本发明涉及一种甜菊糖印迹材料的制备方法及应用，属于分子印迹材料领域。
背景技术
甜菊糖苷，（甜菊总苷，steviolglycosides），俗称甜菊糖，是从甜叶菊叶片中提取得到的一类高甜度、低热量的天然甜味剂。甜菊糖苷具有热量低、甜度高、味质好、耐高温、稳定性好等特点。目前，工厂常用的甜菊糖分离纯化方法为树脂吸附-洗脱法。目前在国内用于提取分离甜菊糖的吸附树脂主要有ab8、ads-7等，但是，由于甜菊糖分子具有较大的极性，难以与色素分子分离，导致提取工艺中有着一系列难以解决的问题。比如，使用吸附甜菊糖较好的树脂，但是对色素的吸附量也会变大，如果使用对色素吸附量较小的树脂，那么对甜菊糖的吸附量也会变小。因此，我们需要制备一种树脂，该树脂能大量吸附甜菊糖分子，但是对其他分子的吸附量较小。
甜菊糖具有甜度高但热量低，味质好且稳定性好等特点。在人体内几乎不会被消化分解，因此也不会产生太高的热量。所以甜菊糖有利于调节血糖，对糖尿病，肥胖症患者有辅助疗效。由于其不易受温度、ph、微生物发酵的影响，所以加入食品中不易变质，易于长期储存。因此，在很多国家和地区，甜菊糖被广泛应用于医药、食品、饮料等领域，被称为〝最佳天然甜味剂〞，是继蔗糖，甜菜糖之后的最具有开发价值的糖，被国际上称为〝第三糖源〞。
目前国内外常用的提取甜菊糖的方法有超声波提取法，重结晶法，热水浸提法，酶提取法等，但这些方法或多或少都有一些缺点，比如，成本昂贵，提纯率不高等。
（1）浸提法
分为水浸提和有机溶剂浸提两种，前者浸提后酶失活严重，后者挥发大，损失严重。随后对提取液进行除杂、浓缩、干燥、结晶后得到了较纯的甜菊糖。昝凤生研究了浸提法所需要的最佳条件，使用乙醇作为溶剂进行浸提，随后浓缩，脱盐，脱味，结晶得到了甜菊糖苷的白色无定形体。但该方法操作较为复杂，不适合工业生产。
（2）超声波提取法
超声波提取技术是利用超声波的空化作用加快破坏植物的细胞壁，加速释放生物活性物质，以便于提取。刘东强等人利用超声波法，以水作为提取剂，甜菊糖苷的提取率为12.78%，分离提纯后，纯度达到了92.15%。利用超声波法提取甜菊糖，成本较低，且纯度很高。但是过程较复杂，提取率也不高，不适合用于工业化生产。
（3）重结晶法
重结晶法是利用各甜菊糖苷在某溶剂中的溶解度不同使之相互分离。江南大学的李培等人用甲醇/异丙醇混合溶剂对甜菊糖进行重结晶，得到了高纯度ra甜菊糖。但是重结晶法一般损失较大，提纯率不高。
（4）酶提取法
酶提取技术是近年来广泛用于中药工业的一项生物工程技术，通过选用适当的酶，通过温和的酶反应将植物组织分解，加快有效成分的释放，目前植物提取方面研究较多的是纤维素酶。付娟娟等人通过使用纤维素酶成功提取了甜叶菊中的甜菊糖苷，甜菊糖苷的提取率为12.94%。酶提取法缩短了提取时间，但是酶的使用条件比较苛刻，且重复利用率不高。
甜菊糖苷的纯化方法：通过浸提法等方法得到的甜菊糖原液中含有很多无机盐，色素，有机酸，蛋白质等杂质，除去这些杂质常用的方法有物理除杂法，化学除杂法，树脂吸附法等：（1）物理除杂法：物理除杂法一般采取离心，过滤等方法将甜菊糖原液中的色素，有机酸等杂质除去。陈绍潘，林光荣等人通过使用超滤膜及反渗透膜对甜菊糖苷原液进行了分离提纯，除杂率达到了90%以上。但是这种方法的生产周期比较长，且运行成本很高，不适宜工业上使用。