一种与苏淮猪肌内脂肪含量相关的SNP标记引物对及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种与苏淮猪肌内脂肪含量相关的snp标记引物对及其应用。

背景技术

肌内脂肪(imf)是影响肉质的一个重要指标。研究表明肌内脂肪含量与肉质相关的性状(延展性、多汁性、口味等)呈正相关。猪肉是人们餐桌上的主要肉类之一。数据显示，2016年中国年消费猪肉总量排名世界第一。人们对猪肉的喜爱程度可见一斑。80年代以来，为满足国内市场对猪肉消费量的需求，各地普遍推广应用杜长大杂交组合生产商品瘦肉猪，如杜洛克猪、长白猪、大白猪。但在追求高产的同时，也导致了猪肉品质的严重下降。近年来，伴随着经济增长，人们生活品质快速提升，对猪肉品质的要求也从数量转变为同时追求质量和数量，市场需求方向的转变引导着猪育种思路的改变。虽然肌内脂肪遗传力较高(0.52)，但肌内脂肪活体测定难准确性不高，常规选育困难，因此鉴别影响苏淮猪肌内脂肪的基因位点，利用分子标记辅助选育技术提升猪的肌内脂肪性状具有重要意义。

苏淮猪是由淮安市淮阴种猪场、南京农业大学、江苏省畜牧总站和淮安市农业委员会等单位于1998年开始培育，2011年3月25日获得国家畜禽遗传资源委员会新品种授权，证书为“(农01)新品种证字第18号”。苏淮猪是在新淮猪基础上再导入大白猪血统，通过横交、多世代选育而成，含新淮猪血统50％，大白猪血统50％。近期的一些研究发现，苏淮猪肌内脂肪变异系数较大，且肌内脂肪含量平均值为(1.99±0.04)％，而根据众多的研究结果表明，3.0％-4.0％的肌内脂肪含量是新鲜优质猪肉的一个理想范围。由此可见，对苏淮猪肉质的持续选育已迫在眉睫。

根据猪qtl数据库网站(http://www.animalgenome.org/cgi-bin/qtldb/ss/index)知，目前在猪除16号染色体上没有定位到影响肌内脂肪含量的qtl，其它染色体上都已定位到影响肌内脂肪的qtl，但大部分是利用微卫星标记定位的qtl，置信区间多在10-20cm，无法确定真正的主效基因及其关键变异位点，因此难以直接应用于种猪选育改良。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对猪传统肌内脂肪选育耗时费力，选育效果不佳，提供与苏淮猪肌内脂肪相关的snp标记并将其开发为分子标记。

本发明的另一个目的在于提供用于检测上述snp标记的引物对和检测方法。

本发明的另一个目的在于提供上述snp标记的用途。

一种开发与苏淮猪肌内脂肪性状相关的分子标记的方法，以含有国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体rs80912566核苷酸位点的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以苏淮猪基因组dna为模板进行pcr扩增，使国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体rs80912566核苷酸位点转化为分子标记。

所述的引物对序列为上游引物：seqidno：2，下游引物：seqidno：3。

按照上述的方法得到的分子标记。

所述的分子标记序列优选如seqidno：1所示，所述的国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体rs80912566核苷酸位点在seqidno：1中位于第288位，存在c/t多态性。

一种用于检测与苏淮猪肌内脂肪性状相关的snp标记的引物对，上游引物为：seqidno：2，下游引物为：seqidno：3；所述的与苏淮猪肌内脂肪性状相关的snp标记位于猪14号染色体上的scd基因的核苷酸序列上，所述snp标记的位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体rs80912566核苷酸位点的分子标记,且具有c/t多态性，所述snp标记与苏淮猪肌内脂肪含量显著相关。

一种检测所述的与苏淮猪肌内脂肪性状相关的snp标记的方法，包含pcr扩增苏淮猪国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体rs80912566核苷酸位点的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的c/t多态性。

所述的方法优选包括以下步骤：

(1)取苏淮猪组织样品提取总dna；

(2)用已提取的苏淮猪基因组dna为模板，使用权利要求5所述的引物对进行pcr扩增；

(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在seqidno：1第288位的c/t多态性。

本发明所述的分子标记、所述的引物对在筛选高肌内脂肪苏淮猪群体中的应用。

一种筛选高肌内脂肪苏淮猪群体的方法，包括检测苏淮猪国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体rs80912566核苷酸位点的基因型，选育rs80912566核苷酸位点的tt型个体优先作为种猪。

