一种基于InDel分子标记鉴定辣椒雄性不育三系配套杂交种真实性和纯度的方法与流程

文档序号：16103500发布日期：2018-11-28 00:29阅读：305来源：国知局

本发明属于辣椒育种技术领域，具体涉及一种基于InDel分子标记鉴定辣椒雄性不育三系配套杂交种真实性和纯度的方法。

背景技术：

加工型辣椒是辣椒品种中的重要类型，为重要的调味品和色素提取来源，我国播种面积为世界第二，仅次于印度。辣椒雄性不育三系配套杂交种比常规品种有明显的整齐度、高产优质和抗性强等优势，其种植面积和需求在不断增加。加工型辣椒品种更新换代极快，不仅审定品种繁多且不同品种间的相似性很大、差异性很少，肉眼一般不易准确辨别。种子的真假事关农业丰产，与农民的切身利益相关。在生产和销售的过程中，加工型辣椒雄性不育三系配套杂交种质量制辣椒杂交种子的真实性与纯度是加工型辣椒种子质量的一个重要衡量指标。因此一个鉴定准确，鉴定周期短的加工型辣椒杂交种真实性和纯度鉴定方法尤为重要。如何快速高效地进行杂交种的真实性和纯度鉴定，成为了目前需要解决的重要问题。

传统田间形征鉴定种子真实性和纯度的方法，具有周期长、易受环境和人为因素影响等缺陷，鉴定结果严重滞后。分子标记鉴定方法，基于分子生物学的理论基础与分子水平上的鉴别，相比田间形态学鉴定在时间劳动力和准确性上更有优势。目前辣椒中用于真实性和纯度鉴定的分子标记鉴定方法有SRAP标记，SSR 标记和InDel标记。InDel标记作为近年新兴的一种分子生物技术，为锚定标记，无重复序列，稳定性强，准确性高，适用性广。其鉴定成本低，操作简单，结果快速可靠，实用性强序等优点，在基因组中分布均匀。SR标又称微卫星序列标记，其两端序列多为保守的单拷贝序列，多态性丰富，易于检测，但是由于SSR 序列的重复性，使得他在不同品种间的扩增带型不同。而InDel标记的带型比较单一，扩增效率相比SSR标记更高。仪泽会(2012)表明，对于有些位点的SSR 序列无差异的位点，在其侧翼序列中存在InDel序列差异。SRAP标记是对 ORFs(开放阅读框)进行扩增，简单高效、高共显性、重复性、易于分离条带及测序等优点,在基因组中分布均匀的优点，但是由于是对ORFs进行扩增，所以在着丝点附近扩增较少，扩增不均匀。姜童(2017)InDel分子标记CIDH776 可用于三对加工型辣椒雄性不育系与保持系(15005A、15006B，16011A、16012B， 16063A、16064B)间的分子标记辅助鉴定。张曼(2012)筛选出用于辣椒品种 JP-6和H-4真实性鉴定的SSR引物CA885。李亚利(2010)用互补型SRAP引物DC1-EM9和ME5-EM20对航椒4号和航椒5号进行纯度纯度鉴定但是由于是对ORFs进行扩增，所以在着丝点附近扩增较少，扩增不均匀。

目前在辣椒上有几种真实性和纯度鉴定的方法，大多都是对单个品种的鉴定。因不同的加工型辣椒品种之间基因型有所差异，每个杂交种的真实性鉴定引物都不同，不同品种之间的真实性和纯度鉴定引物并不通用，每个加工型辣椒品种都必须有自己引物。在辣椒，尤其在加工型辣椒领域没有一套完整的适用性广的快速鉴定辣椒雄性不育三系配套杂交种真实性的方法。且目前在辣椒中的纯度鉴定没有和真实性鉴定结合，即使进行了纯度鉴定，仍无法确定所鉴定种子的真实性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种基于InDel分子标记鉴定辣椒雄性不育三系配套杂交种真实性和纯度的方法。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种基于InDel分子标记鉴定辣椒雄性不育三系配套杂交种真实性和纯度的方法，所述鉴定方法包括以下步骤：

(1)将待鉴定的辣椒杂交种和其亲本的种子同时进行培育，直至培育成芽苗；

(2)提取芽苗期的辣椒待测材料的DNA；

(3)InDel-PCR扩增：使用核心InDel引物，进行PCR扩增，如果能在PCR 结果中扩增出共显性标记，则待鉴定杂交种为真实性杂交种；

如果无法扩增出共显性标记，则结合次级核心InDel引物继续进行PCR扩增；如果出现共显性标记，则待鉴定杂交种为真实性杂交种。

进一步的：所述核心InDel引物为：CIDH28、CIDH825、CIDH848、CIDH8、 CIDH293、CIDH440、CIDH800、CIDH776、CIDH360、CIDH580、CIDH5、CIDH602、 CIDH131、CIDH373、CIDH302、CIDH426、CIDH267、CIDH307、CIDH200、 CIDH634、CIDH325、CIDH351、CIDH859、CIDH908、CIDH202。

