一种剪切DNA分子的方法及其应用与流程

文档序号：16270452发布日期：2018-12-14 22:13阅读：1091来源：国知局

本发明涉及一种剪切dna分子的方法及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

获得dna片段，对于基因测序、基因分析、基因编辑等技术而言是关键性步骤。对于基因测序，它可有效获得目的片段；对于基因分析，它可获得单一基因信息；对于基因编辑，它可选择性提取或复制基因序列。因此，dna分子的剪切是基因工程领域必不可多的预处理步骤。

随着基因领域研究的不断深入，获得结构均一，在序列、位点上具有高度特异性的dna片段的需求变得越来越大。

目前，常用的剪切dna分子的方法有以下几种：dna限制性酶切法、超声波降解法、水动力剪切法等，这些方法目前都被用于dna片段的生成，但是，限制性内切酶切法仍需要特定的生物酶，具有对ph以及温度要求高的缺陷；超声波降解法以及水动力剪切法具有对目标序列无特异性的缺陷。

因此，上述方法均不能很好的获得结构均一，在序列、位点上具有高度特异性的dna片段，我们急需找到一种能够获得结构均一，在序列、位点上具有高度特异性的dna片段的方法，以满足基因领域研究的需要。

技术实现要素：

手性半导体纳米粒子是由iv、ii-vi，iv-vi或iii-v元素组成，常用于传感检测、成像、催化等；圆偏振光是光的电场方向或光矢量末端在垂直于传播方向的平面上描绘出的轨迹，常用于手性活性物质的表征。

为解决上述问题，本发明提供了一种剪切dna分子的方法。此方法将手性半导体纳米粒子与圆偏振光相结合，利用手性纳米粒子特殊构型及其在光下易发生光致氧化的原理，先将手性半导体纳米粒子与dna分子混合后进行孵育，然后将孵育好的手性半导体纳米粒子与dna分子混合物在圆偏振光下进行照射，即得剪切后的dna分子；使用此方法，可快速获得大量结构均一，且在序列、位点上具有高度特异性的dna片段，在基因工程领域具有巨大的应用潜力。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种剪切dna分子的方法，所述方法为先将手性半导体纳米粒子与dna分子混合后进行孵育，然后将孵育好的手性半导体纳米粒子与dna分子混合物在圆偏振光下进行照射，即得剪切后的dna分子。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将dna分子溶解于pbs缓冲液中，得到dna分子溶液；将手性半导体纳米粒子加入dna分子溶液中进行混合，得到混合液；将混合液静置进行孵育，得到孵育后的混合液；将孵育后的混合液在圆偏振光下进行照射，即得剪切后的dna分子。