（2）化学除杂法：化学絮凝法是我国目前分离甜菊糖苷的主要方法之一，主要是通过在原液中加入絮凝剂除去杂质。其原理是絮凝物质大多数带有电荷，可以吸附带有相反电荷的基团，发生电荷中和，使其失去稳定性。最后通过粘附架桥交联作用，使得杂质发生聚沉。应用化学絮凝法可以除去原液中80%的有机杂质。（3）大孔树脂吸附法：大孔吸附树脂分离技术是一种新型的分离技术，于20世纪60年代末兴起。大孔树脂具有很多别的物质不具备的优点，比如，物理化学性质稳定，比表面积大，选择性比较好，吸附条件温和，重复利用率较高，使用寿命较长。因此，大孔树脂在工业上有着广泛应用。大孔树脂吸附利用极性不同选择性吸附甜菊糖苷，然后使用有机溶剂对树脂进行洗脱，得到较高纯度的甜菊糖溶液。陈天红等人通过使用pyr树脂对甜菊糖进行吸附洗脱性能研究。虽然大孔树脂具有一定的选择性，但是还会吸附一些杂质。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种甜菊糖印迹材料的制备方法及应用。
本发明提供了一种甜菊糖印迹材料的制备方法，以甲基丙烯酸maa为单体，过硫酸铵为引发剂，在改性后的聚苯乙烯伯胺微球pas表面接枝聚合得到接枝微粒pmaa/pas，接着做接枝微粒pmaa/pas对甜菊糖溶液的等温吸附试验；然后用甜菊糖苷为模板分子、戊二醛为交联剂制备分子表面印迹材料mip-pmaa/pas。
本发明中，伯胺树脂进行改性后再用甲基丙烯酸（maa）进行接枝以后拥有了羧酸功能团。在交联印迹的过程中，所用的功能单体不仅要能与加入的交联剂进行共聚反应，而且其分子内还要有合适的官能团，能够与模板分子相互作用。由于羧酸根和氨基与甜菊糖苷的氧原子之间存在氢键相互作用力，因此可以形成具有特异性结合性能的结合位点，单体甲基丙烯酸上的羧羟基会与甜菊糖苷中的羰基产生o—h••••o氢键。洗去模板分子后，在聚合物中留下了空间结构能与甜菊糖苷分子的空间结构相匹配的三维空穴，这些孔穴只能吸附甜菊糖，所以利用聚苯乙烯伯胺微球表面的孔穴可进行甜菊糖苷的分离与提纯。
上述制备方法具体包括以下步骤：
（1）首先使用乙醇作为溶剂，甲基丙烯酸为单体，过硫酸铵为引发剂，温度为40-70℃，制得了接枝伯胺微球pmaa/pas；
取0.1g聚苯乙烯伯胺树脂加入到四口烧瓶中，并加入7-11ml的dmf浸泡8-14h后，加入1-3ml（总质量的4-5%）maa，开始用水浴锅搅拌加热升温，当温度达到30-40℃后加入0.02-0.03g引发剂过硫酸铵（单体质量的0.5-1.5%）开始反应；在温度为40-70℃条件下回流搅拌，7-9h后用蒸馏水反复多次洗涤，抽滤之后用真空烘箱进行干燥20-30h，制得接枝微粒pmaa/sio2。
（2）然后采用表面印迹技术制得甜菊糖表面分子印迹材料mip-pmaa/pas：
使用饱和吸附的接枝伯胺微球，加入溶剂甜菊糖乙醇溶液以及戊二醛作为引发剂，制得印迹材料mip-pmaa/pas；
取0.05-0.15g饱和吸附了甜菊糖的接枝微球pmaa/sio2，真空干燥后；加入40-60ml的甜菊糖乙醇溶液作为溶剂；再加入0.05-0.15ml戊二醛作为交联剂；在温度为35-50℃的条件下回流搅拌5-7小时；真空干燥后，放入四口烧瓶中，加入甲醇与乙酸的混合液，常温搅拌3-5小时，洗去甜菊糖模板；真空干燥后，得到甜菊糖表面分子印迹材料mip-pmaa/pas；
