本发明涉及病虫防害领域，具体而言，涉及一种生物防治剂、生物有机肥及其应用。
背景技术
尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生。其中，香蕉枯萎病导致香蕉的维管束坏死，茎叶萎蔫甚至全部枯死，严重影响了香蕉产业的发展。
目前，针对植物枯萎病，尤其是香蕉枯萎病的防控方法主要包括：化学防治、抗病品种培育、农业防控措施及生物防控等，前三种措施存在污染环境、成本较高和防效不稳定等问题，而生物防控具有环境友好型特点，是目前公认比较安全和有效的防控措施，已成为研究的热点。
菌株号为h-6，保藏号为cgmccno.13549的贝莱斯芽孢杆菌由申请人新近筛选获得，该菌对尖孢镰刀菌具有很强的平板抑制效果，对植物枯萎病，尤其是香蕉枯萎病具有优良的生防效果(参见公开号为cn107312734a的中国发明专利申请)。但经过进一步研究发现，所述贝莱斯芽孢杆菌受土著微生物的影响，无法长期在土壤中定殖存活，对植物枯萎病的防控作用逐渐减弱，在施用贝莱斯芽孢杆菌的第2、3年，其对尖孢镰刀菌的抑制作用降低，植物枯萎病的发病率回升。有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种生物防治剂，所述生物防治剂能够长期、持续地抑制尖孢镰刀菌，对植物枯萎病，尤其是香蕉枯萎病具有长效的防控作用。
本发明的第二目的在于提供一种生物有机肥，所述生物有机肥包括前述生物防治剂和有机载体，所述有机载体能够为所述生物防治剂提供附着位点以及生长所需养分，有利于微生物定殖，并改善土壤理化和生物性质，促进植物生长，减少病害发生。
本发明的第三目的在于提供前述生物防治剂或生物有机肥在防控由尖孢镰刀菌引发的病害中的应用。
本发明的第四目的在于提供前述生物防治剂的制备方法，所述方法操作简单、成本低、性价比高，便于规模化生产。
本发明的第五目的在于提供前述生物有机肥的制备方法，所述方法操作简单、成本低、性价比高，便于规模化生产。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种生物防治剂，所述生物防治剂包括贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、多粘芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)和解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)，其中：
所述贝莱斯芽孢杆菌的菌株号为h-6，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为cgmccno.13549；
所述枯草芽孢杆菌的菌株号为h-1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为cgmccno.13547；
所述多粘芽孢杆菌的菌株号为h-5，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为cgmccno.13548；
所述解淀粉芽孢杆菌的菌株号为h-7，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为cgmccno.13550。
本发明所述生物防治剂包括菌株号为h-6的贝莱斯芽孢杆菌、菌株号为h-1的枯草芽孢杆菌、菌株号为h-5的多粘芽孢杆菌和菌株号为h-7的解淀粉芽孢杆菌，上述微生物之间相互配合，能够在土壤中形成稳定的、能防控尖孢镰刀菌的优势菌群，从而长期有效地抑制尖孢镰刀菌的生长，进而长效防控由尖孢镰刀菌引发的植物病害。
在一些具体的实施方式中，所述生物防治剂为液体制剂，优选地，所述液体制剂中的总活菌数为1×109-10cfu/ml。