进一步的：所述次级核心InDel引物定位于6号染色体的辣椒育性相关主效基因相关。

进一步的：所述次级核心InDel引物为：CIDH569、CIDH110、CIDH864、 CIDH261、CIDH438、CIDH423、CIDH27、CIDH170、CIDH763、CIDH762、 CIDH694、CIDH70、CIDH112、CIDH565、CIDH951、CIDH640、CIDH209、 CIDH937、CIDH769、CIDH131、CIDH602。

进一步的：所述鉴定方法还包括步骤(4)杂交种纯度鉴定：选择核心InDel 引物和次级核心InDel引物中确定的辣椒杂交种真实性鉴定所应用的共显性标记对应的共显性引物，对待纯度鉴定的辣椒杂交种单株编号和取样，取样≧100株；杂交种单株提取DNA后进行电泳检测；若杂交种单株出现共显性标记，则为真实性杂交种，反之为假杂种，辣椒杂交种纯度＝具有目的共显性标记的株数/待鉴定的总株数×100％。

进一步的：所述步骤(1)中是取待鉴定的杂交种及亲本的种子先进行温汤浸种，然后常温浸泡；然后在光照下催芽培养7-10天。

进一步的：所述步骤(4)中纯度鉴定是在种子发芽后将种子移植至72孔穴盘中，单株标记，基质为发酵菇渣，置于光照培养箱中，白天28℃，夜晚16℃，继续培养5-15天，然后提取DNA检测。

进一步的：所述步骤(3)中PCR反应体系为模板DNA2μl，正反引物各1μl， 2×Go Taq R Colorless Master Mix7.5μl，用ddH2O补充至15μl。

进一步的：所述步骤(3)中PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃变性 30s，退火30s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃总延伸5min。

进一步的：所述辣椒为加工型辣椒。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明提供了一种基于InDel 分子标记鉴定辣椒雄性不育三系配套杂交种真实性和纯度的方法。其方法为：辣椒杂交种和亲本的芽苗培育，DNA提取，在全覆盖辣椒12对染色体的InDel引物中筛选具有多态性的25对鉴定用核心InDel引物。应用核心InDel引物对杂交种的亲本进行筛选，继续筛选出亲本间存在多态性的引物，只有共显性标记对应的引物可以作为该杂交种真实性鉴定的分子标记。若辣椒杂交种亲本在核心引物库中无法筛选出共显性标记，则需在与控制育性相关的6号染色体上的次级核心引物库中继续筛选引物，直至筛选出共显性标记。利用辣椒杂交种真实性鉴定的共显性序列，杂交种单株提取DNA进行纯度鉴定。

本发明利用InDel分子标记为加工型辣椒杂交种真实性鉴定和纯度鉴定提供可靠的核心引物，缩小了引物筛选的范围，通过本发明建立的快速鉴定辣椒雄性不育三系配套杂交种真实性和纯度的体系，将真实性鉴定和纯度鉴定同时进行，可实现对加工型辣椒自有品种的鉴定，且不受时间和季节的限制，在加工型辣椒杂交种子真实性和纯度室内快速鉴定中有很大的应用前景，为加工型辣椒杂交种品种保护和杂交种市场的监管提供分子生物学依据。

附图说明

图1是用于DNA提取的芽苗；

图2是部分核心引物筛选的聚丙烯酰胺电泳图谱；

图3是部分真实性鉴定引物筛选的聚丙烯酰胺图谱；其中M：Marker；1：母本；2：父本；3：F1；

图4是加工型辣椒三系配套杂交种真实性鉴定应用；其中M：Marker；1：母本；2：父本；3：F1；

图5是利用真实性鉴定引物进行加工型辣椒杂交种纯度鉴定的部分电泳图，其中a：应用标记CIDH763鉴定加工型辣椒杂交种“组合1”的纯度，b：应用 CIDH763鉴定加工型辣椒杂交种“组合2”的纯度，M：marker；1：母本；2：父本；3-15：F1单株。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进行详细的说明。

实施例1

一、加工型辣椒杂交种真实性鉴定的材料准备和培育

1、材料准备

本发明中进行加工型辣椒杂交种真实性和纯度鉴定的材料，需要有待鉴定的杂交种和其父母本材料。本发明待鉴定杂交种4个，包括羊角椒、甜色素椒和簇生椒3种类型加工型辣椒，见表1。