有益效果：

本发明提供的snp标记与苏淮猪肌内脂肪含量相关，基于该snp开发的分子标记及引物可用于snp的检测。因此，可以通过鉴定该snp标记来筛选高肌内脂肪苏淮猪品系，所得的高肌内脂肪含量苏淮猪品系具有重要的经济效益与社会价值。

附图说明

图1为scd基因rs80912566位点扩增胶图

图2为scd基因rs80912566位点分型图示例。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1：

1试验动物来源

江苏省淮安市淮阴种猪场

2提取苏淮猪基因组dna

采集314头苏淮猪组织样样4份/头，其中1份用于个体dna提取；

参考天根生物科技公司组织dna提取试剂盒说明书，提取按以下步骤顺序进行：

①先在缓冲液gd和漂洗液pw中分别加入68ml和200ml无水乙醇，充分混匀。

②采集组织样约100mg置于2mlep管内，完全剪碎后加200μl缓冲液ga，振荡至彻底悬浮。

③加入20μl蛋白酶k溶液，混匀后放在56℃金属浴中消化过夜，直至耳样组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

④加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，放在70℃金属浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

⑤加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

⑥将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中，吸附柱放入收集管中，随后以12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。

⑦向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中

⑧向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，以12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

⑨重复操作步骤⑧。

⑩将吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，将离心得到的溶液再加入吸附柱cb3中，室温放置2min，12,000rpm离心2min将溶液收集到离心管中。

经过nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到50ng/μl于-20℃下保存备用。

3、目的片段pcr扩增与测序

用已提取的dna为模板，根据所设计的引物，进行pcr扩增：取dna模板1μl、seqidno：2和seqidno：3所示的引物各0.4μl、pcrmix试剂10μl、双蒸水7.2μl；设置pcr扩增体系：

pcr产物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳检测，扩增的目的片段大小约550bp，电泳图见图1，将剩余的扩增产物进行测序，测序结果用dnaman软件与genbank中猪的相关基因片段序列比对、分析，判读rs80912566位点的基因型，

4统计分析

利用sas软件一般线性模型进行基因型对表型的影响效应分析。分析模型为

yijnkl＝ui+gj+sn+bk+dl+eijkl

其中：yijkm为猪的肌内脂肪含量；gj代表第j个snp的基因型固定效应；sn代表性别的固定效应；bk是第k个批次固定效应；dl是协变量；eijkl为残差。

5结果

表1给出了rs80912566变位点c/t在苏淮猪群体中对肌内脂肪含量的影响效应。由表1可知，rs80912566位点三种基因型之间肌内脂肪含量有显著差异(p<0.05)，其中tt型个体肌内脂肪含量显著高于ct型(p<0.05)，tt型个体肌内脂肪含量高于cc型个体，但是差异不显著。由此可见，在苏淮猪群体中，继代选育rs80912566位点的tt型个体，均可逐步提高苏淮猪群体肌内脂肪含量，达到提高苏淮猪肉质性能的目的。

表1scd基因rs80912566位点与苏淮猪肌内脂肪的关联分析

注：字母a,b代表每一行不同字母之间显著差异(p<0.05)。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种与苏淮猪肌内脂肪含量相关的snp标记引物对及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>4

<211>569

<212>dna

<213>猪(susscrofa)

<220>

<221>gene

<222>(288)

<223>y=t或c

<400>4

atggcaacggcaggacgaggtggcaccaaattcccttcggccaatgacgcgccagagtct60

acagaagcccattagcatttccccaggggcaggggcagaggcaggggctgcggagaccga120

gccgcggagtgtctgcagcatccagtttttgcgtctccggcccccagcaagccccggctc180

tctgtctcctcccctctcccgcccatgcggttctcccacggtgagccaactctgcgcact240

ttgccccttcttggcagcgaataaaaggggtcagaggaaatacaggayacggtcgcccac300

tgccagctctagcctttaaatacccagcctggggagacccacgcacagcaggtcgggtgc360

agacaccgacccaacgtgcagcaaagggttccgagcgcagcatcgctgatctccgcgcaa420

gagccggctccagcactagtctacgctcagtgcggtctgccacgaactcctccctgaagt480

ctcatccctgggaaagtgatcccaacgtccgagagcccagatgccggcccacttgctgca540

agaggaggtgagtttccaagtaatggccc569

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atggcaacggcaggacgag19

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gggccattacttggaaactcac22