在一些具体的实施方式中，在所述液体制剂中，所述贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的活菌数比为1～2:1～2:1～2:1，优选地，所述贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的活菌数比为1:1:1:1。
本发明还涉及一种生物有机肥，所述生物有机肥包括前述的生物防治剂和有机载体。
本发明所述方案将前述生物防治剂与有机载体制成生物有机肥，其中，有机载体一方面可为前述生物防治剂中的微生物生长提供养分，有利于所述微生物在土壤中的存活和定殖，从而在植物根际构建拮抗菌群落体系，保障其在防控中的应用效果，可显著提高生防效率；再者，所述有机载体还能够改善土壤理化和生物性质，促进植物生长，减少病害发生。
在一些具体的实施方式中，所述生物有机肥经所述生物防治剂和所述有机载体发酵而成，优选地，所述有机载体为畜禽粪便堆肥，例如，牛粪堆肥、羊粪堆肥或者马粪堆肥。
在一些具体的实施方式中，所述生物有机肥的总活菌数为1.0×108-9cfu/g干样，优选地，所述生物有机肥的总活菌数为1.0×108cfu/g干样。
本发明还涉及前述生物防治剂或前述生物有机肥在防控由尖孢镰刀菌引发的病害中的应用。本发明所述应用能够拮抗尖孢镰刀菌，有效地防控相应病害的发生，提高生防率。
在一些具体的实施方式中，所述病害为植物枯萎病，优选为香蕉枯萎病。
在一些具体的实施方式中，所述生物防治剂或生物有机肥，与土壤改良剂联用，优选地，所述土壤改良剂为有机土壤改良剂或无机土壤改良剂。
作物长期连作容易导致土壤酸化严重，而土壤的ph值对尖孢镰刀菌在土壤中增殖的影响非常显著，随着酸化程度的增加，尖孢镰刀菌增殖速率显著增加。为解决上述技术问题，本发明所述应用将前述生物防治剂或生物有机肥与土壤改良剂联用，起到协同防控尖孢镰刀菌引起的病害，如香蕉枯萎病的作用，其中，土壤改良剂能够改善香蕉根际土壤酸性环境，有利于拮抗菌的存活与繁殖，进而防控枯萎病发生。
在一些具体的实施方式中，所述有机土壤改良剂为堆肥产品，例如牛粪堆肥产品。
在一些具体的实施方式中，所述无机土壤改良剂由如下按质量分数计的组分组成：
含磷物质30～67份，改酸物质30～67份，微量元素物质2～5份；所述的含磷物质为磷矿粉、过磷酸钙、钙镁磷肥和钢渣磷肥中的一种或至少两种混合物；所述的改酸物质为熟石灰、碱渣和粉煤灰中的一种或至少两种混合物；所述的微量元素物质为硫酸镁、硫酸锌和硼砂中的一种或至少两种混合物。
本发明所述应用还对无机土壤改良剂的具体组分做出限定，所述无机土壤改良剂能够在较好的中和土壤中的酸的同时，明显增加土壤有效磷含量及补充酸性土壤中较缺乏的镁、锌和硼等营养元素，有助于改善土壤营养状况，从而改善种植于酸性土壤上的各种作物的生长。
本发明还涉及前述生物防治剂的制备方法，所述方法包括：使用lb培养基培养前述贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌和/或解淀粉芽孢杆菌；优选地，具体培养条件为：在25～35℃下，150～200r/min的条件下进行培养；更优选的，具体培养条件为，在30℃下，170r/min的条件下进行培养。
进一步的，本发明所述制备方法包括：将前述贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌接种于新鲜的lb试管培养基中，摇床培养过夜后获得拮抗菌种子液，培养条件为30℃，170r/min；将上述种子液按照2％比例转接至装有新鲜的lb培养基的三角瓶中，摇床培养3天，检测各拮抗菌的数量，达1.0×109cfu/ml后将菌液离心，离心条件为：10000r/min，5min，弃上清，收集菌体，用原菌液1/4体积量的无菌水重悬，将重悬后的菌液混合，即得生物防治剂，所述生物防治剂中各拮抗菌的活菌数为1.0×109cfu/ml。
本发明还涉及前述生物有机肥的制备方法，所述方法包括：将所述有机载体与所述生物防治剂按照体积质量比0.8～1.5l：5kg的比例混合，调节混合物的水分至50wt％～60wt％，进行好氧发酵，发酵结束后，所述发酵产物降温至35℃以下后干燥所述堆体水分含量至30wt％～40wt％，即得所述生物有机肥。