甜菊糖乙醇溶液的浓度为1g/l，甲醇与乙酸的体积比为3:1-5:1。
上述方法步骤（2）中，选用0.1g饱和吸附的接枝伯胺微球，加入50ml1g/l的甜菊糖乙醇溶液作为溶剂，温度为40℃，反应时间为6h，交联剂的质量分数为0.238%（以模板分子为基准物）；得到印迹材料的选择性系数为7.88。
本发明提供了上述制备方法得到的甜菊糖印迹材料在分子印迹提取甜菊糖的应用。
所述的应用，吸附1g/l的甜菊糖与葡萄糖混合水溶液，温度为20℃，振荡时长为1.5h，溶液ph为6时，甜菊糖分子印迹材料的拆分效果最好。最终得到该甜菊糖分子印迹材料的静态吸附最大吸附量为203.48mg/g，动态吸附的吸附量为217.69mg/g。
本发明的有益效果：
本发明可以高效快捷的从甜菊糖粗提液中识别吸附模板分子甜菊糖，从而提高甜菊糖的产率和纯度，同时降低材料损耗和能耗，减少或避免环境污染物的排放。
附图说明
图1为未改性的伯胺微球pas，接枝微球pmaa/pas以及实施例1所得甜菊糖分子印迹材料mip-pmaa/pas的红外光谱图。
图2为模板分子浓度对印迹材料拆分性能的影响。
图3为印迹温度对印迹材料拆分性能的影响。
图4为反应时间对印迹材料拆分性能的影响。
图5为交联剂用量对印迹材料拆分性能的影响。
图6为非印迹材料nmip-pmaa/pas对甜菊糖和葡萄糖的等温吸附曲线。
图7为印迹材料mip-pmaa/pas对甜菊糖和葡萄糖的等温吸附曲线。
图8为非印迹材料nmip-pmaa/pas对甜菊糖和葡萄糖的动态结合曲线。
图9为印迹材料mip-pmaa/pas对甜菊糖和葡萄糖的动态结合曲线。
图10为甜菊糖水溶液的浓度对印迹材料拆分性能的影响。
图11为拆分温度对印迹材料拆分性能的影响。
图12为拆分时溶液ph对吸附量的影响。
图13为该印迹材料mip-pmaa/pas的重复利用率。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明，但不局限于以下实施例。
实施例1：甜菊糖印迹材料的制备方法
包括以下步骤：
（1）接枝微球pmaa/pas的制备方法，
称取0.1克洗过的伯胺树脂球置于四口烧瓶中，加入10mldmf（n,n-二甲基甲酰胺），密闭浸泡十个小时。加入1.4mlmaa、0.0274g过硫酸铵以及50ml乙醇作为溶剂，在温度为50℃条件下，回流搅拌8小时。反应结束后，抽滤，真空干燥备用。
（2）甜菊糖表面印迹材料mip-pmaa/pas的制备
取0.1g饱和吸附了甜菊糖的接枝微球，真空干燥后，置于四口烧瓶中。加入50ml1g/l的甜菊糖乙醇溶液作为溶剂，以及0.1ml戊二醛作为交联剂。在温度为40℃的条件下回流搅拌6小时。真空干燥后，放入四口烧瓶中，加入甲醇与乙酸（v1：v2=4：1）的混合液，常温搅拌3.5小时，洗去甜菊糖模板。真空干燥后，得到甜菊糖表面分子印迹材料mip-pmaa/pas。
（3）甜菊糖表面印迹材料mip-pmaa/pas的表征
采用溴化钾压片法测定mip-pmaa/pas的红外光谱，通过观察材料所含的各个官能团，确定是否交联成功。
