，它们已被大量运用于转基因抗虫作物；近年来在bt中发现的另一种营养期杀虫蛋白也被证明具有较好的抗虫活性，如vip3a等。单个杀虫毒素往往杀虫谱比较窄；同时，长期大量地使用单一的杀虫蛋白质，还可能引起害虫抗性的产生和发展。因此，获得高杀虫活性的新型蛋白质杀虫毒素，对提高杀虫能力和减缓害虫抗性的发生具有重要的应用价值。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种高表达抗虫蛋白的重组载体的dna序列及其构建方法，以及在获得转基因抗虫农作物中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种抗虫基因t-dna载体，所述t-dna载体包含了一个具有花椰菜花叶病毒camv35s启动子以及水稻肌动蛋白actin1内含子序列来启动抗虫基因表达的完整表达框，具体所述t-dna载体包含抗虫基因表达框，所述抗虫基因表达框是由抗虫基因、复合启动子和终止子拼接构成；复合启动子由camv35s和actin-intron拼接而成。

进一步，所述的抗虫基因由cry1ab和vip3a连接而成。

进一步，所述抗虫基因是将编码bt杀虫晶体蛋白cry1ab的核苷酸序列(seqidno:1所示)与编码bt营养期杀虫蛋白vip3a的核苷酸序列(seqidno:2所示)通过连接肽基因序列连接构成，完整的抗虫基因的核苷酸序列为seqidno:3所示。

进一步，所述camv35s核苷酸序列为seqidno:4所示，所述actin-intron核苷酸序列为seqidno:5所示。

进一步，所述终止子为终止子pepc-ter，核苷酸序列为seqidno:6所示。

本发明所述t-dna核苷酸序列为seqidno:7所示。

本发明还涉及一种所述抗虫基因t-dna载体在制备抗虫植物细胞中的应用，所述植物为单子叶植物，优选为玉米或水稻。

本行业的技术人员均知道以下理论：

1)一种用于制备抗虫植物细胞的转化载体中必须包含整个抗虫基因的表达框，由启动子、基因、终止子三个组件构成；

2)并非任意的启动子都能高效启动抗虫基因的表达，不同的启动子对于抗虫蛋白的表达效果相差很大。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

1)由camv35s与水稻肌动蛋白actin1内含子序列拼接而成的复合启动子，可以高效启动抗虫基因的表达；

2)将上述抗虫基因的表达框的t-dna转入植物后，获得的转基因株系中抗虫蛋白的表达量能够显著提高。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明以下实施例中所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在ausubel编写的johnwileyandsons公司出版的currentprotocolsinmolecularbiology，和j.sambrook等编写的coldspringharborlaboratorypress(2001)出版的molecularcloning:alaboratorymanual,3^rded.等文献均有详细的说明。

实施例1、抗虫基因表达框的构建

由上海生工人工合成抗虫基因cry1ab核苷酸序列为seqidno:1，vip3a核苷酸序列为seqidno:2，cry1ab基因与vip3a基因通过连接肽基因序列连接为一个完整的抗虫基因，该抗虫基因的序列为seqidno:3。由上海生工人工合成启动子camv35s的核苷酸序列为seqidno:4，编码水稻肌动蛋白的内含子actin-intron核苷酸序列为seqidno:5。

抗虫基因的构建过程：cry1ab片段由bamhi和xmai酶切获得，vip3a片段由xmai和saci酶切获得。将上述两个片段以t4dna聚合酶连接到中间载体中，得到一个两端的酶切位点为bamhi和saci的完整的抗虫基因。

启动子35s/actin-intron的构建过程：camv35s片段由hindiii和xhoi酶切获得，actin-intron片段由xhoi和bamhi酶切获得。将上述两个片段以t4dna聚合酶连接到中间载体中，得到一个两端的酶切位点为hindiii和bamhi的完整的复合启动子。将上述完整的抗虫基因和完整的复合启动子分别酶切，连同终止子(玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的终止子pepc-ter，序列为seqidno:6)连接到转化载体pcambia1300-g10(zhao,q.,etal.(2014)"expressionofcry1abandcry2abbyapolycistronictransgenewithaself-cleavagepeptideinrice."plosone9(10):e110006.)中，得到用于制备植物抗虫细胞的转化载体pcam-1ab-v3a，载体中t-dna部分的序列为seqidno:7。

相同条件下，以水稻肌动蛋白启动子posactin1替换上述p35s/actin-intron，其余均保持一致，作为对照组ck。所得的对照t-dna载体用于转化制备植物抗虫细胞。

实施例2、转基因玉米的获得

玉米转化事件所用的方法是农杆菌介导方法，根据frame等报道的方法和培养基配方(plantphysiol,2002,129:13-22)进行转化，具体步骤如下：取授粉后8～10天的hi-2玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小为1.0～1.5mm)，将含有实施例1构建的t-dna载体pcam-1ab-v3a的农杆菌与未成熟胚共培育2～3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上挂(含200mg/l的timentin杀农杆菌)，28℃暗培养10～14天。将所有的愈伤组织转移到带有2.0mm草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2～3周。

转移所有的组织到新鲜的筛选培养基上，28℃暗培养2～3周。随后转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基上，28℃暗培养10～14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10～14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基上，26℃光照培养直到根发育完全，获得转基因玉米植株。

同样条件下，用含对照组t-dna载体的农杆菌转化玉米，获得对照转基因玉米植株。

实施例3、转基因农作物抗虫能力的测定

利用玉米螟和棉铃虫测定通过实施例2获得的10个转基因玉米系的抗虫活性。取实施例2获得的转基因玉米嫩叶饲喂一龄幼虫，每叶接虫10头，28℃暗培养5天后记录数据。新生玉米螟一龄幼虫取食10个转基因玉米系后，全部100％死亡；新生棉铃虫一龄幼虫取食10个转基因玉米系后，有8个系的棉铃虫100％死亡，其他两个系的棉铃虫死亡率在60％～90％之间。

同时，通过实施例2的方法，在玉米中转入对照组ck的t-dna，获得posactin1启动抗虫基因表达的对照转基因玉米株系。利用玉米螟和棉铃虫进行上述抗虫活性鉴定。结果显示，新生玉米螟一龄幼虫取食10个转基因玉米系后，全部100％死亡；新生棉铃虫一龄幼虫取食10个转基因玉米系后，有2个系的棉铃虫100％死亡，其余6个系的棉铃虫死亡率在30％～60％之间。

进一步，对转基因玉米株系进行抗虫蛋白的elisa鉴定。结果显示，在转基因株系中，p35s/actin-intron启动抗虫蛋白的表达量比对照组中高10-30倍(如下表1所示)。

表1转基因玉米株系中的抗虫蛋白表达量测定

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多延伸和拓展。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接到导出或联想到的所有延伸，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种抗虫基因t-dna载体及其应用

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1966

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>1

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<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>2

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<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>3