表1待鉴定真实性的加工型辣椒杂交种及亲本材料

2、材料培育

(1)取加工型辣椒三系配套的杂交种及其父母本的饱满种子各50粒，分别进行50℃温汤浸种30分钟，常温浸泡8小时。

(2)在培养皿中，底部放置2层滤纸，上层放置1层滤纸，用蒸馏水湿润滤纸。将浸泡好的种子放置于滤纸上，置于28℃培养箱中催芽培养7-10天，期间每天早晚各用蒸馏水冲洗3次，保持滤纸湿润，但注意蒸馏水不能没过种子，芽苗期即可进行鉴定。

(3)纯度鉴定则在种子发芽后将种子移植至72孔穴盘中，单株标记。基质为菇渣，置于光照培养箱中，白天28℃，夜晚16℃，继续培养5-15天。

3、加工型辣椒核基因组DNA提取

将加工型辣椒杂交种及其亲本材料，分别培养至芽苗期，取新鲜芽苗于液氮中研磨，采用CTAB法(2％CTAB配方：CTAB Buffer 100ml、2％CTAB 2g、1.4M NaCl 28ml、20mMNaCl4ml、100mM Tris-HCl 10ml、2％PUP 2g，使用前加1％β- 巯基乙醇1ml，65℃预热)进行DNA提取。紫外吸收检测法对DNA的纯度进行检测，浓度稀释至100ng/μl备用。

DNA提取方法如下：

(1)取加工型辣椒全部芽苗(去掉种皮)1-2g或者全部单株(去掉根部)，于研钵中加液氮磨碎，装入2ml离心管，立即加入65℃预热的2％CTAB，65℃水浴 45min，期间震荡2-3次

(2)加入核酸提取液(氯仿：异戊醇＝24:1)750μl

(3)12000r离心5min，取500上清液于新管中

(4)加入1ml-20℃保存的无水乙醇，产生絮状沉淀后离心5min

(5)去上清，用400μl 75％酒精清洗2次

(6)晾干沉淀，加入100μl d d H2O，彻底溶解后，放入4℃1天后，于紫外分光光度计检测其浓度大于400ng/μl为可用。用dd H2O将浓度稀释至100ng/μl，放入-20℃冰箱保存备用。

4、引物筛选

(1)引物来源

本发明的用于鉴定加工型辣椒种质的InDel分子标记来自于辣椒InDel引物，挑选出60对引物全部覆盖辣椒12对染色体(表2)。

表2 60对引物名称及序列

(2)PCR反应体系

PCR反应体系为模板DNA2μl，正反引物各1μl，2×Go Taq R Colorless Master Mix7.5μl，用ddH2O补充至15μl。

(3)PCR反应程序

PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸45s， 35个循环；最后72℃总延伸5min。

(4)聚丙烯酰胺电泳

配制8％非变性聚丙烯酰胺凝胶

8％非变性聚丙烯酰胺凝胶配方：

30％非变性聚丙烯酰胺溶液 24ml

10XTBE 9ml

ddH2O 60ml

10％过硫酸铵(APS) 550μl

TEMED 90μl

配置好凝胶后，1.5-2小时胶体凝固，组装好电泳仪，加上1XTBE作为缓冲液，拔掉梳子，加PCR产物各2μl。于180V 130mA条件下电泳2小时。于摇床上50rmp银染10分钟，用蒸馏水冲洗3次，显色10分钟至条带清晰。于灯箱上观察，用相机拍照保存。

染色液：890ml蒸馏水，100ml无水乙醇，10ml乙酸，2gAgNO3；

显色液：1000ml蒸馏水，20gNaOH，5ml甲醛。

(5)建立用于加工型辣椒真实性和纯度鉴定的核心引物库。

利用该60对引物对8份表观形态性状差异较大的加工型辣椒(表3)的DNA 进行扩增，筛选出25对有多态性的引物作为核心引物(表4)。部分筛选结果如图2所示。选择能在8份辣椒材料中扩增出多态性条带的引物为核心InDel引物，如图2中CIDH200和CIDH602等；而无扩增或无多态的引物不能入选核心InDel 引物如CIDH552和CIDH59等。

表3用于Indel引物筛选的供试材料

表4用于加工型辣椒雄性不育三系配套杂交种真实性鉴定的核心引物名称及序列

(5)次级核心引物筛选

本发明建立用于加工型辣椒真实性和纯度鉴定的次级核心引物库，此引物是针对利用核心引物中没有筛选出共显性标记的情况。杂交种中同时出现了父母本的目的条带，则为共显性标记，这样的杂交种即为真实性杂交种。于在三系配套体系中的杂交种而言，其亲本的主要差异来自于育性，而辣椒育性相关的主效基因定位于6号染色体。本发明筛选出21对位于6号染色体上的InDel引物(表5)，作为次级核心引物。