由图1红外光谱图可知，3750cm-1为n-h的伸缩振动峰，1583cm-1，1485cm-1为n-h的弯曲振动峰，3445cm-1和1687cm-1是-oh的振动收缩峰。在pmaa/pas光谱图中3445cm-1的-oh伸缩明显增强，并出现新的700cm-1的游离羧基的特征吸收峰，且3445cm-1处的特征峰明显加强，说明,maa已经成功接枝到伯胺微球上了。在mip-pmaa/pas上可以观察到700cm-1，1740cm-1有脂肪醛的特征吸收峰，说明交联反应已经发生。
实施例2：甜菊糖印迹材料的制备方法
包括以下步骤：
（1）接枝微球pmaa/pas的制备方法，
称取0.1克洗过的伯胺树脂球置于四口烧瓶中，加入8mldmf（n,n-二甲基甲酰胺），密闭浸泡十个小时。加入2.0mlmaa、0.0274g过硫酸铵以及50ml乙醇作为溶剂，在温度为60℃条件下，回流搅拌8小时。反应结束后，抽滤，真空干燥备用。
（2）甜菊糖表面印迹材料mip-pmaa/pas的制备
取0.1g饱和吸附了甜菊糖的接枝微球，真空干燥后，置于四口烧瓶中。加入50ml1g/l的甜菊糖乙醇溶液作为溶剂，以及0.1ml戊二醛作为交联剂。在温度为50℃的条件下回流搅拌6小时。真空干燥后，放入四口烧瓶中，加入甲醇与乙酸（v1：v2=3.5：1）的混合液，常温搅拌3.5小时，洗去甜菊糖模板。真空干燥后，得到甜菊糖表面分子印迹材料mip-pmaa/pas。
实施例3：甜菊糖印迹材料的制备方法
包括以下步骤：
（1）接枝微球pmaa/pas的制备方法，
称取0.2克洗过的伯胺树脂球置于四口烧瓶中，加入14mldmf（n,n-二甲基甲酰胺），密闭浸泡十个小时。加入4.0mlmaa、0.0274g过硫酸铵以及50ml乙醇作为溶剂，在温度为50℃条件下，回流搅拌8小时。反应结束后，抽滤，真空干燥备用。
（2）甜菊糖表面印迹材料mip-pmaa/pas的制备
取0.2g饱和吸附了甜菊糖的接枝微球，真空干燥后，置于四口烧瓶中。加入50ml1g/l的甜菊糖乙醇溶液作为溶剂，以及0.4ml戊二醛作为交联剂。在温度为50℃的条件下回流搅拌6小时。真空干燥后，放入四口烧瓶中，加入甲醇与乙酸（v1：v2=4.5：1）的混合液，常温搅拌3.5小时，洗去甜菊糖模板。真空干燥后，得到甜菊糖表面分子印迹材料mip-pmaa/pas。
实施例4：印迹材料mip-pmaa/pas拆分性能的研究
1、模板分子浓度对印迹材料的影响
在五个四口烧瓶中分别加入0.1克饱和吸附的接枝微球pmaa/pas，和0.1ml戊二醛，分别加入0.1g/l、0.5g/l、1.0g/l、2.0g/l、3.0g/l的甜菊糖的乙醇溶液。温度设置为50℃，回流搅拌8h。反应结束后，洗脱模板，抽滤，真空干燥。
在图2中可以看出使用甜菊糖水溶液与甜菊糖乙醇溶液作溶剂时印迹材料的拆分能力的不同。
由图2可知，使用甜菊糖的乙醇溶液的的效果比使用甜菊糖水溶液的效果要好。这是由于甜菊糖在乙醇中的溶解度大于在水中的溶解度，因此在乙醇溶剂中可以形成更多的印迹空穴，使得选择性系数变大。
而甜菊糖的乙醇溶液浓度在1g/l时，甜菊糖表面分子印迹材料mip-pmaa/pas的选择性系数最大。这是由于随着甜菊糖水溶液浓度的增加，甜菊糖与印迹材料之间有更大的几率形成氢键，形成更多的模板分子-功能单体络合物，使得印迹材料中印迹空穴数目变多，选择性系数也逐渐增大。但是当溶液浓度高于1g/l后，接枝微粒对甜菊糖分子的吸附量达到平衡，形成的空穴数目不再增加，因此选择性系数几乎不再变化。
、反应温度对印迹材料的影响