在本发明的一种实施方式中，所述pbs缓冲液的浓度为0.01mol/l。

在本发明的一种实施方式中，所述pbs缓冲液的ph为7.4。

在本发明的一种实施方式中，所述dna分子溶液中dna分子的浓度为0.5-1.5μmol/l。

在本发明的一种实施方式中，所述dna分子溶液中dna分子的浓度为1μmol/l。

在本发明的一种实施方式中，所述手性半导体纳米粒子是以d型半胱氨酸或l型半胱氨酸为手性配体合成的。

在本发明的一种实施方式中，所述手性半导体纳米粒子与dna分子的摩尔比为45-55:1。

在本发明的一种实施方式中，所述手性半导体纳米粒子与dna分子的摩尔比为50:1。

在本发明的一种实施方式中，所述静置的时间为0.5-1.5h。

在本发明的一种实施方式中，所述静置的时间为1h。

在本发明的一种实施方式中，所述照射为将孵育后的混合物先加入到具塞比色皿中，再在圆偏振光下进行照射。

在本发明的一种实施方式中，所述照射的时间为1-3h。

在本发明的一种实施方式中，所述照射的时间为2h。

在本发明的一种实施方式中，所述圆偏振光为左圆偏振光和/或右圆偏振光。

在本发明的一种实施方式中，所述圆偏振光的光源为激光。

在本发明的一种实施方式中，所述圆偏振光的光源为405nm的激光。

在本发明的一种实施方式中，所述圆偏振光是通过将光源穿过不同角度的四分之一玻片获得的。

本发明提供了上述一种剪切dna分子的方法剪切得到的dna分子片段。

本案发明提供了上述一种剪切dna分子的方法在基因工程方面的应用。

有益效果：

(1)使用本发明的方法，可快速获得大量结构均一，且在序列(gat-atc)、位点(t-a之间)上具有高度特异性的dna片段，在基因工程领域具有巨大的应用潜力；

(2)本发明所采用的手性纳米粒子对温度和ph不敏感，可应用于各种复杂条件下的dna剪切；

(3)本发明所采用的手性纳米粒子具有高度的特异性以及生物相容性，能够在活体细胞以及肿瘤中产生dna特异性剪切，具有应用于临床疾病治疗的潜在应用。

附图说明

图1手性半导体纳米粒子的透射电镜图；

图2手性半导体纳米粒子的圆二色光谱图；

图3salmondna与l-cyscdte的混合物在右圆偏振光下照射2h前后的电泳图；

图4salmondna与d-cyscdte的混合物在左圆偏振光下照射2h前后的电泳图；

图5非特异性salmondna序列与l-cyscdte的混合物在右圆偏振光下照射2h前后的电泳图；

图6salmondna与l-gshcdte的混合物在圆偏振光下照射2h前后的电泳图；

图7salmondna与l-gshcdte的混合物在(a)0摄氏度(b)50摄氏度并在圆偏振光下照射2h前后的电泳图；

图8salmondna与l-gshcdte的混合物在(a)ph6(b)ph8溶液中并在圆偏振光下照射2h前后的电泳图。

具体实施方式

下面以salmondna为例，结合具体实施例和对比例，对本发明进行进一步的阐述。

本发明涉及的表征方法如下：

dna剪切效果表征方法：取剪切后的dna产物20ul，将其与上样缓冲液(invitrogentm)混合。然后迅速加入只预先制备的2.5％的琼脂糖凝胶中。待样品沉降至胶孔底部后，将凝胶放入电泳缓冲液中(invitrogen^tm)，在110v电压下运行30min。最后在凝胶成像仪上检测dna条带。

电镜表征方法：将液体样品滴加在碳支持膜上，5min后将样品用吸水纸去除。然后将铜网放置在透射电镜样品杆中，在220kv加速电压下观察样品。

实施例1：前驱体的合成

在氮气的保护下，将4ml的0.5m的h2so4加入到0.05g的al2te3溶液中，得到前驱气体。

实施例2：手性半导体纳米粒子的合成

将0.985g的cd(clo4)2·6h2o和3ml1m的d型半胱氨酸加入到125ml水中后，通入实施例1得到的前驱气体，采用naoh调节ph为12，前驱气体采用氮气作为载流气体，流速控制为100ml/min，将溶液边搅拌边加热到110℃，并保持8h，然后在得到的纳米粒子溶液中加入按体积比1:1加入异丙醇，然后将混合物10000rpm离心5min。然后将沉淀重悬在pbs缓冲液中(0.01m、ph7.4)，得到手性半导体纳米粒子。(图1为手性半导体纳米粒子的透射电镜图，图2为手性半导体纳米粒子的圆二色光谱图)

实施例3：手性半导体纳米粒子的合成

将0.985g的cd(clo4)2·6h2o和3ml1m的l型半胱氨酸加入到125ml水中后，通入实施例1得到的前驱气体，采用naoh调节ph为12，前驱气体采用氮气作为载流气体，流速控制为100ml/min，将溶液边搅拌边加热到110℃，并保持8h，然后在得到的纳米粒子溶液中加入按体积比1:1加入异丙醇，然后将混合物10000rpm离心5min。然后将沉淀重悬在pbs缓冲液中(0.01m、ph7.4)，得到手性半导体纳米粒子。(图1为手性半导体纳米粒子的透射电镜图，图2为手性半导体纳米粒子的圆二色光谱图)

实施例4：手性半导体纳米粒子与dna的孵育

将50μl的浓度为1μm的核苷酸序列为seqidno.1的鲑鱼精dna(salmondna)溶液(通过将salmondna溶解于浓度为0.01m、ph7.4的pbs缓冲液中获得)分别与实施例2、3得到的手性半导体纳米粒子摩尔比50:1充分混合后静置1h，得到孵育后的手性半导体纳米粒子与dna的混合液。