在一些具体的实施方式中，所述有机载体、辅料与生物防治剂按照体积质量比0.8～1.5l：0.3～0.7kg：5kg的比例混合，调节混合物的水分至50wt％～60wt％，进行好氧发酵，发酵结束后，降温至35℃以下后干燥所述堆体水分含量至30wt％～40wt％，即得所述生物有机肥。
在一些具体的实施方式中，在发酵结束后所述发酵产物降温至35℃以下时，在所述发酵产物中加入所述生物防治剂，所述生物防治剂的加入量与发酵之前所述有机载体的体积质量比为0.8～1.5l：5kg。
在一些具体的实施方式中，所述发酵条件还包括：每隔2d翻堆一次所述发酵产物；每隔1h通风6min，通风量为30l/min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所述生物防治剂包括菌株号为h-6的贝莱斯芽孢杆菌、菌株号为h-1的枯草芽孢杆菌、菌株号为h-5的多粘芽孢杆菌和菌株号为h-7的解淀粉芽孢杆菌，上述微生物之间相互配合，能够在土壤中形成稳定的、有利于防控尖孢镰刀菌的优势菌群，长效抑制尖孢镰刀菌的生长，从而持续防控由尖孢镰刀菌引发的植物病害。
(2)本发明所述生物有机肥包括生物防治剂与有机载体，所述有机载体可为前述生物防治剂中的微生物生长提供养分，有利于所述微生物在土壤中的存活和定殖，提高植物根际拮抗菌数量，有利于在植物根际构建拮抗菌群落体系，保障其在防控中的应用效果，可显著提高生防效率；再者，所述有机载体还能够改善土壤理化和生物性质，促进植物生长，减少病害发生。
(3)本发明所述生物防治剂或生物有机肥与土壤改良剂联用，能够起到协同防控尖孢镰刀菌引起的病害，如香蕉枯萎病的作用，其中，土壤改良剂能够改善植物根际土壤酸性环境，使其有利于拮抗菌的存活与繁殖，从而提高植物根际拮抗菌数量，进而防控枯萎病发生。
(4)本发明所述无机土壤改良剂能够在较好的中和土壤中的酸的同时，明显增加土壤有效磷含量；并且，能够补充酸性土壤中较缺乏的镁、锌和硼等营养元素，有助于改善土壤营养状况，从而改善种植于酸性土壤上的各种作物的生长。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
具体实施方式涉及菌株h-1、h-5、h-6和h-7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体保藏信息如表1所示。
表1菌株h-1、h-5、h-6和h-7的保藏信息
实施例1生物防治剂
按照以下方法制备生物防治剂，具体包括：
分别挑取h-1、h-6和h-7的单菌落，接种于新鲜的lb试管培养基中；挑取h-5单菌落接种于tsa试管培养基中。摇床培养过夜后获得拮抗菌种子液，培养条件为30℃，170r/min。
将上述种子液按照2％比例转接至装有新鲜的lb或tsa培养基的三角瓶中，摇床培养3天，培养条件为30℃，170r/min；检测所述三角瓶中拮抗菌的数量，达1.0×109cfu/ml后将菌液离心，离心条件为：10000r/min，5min，弃上清，收集菌体。
用原菌液1/4体积量的去离子水将菌体重悬，4种菌液混合后充分混匀，即得所述生物防治剂，所述生物防治剂中各拮抗菌的活菌数为1.0×109cfu/ml。
实施例2生物有机肥
按照以下方法制备生物有机肥，具体包括：
在50kg牛粪堆肥中添加5kg花生麸和5kg菜籽粕混合均匀，接入12l实施例1所述生物防治剂，调节混合后的堆体含水量至50wt％～60wt％，拮抗菌在堆体中的初始浓度约为108cfu/g干样。充分搅拌均匀，使堆体养分和水分含量保持均一，所述堆体置于堆肥反应器中开始发酵，每隔2d翻堆一次所述堆体；每隔1h通风6min，通风量为30l/min；所述堆体维持高温35～45℃达5d左右，降温至35℃以下后，干燥所述堆体水分含量至30wt％～40wt％，获得生物有机肥。
实施例3
按照以下方法制备无机土壤改良剂，具体包括：将100目磷矿粉300kg、100目熟石灰670kg、100目硫酸镁22kg、100目硫酸锌5kg、100目硼砂3kg置于搅拌机中，搅拌均匀，得到酸性土壤改良剂。