在五个四口烧瓶中分别加入0.1g饱和吸附的接枝微球pmaa/pas，和0.1ml戊二醛，加入50ml1g/l的甜菊糖的乙醇溶液。温度分别设置为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，回流搅拌8小时。反应结束后，洗脱模板，抽滤，真空干燥。
由图3可知，当温度为40℃时，甜菊糖分子印迹材料的选择性系数最大。从图中可知，随着印迹温度升高，选择性系数变大；温度达到40℃时达到最大；而随着温度继续上升，选择性系数反而下降。这是由于交联反应是吸热反应，当温度较低时，无法为反应提供足够的能量，因此在低温时交联反应完成度较低，形成的印迹空穴数目较少，导致选择性系数较小；但当温度过高时，由于甜菊糖分子与mip-pmaa/pas之间的作用力是静电相互作用和氢键作用，属于物理吸附。随着温度的升高，甜菊糖模板分子容易从印迹材料mip-pmaa/pas上脱落，不利于印迹孔穴的形成，在温度高于40℃后，这种负面的影响开始占主导地位，印迹空穴随之减少，故印迹效果明显下降，使得选择性系数也随之下降。
、反应时间对印迹材料的影响
在五个四口烧瓶中分别加入0.1g饱和吸附的接枝微球pmaa/pas，和0.1ml戊二醛，加入50ml1g/l的甜菊糖的乙醇溶液。温度设置为40℃，回流搅拌时间分别为2h、4h、6h、8h。反应结束后，洗脱模板，抽滤，真空干燥。
由图4可知，印迹时长在6h处，选择性系数达到最大。印迹时间低于6h时，由于反应时间过短，印迹反应不能完全进行；当印迹时间过长时，吸附在接枝微球pmaa/pas上的甜菊糖模板分子有可能会脱落，使得印迹空穴减少，吸附量降低，从而选择性系数降低。
、交联剂用量对印迹材料的影响
在五个四口烧瓶中分别加入0.1g饱和吸附的接枝微球pmaa/pas，加入50ml1g/l的甜菊糖的乙醇溶液。加入交联剂戊二醛的质量分数分别为0.038%（0.015ml）、0.138%（0.06ml）、0.238%（0.10ml）、0.338%（0.14ml）、0.438%（0.18ml），回流搅拌6小时。反应结束后，洗脱模板，抽滤，真空干燥。
将上述干燥好的印迹材料分别称取0.02克，置于25ml的锥形瓶中，加入10ml1g/l的甜菊糖的水溶液，温度为20℃，恒温振荡1.5h。振荡结束后，取上清液1ml，稀释25倍，测定波长在195nm处的吸光度。用下述公式计算吸附量：
式中c0（mol/l）、ce（mol/l）分别为吸附前后溶液中甜菊糖的浓度；v（l）为甜菊糖溶液的体积；m（g）为功能接枝微粒pmaa/pas的质量。
由图5可知，当戊二醛的质量分数为2.38%时，印迹材料mip-pmaa/pas的选择性系数达到最大。开始时，选择性系数随着戊二醛量的增加而增大，到达0.238%时，选择性系数达到最大为7.88。随后随着戊二醛的量增加，选择性系数又逐渐减小。这是由于交联剂用量太少会直接导致交联度不足，不足以形成足够多的印迹空穴，最终影响印迹材料的吸附性能降低，选择性系数也随之减小；当戊二醛量过高时，过量的交联剂又会导致交联度过大，不但使印迹空穴变小，而且会将模板分子甜菊糖挤掉，也会使得印迹材料mip-pmaa/pas对甜菊糖的选择性系数降低。
实施例5：印迹材料识别选择性
1、等温结合曲线