实施例5：手性半导体纳米粒子与dna的照射

取100μl实施例4获得的混合物加入到具塞比色皿中，然后采用405nm的激光作为光源，通过调节不同角度的四分之一玻片获得的左、右圆偏振光分别对混合液进行照射2h。

将照射后的混合液于8000rpm离心10min后进行表征。

表征结果如图3-4，由图可知：salmondna与手性半导体纳米粒子混合后，采用圆偏振光照射2小时后，在dna序列上gatatc特异性片段中的t和a碱基处发生断裂，salmondna(核苷酸序列为seqidno.1)原始长度为1839bp剪切之后的长度分别为1083bp和756bp(剪切后dna片段的核苷酸序列分别为seqidno.2、seqidno.3)。

(由于使用d型半胱氨酸与l型半胱氨酸最终得到的结果几乎无差异，此处仅用d型半胱氨酸的结果进行表示)

实施例6：温度对dna剪切结果的影响

取100μl实施例4获得的混合物加入到具塞比色皿中，并将比色皿分别放于0度和50度的环境中，然后采用405nm的激光作为光源，通过调节不同角度的四分之一玻片获得的左、右圆偏振光分别对混合液进行照射2h。将照射后的混合液于8000rpm离心10min后进行表征。

表征结果如图7，由图可知：salmondna与手性半导体纳米粒子混合后，采用圆偏振光分别在0度和50度环境下照射2小时后，在dna序列上gatatc特异性片段中的t和a碱基处发生断裂，salmondna(核苷酸序列为seqidno.1)原始长度为1839bp剪切之后的长度分别为1083bp和756bp(剪切后dna片段的核苷酸序列分别为seqidno.2、seqidno.3)。

(由于使用d型半胱氨酸与l型半胱氨酸最终得到的结果几乎无差异，此处仅用d型半胱氨酸的结果进行表示)。

实施例7：ph对dna剪切结果的影响

取100μl实施例4获得的混合物加入到具塞比色皿中，调节比色皿中的ph分别为6或者8，然后采用405nm的激光作为光源，通过调节不同角度的四分之一玻片获得的左、右圆偏振光分别对混合液进行照射2h。将照射后的混合液于8000rpm离心10min后进行表征。

表征结果如图8，由图可知：salmondna与手性半导体纳米粒子混合后调节ph分别为2或者8，采用圆偏振光分别照射2小时后，在dna序列上gatatc特异性片段中的t和a碱基处发生断裂，salmondna(核苷酸序列为seqidno.1)原始长度为1839bp剪切之后的长度分别为1083bp和756bp(剪切后dna片段的核苷酸序列分别为seqidno.2、seqidno.3)。

(由于使用d型半胱氨酸与l型半胱氨酸最终得到的结果几乎无差异，此处仅用d型半胱氨酸的结果进行表示)。

对比例1：手性半导体纳米粒子与非特异性dna的孵育

将salmondna序列在gatatc处的序列变化为gattac使其变成非特异性序列，其他参数与实施例1-5保持一致，观察dna序列是否还能被剪切。

结果如图5，非特异性salmondna序列与手性半导体纳米粒子混合后，采用圆偏振光照射2小时后，dna未发生片段断裂，说明未发生dna剪切。

对比例2：不同手性配体修饰的半导体纳米粒子与dna的照射

在手性半导体纳米粒子的合成过程中将手性配体由半胱氨酸替换为谷胱甘肽，其他参数与实施例1-5保持一致，得到谷胱甘肽(gsh)修饰的手性半导体纳米粒子。然后将此纳米粒子以同样的孵育条件与salmondna混合并以相同光照条件在偏振光照射下2小时。

结果如图6，谷胱甘肽修饰的手性半导体纳米粒子与salmondna的混合物在光照下没有发生dna剪切。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一种剪切dna分子的方法及其应用

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1839

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgcaccccactacactcatcttaagctcatcccttttaataatctttgcacttctaatc60

tatcctcttatcaccactctcacccctacccctcagcacaaaaactgatcccttaaccaa120

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<210>2

<211>1083

<212>dna

<213>人工序列

<400>2