对比例1
按照以下方法制备生物防治剂，具体包括：
挑取h-6的单菌落，接种于新鲜的lb试管培养基中。摇床培养过夜后获得拮抗菌种子液，培养条件为30℃，170r/min。
将上述种子液按照2％比例转接至装有新鲜的lb培养基的三角瓶中，摇床培养3天，培养条件为30℃，170r/min；检测所述三角瓶中拮抗菌的数量，达1.0×109cfu/ml后将菌液离心，离心条件为：10000r/min，5min，弃上清，收集菌体。
用原菌液的体积量的去离子水将菌体重悬，混合均匀，即得所述生物防治剂，所述生物防治剂中h-6的活菌数为1.0×109cfu/ml。
对比例2
按照以下方法制备生物防治剂，具体包括：
分别挑取h-1和h-7的单菌落，接种于新鲜的lb试管培养基中；挑取h-5单菌落接种于tsa试管培养基中。摇床培养过夜后获得拮抗菌种子液，培养条件为30℃，170r/min。
将上述种子液按照2％比例转接至装有新鲜的lb或tsa培养基的三角瓶中，摇床培养3天，培养条件为30℃，170r/min；检测所述三角瓶中拮抗菌的数量，达1.0×109cfu/ml后将菌液离心，离心条件为：10000r/min，5min，弃上清，收集菌体。
用原菌液1/3体积量的去离子水将菌体重悬，3种菌液混合后充分混匀，即得所述生物防治剂，所述生物防治剂中各菌的活菌数为1.0×109cfu/ml。
对比例3
按照实施例2所述方法制备生物有机肥，区别仅在于，用对比例1所述生物防治剂替换实施例1所述生物防治剂。
对比例4
按照实施例2所述方法制备生物有机肥，区别仅在于，用对比例2所述生物防治剂替换实施例1所述生物防治剂。
实验例1
在大田试验中检测实施例1～3所述生物防治剂、生物有机肥、无机土壤改良剂以及对比例1～4所述生物防治剂和生物有机肥对香蕉枯萎病的防控效果，具体实验设置、试验方法以及检测结果如下所示。
实验设置：
第1组：空白对照，未添加任何生物防治剂、生物有机肥或土壤改良剂。
第2组：在育苗基质中加入1％实施例1所述生物防治剂，在所述蕉苗移植至大田时，按1kg/株施加实施例1所述生物防治剂。
第3组：在育苗基质中加入4％实施例2所述生物有机肥，在所述蕉苗移植至大田时，按5kg/株施加实施例2所述生物有机肥。
第4组：在育苗基质中加入4％实施例2所述生物有机肥，在所述蕉苗移植至大田时，按5kg/株施加实施例2所述生物有机肥，并在移苗之前按60kg/亩在大田土壤中施实施例3所述无机土壤改良剂。
第5组：参照第2组进行处理，区别仅在于，所述生物防治剂为对比例1所述生物防治剂。
第6组：参照第2组进行处理，区别仅在于，所述生物防治剂为对比例2所述生物防治剂。
第7组：参照第3组进行处理，区别仅在于，所述生物有机肥为对比例3所述生物有机肥。
第8组：参照第4组进行处理，区别仅在于，所述生物有机肥为对比例4所述生物有机肥。
具体试验方法如下所示：
1、育苗：在育苗基质中培育蕉苗。
2、选择大田土壤：选择连续多年种植香蕉、已经酸化的土壤用于移植蕉苗。
3、移苗：连同育苗基质，将步骤1所述蕉苗移植入大田土壤。
4、防控效果评价：统计蕉苗在第1～2年生长过程中的发病率、生防率(生防率计算公式为：生防率(％)＝(当年对照发病率-当年实验例发病率)/当年对照发病率*100)、土壤中尖孢镰刀菌和芽孢杆菌的数量，具体检测结果如表2所示。
根据表2所示实验结果可知，在大田试验中，贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的联用有利于在土壤中形成优势种群，而生物有机肥中的有机载体的存在为上述拮抗菌在土壤中的生长和定殖亦提供了养分，综合作用使其对尖孢镰刀菌和香蕉枯萎病具有长效抑制作用，生防效果突出，进一步将无机土壤改良剂与生物有机肥联合使用可以进一步增加所述生物有机肥的生防功效。
表2大田试验结果
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。