取七个锥形瓶，分别称取用最佳条件制备的印迹材料mip-pmaa/pas0.02g，加入10ml甜菊糖的水溶液，其浓度分别为0.2g/l、0.4g/l、0.6g/l、0.8g/l、1.0g/l、1.2g/l、1.4g/l。在温度为20℃下，恒温振荡1.5h。振荡结束后，取上清液1ml，稀释25倍，测定波长在195nm处的吸光度。用公式2.1计算吸附量。
图6和图7为印迹材料mip-pmaa/pas和非印迹材料nmip-pmaa/pas对甜菊糖和葡萄糖的等温吸附曲线。
由图6可知非印迹材料nmip-pmaa/pas对甜菊糖和葡萄糖都有吸附作用，其中，对甜菊糖的吸附量达到203.48mg/g，对葡萄糖的吸附量则达到160.13mg/g，说明非印迹材料对甜菊糖和葡萄糖不具有选择识别性。图7显示，印迹材料mip-pmaa/pas对甜菊糖的吸附量仍为203.48mg/g，但对葡萄糖的吸附量则降为45.23mg/g。吸附量的变化说明该印迹材料mip-pmaa/pas对模板分子甜菊糖具有较好的选择识别能力与结合能力。这种差异主要是由于印迹材料上含有与甜菊糖模板分子相契合的空穴，但该空穴对葡萄糖分子却不契合。所以印迹材料mip-pmaa/pas对葡萄糖有较低的吸附量，但对甜菊糖却有很高的吸附量。
、动态结合曲线
使用动态吸附法测定印迹材料mip-pmaa/pas的对甜菊糖的选择性能。20℃时，在内径为6mm的玻璃管内装入质量为0.6685g的印迹材料mip-pmaa/pas，此时填充柱床体积（bedvolume，bv）为2ml，以逆流的方式使1.0g/l的甜菊糖水溶液通过玻璃管，将流速控制在5bv/h，流出液的收集间隔为3bv，通过测定流出液的吸光度，确定流出液的甜菊糖浓度。保持其他条件不变，使用mip-pmaa/pas对葡萄糖进行同样的动态吸附实验，测定流出液的葡萄糖浓度。同样绘制出相应的动态结合曲线。计算出以上两种分子的吸附量。
按照相同的吸附条件，绘制出nmip-pmaa/pas对甜菊糖和葡萄糖的动态吸附曲线。
由图8可知，非印迹材料对甜菊糖和葡萄糖的拆分能力较小。但由图9可以看出，印迹材料对甜菊糖和葡萄糖的拆分能力明显增强。动态吸附曲线再次说明，印迹材料mip-pmaa/pas对模板分子甜菊糖具有很强的结合能力与识别能力。
实施例6：拆分条件对印迹材料拆分能力的影响
1、拆分浓度对印迹材料拆分性能的影响
取七个锥形瓶，分别称取用最佳条件制备的印迹材料mip-pmaa/pas0.02g，加入10ml甜菊糖的水溶液，其浓度分别为0.2g/l、0.4g/l、0.6g/l、0.8g/l、1.0g/l、1.2g/l、1.4g/l。在温度为20℃下，恒温振荡1.5h。振荡结束后，取上清液1ml，稀释25倍，测定波长在195nm处的吸光度。用下述公式计算吸附量：
由图10可知，在甜菊糖水溶液浓度低于1g/l时，由于溶液浓度较低，吸附未达到平衡，因此选择性系数较低。随着溶液浓度增加，选择性系数增大。当溶液浓度高于1g/l时，吸附量不再改变，选择性系数也达到平衡。
、拆分温度对印迹材料拆分性能的影响
取五个锥形瓶，分别称取最佳条件制备的印迹材料mip-pmaa/pas0.02g，
加入10ml1.0g/l的甜菊糖水溶液。振荡1.5h，振荡温度分别为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃。振荡结束后，分别取上清液1ml，稀释25倍，测定波长在195nm处的吸光度。
用下述公式计算吸附量：
如图11所示，印迹材料mip-pmaa/pas对甜菊糖分子的选择性系数随着拆分温度的升高而降低。这是由于印迹材料对甜菊糖吸附的作用力来自于主-客体之间的氢键相互作用力。由于温度对氢键作用力影响很大，随着温度的升高，会减弱甚至破坏分之间的氢键作用，从而导致选择性系数减小。结果表明，在20℃时印迹材料mip-pmaa/pas对甜菊糖分子的吸附性能最好，二者之间的氢键相互作用力最强，印迹材料的选择性系数最好。
、拆分时溶液ph对印迹材料拆分性能的影响
取五个锥形瓶，分别称取最佳条件制备的印迹材料mip-pmaa/pas0.02g，加入10ml1.0g/l的甜菊糖水溶液。振荡1.5h，温度为20℃。分别调节溶液ph为2、4、6、8、10。振荡结束后，分别取上清液1ml，稀释25倍，测定波长在195nm处的吸光度。用下述公式计算吸附量：
由图12可知，mip-pmaa/pas对扁桃酸的选择性系数随ph的增大先增大，达到最大后又开始逐渐变小，在ph=6时选择性系数达到最大值。这是因为当ph小于6时，氨基质子化程度很高，但甜菊糖分子中的羧基电离度很小，故静电作用很弱，此时氢键作用是接枝微粒对甜菊糖吸附作用的主要作用力；当ph逐渐增大，羧基的电离度也随之增大，微粒mip-pmaa/pas与甜菊糖分子之间的静电作用不断增强，而氢键作用力相互作用仍然存在。在两种作用力共同作用下，使得选择性系数增大。当ph大于6时，mip-pmaa/pas分子中的氨基质子化程度越来越弱，羧基变成羧酸化合物，使得氢键被破坏，吸附量降低，导致选择性系数逐渐减小。由上可知mip-pmaa/pas微球对甜菊糖吸附的最适宜ph为6。
实施例7：考察印迹材料对甜菊糖分子的特异性吸附
取两个锥形瓶，分别称取0.02g印迹材料mip-pmaa/pas，分别加入10ml1.0g/l的甜菊糖水溶液和1g/l的葡萄糖溶液。振荡1.5h，温度为20℃。测定甜菊糖溶液的吸光度，使用滴定法滴定出葡萄糖溶液的浓度。计算对两种分子的吸附量、kd(ml/g)及选择性系数k：
式中，kd（ml/g）为甜菊糖或葡萄糖的分配系数；qe（mg/g）和ce（mg/ml）分别是印迹材料对甜菊糖的平衡吸附量和平衡浓度。
式中，k是相对于葡萄糖而言，印迹材料mip-pmaa/pas对甜菊糖的选择性系数。
在相同条件下测定非印迹材料nmip-pmaa/pas对二者的吸附量及选择性系数。
表1印迹材料与非印迹材料的选择性系数
由表1可知，非印迹材料nmip-pmaa/pas既吸附甜菊糖又吸附葡萄糖，选择性系数较小，对甜菊糖的拆分能力较差。但甜菊糖分子印迹材料mip-pmaa/pas吸附甜菊糖，但对葡萄糖的吸附量降低，选择性系数变大，对甜菊糖拆分能力变强。说明制备所得的甜菊糖分子印迹材料对甜菊糖具有一定的拆分能力。
实施例8：考察印迹材料的可重复利用性
取0.1g已饱和吸附甜菊糖的印迹材料mip-pmaa/pas，置于四口烧瓶中。加入40ml甲醇与乙酸的混合液（甲醇：乙酸=4:1）40ml，常温搅拌3.5h，抽滤，真空干燥。取干燥后的印迹材料重复等温吸附，洗脱实验。测定195nm处的吸光度，并根据公式2.1计算吸附量。以考察该印迹材料的可重复利用性。
图13为该印迹材料mip-pmaa/pas的重复利用率，经测定可得，制备所得甜菊糖分子印迹材料的重复利用率为92.63%。