表5用于加工型辣椒雄性不育三系配套杂交种真实性鉴定的次级核心引物

(6)真实性鉴定引物筛选

本发明利用所筛选出的亲本多态性引物，通过聚丙烯酰胺电泳进行真实性鉴定。筛选出在亲本和子一代中呈共显性条带的引物(图3-b)，F1中的偏母型带型(图3-a)则不可用。经试验，本发明中确定用于加工型辣椒三系配套4个杂交种的真实性和纯度鉴定的InDel引物不同，结果如下：

羊角椒类型杂交种“组合1”：共显性引物CIDH763F: GGGGTCTCTAAGCGATGTGG、R:GGAAGCGATCTCAAATGCATCT；

甜色素椒类型杂交种“组合2”：共显性引物CIDH859F: TGAGGTTCGCACTAGTCGTG、R:TGCTTCAAAGTCTAGCCCGA；

簇生椒类型杂交种“组合3”：共显性引物CIDH373F: TGAGGTTCGCACTAGTCGTG、R:TGCTTCAAAGTCTAGCCCGA；

甜色素椒类型杂交种“组合4”：共显性引物CIDH293F: GGCGCACTTCACTTTTGAGG、R: AGCTTGTTATGCATTACATCGAGAA。

4、真实性鉴定应用

按照本发明步骤培育幼苗及提取亲本和杂交种中的DNA，利用已筛选出的进行的杂交种真实性鉴定核心InDel引物，进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察其条带，若杂交种为共显性条带，则该杂交种为真正的杂交种子，否则为假杂种。

5、纯度鉴定应用

利用从核心InDel引物和次级核心InDel引物中确定的辣椒杂交种真实性鉴定所应用的共显性引物，对待纯度鉴定的辣椒杂交种单株编号和取样(≧100 株)；杂交种单株提取DNA后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；若杂交种单株出现共显性标记条带，则为真实性杂交种，反之为假杂种。辣椒杂交种纯度＝具有目的共显性标记的株数/待鉴定的总株数×100％。利用该种方法进行纯度鉴定，结果更加真实可靠。如：实施例中杂交种组合1纯度为100％(图5a)，组合2 纯度为93.2％(图5b)。本发明筛选出的用于不同杂交种纯度性鉴定的InDel引物见真实性鉴定引物筛选。

实施例2

本发明提供的基于InDel分子标记鉴定加工型辣椒雄性不育三系配套杂交种真实性和纯度的方法具体包括以下步骤：

(1)待鉴定的加工型辣椒杂交种和亲本培育，直至培育成芽苗；

取加工型辣椒三系配套的杂交种及其父母本的饱满种子各50粒，分别进行 50℃温汤浸种30分钟，常温浸泡8小时。在培养皿中，底部放置2层滤纸，上层放置1层滤纸，用蒸馏水湿润滤纸。将浸泡好的种子放置于滤纸上，置于28℃培养箱中催芽培养7-10天，期间每天早晚各用蒸馏水冲洗3次，保持滤纸湿润，但注意蒸馏水不能没过种子，芽苗期即可进行鉴定。

纯度鉴定则在种子发芽后将种子移植至72孔穴盘中，单株标记。基质为菇渣，置于光照培养箱中，白天28℃，夜晚16℃，继续培养5-15天。

(2)提取芽苗期的辣椒待测材料的DNA；

(3)InDel-PCR扩增：使用真实性鉴定核心InDel引物，进行PCR扩增，如果能在PCR结果中扩增出共显性标记，则该杂交种为真实性杂交种；

PCR反应体系为模板DNA2μl，正反引物各1μl，2×Go Taq R Colorless Master Mix7.5μl，用ddH2O补充至15μl。

PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸45s， 35个循环；最后72℃总延伸5min。

所述真实性鉴定的核心InDel引物为：CIDH28、CIDH825、CIDH848、CIDH8、 CIDH293、CIDH440、CIDH800、CIDH776、CIDH360、CIDH580、CIDH5、CIDH602、 CIDH131、CIDH373、CIDH302、CIDH426、CIDH267、CIDH307、CIDH200、 CIDH634、CIDH325、CIDH351、CIDH859、CIDH908、CIDH202缩小了引物鉴定应用范围。

如果无法扩增出共显性标记，则结合次级核心InDel引物继续进行PCR扩增，如果出现共显性标记，则该杂交种为真实性杂交种。

所述21对位于6号染色体上的次级核心InDel引物为：CIDH569、CIDH110、 CIDH864、CIDH261、CIDH438、CIDH423、CIDH27、CIDH170、CIDH763、 CIDH762、CIDH694、CIDH70、CIDH112、CIDH565、CIDH951、CIDH640、CIDH209、CIDH937、CIDH769、CIDH131、CIDH602。

(4)杂交种纯度鉴定：利用从核心InDel引物和次级核心InDel引物中确定的辣椒杂交种真实性鉴定所应用的共显性引物，对待纯度鉴定的辣椒杂交种单株编号和取样(≧100株)；杂交种单株提取DNA后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；若杂交种单株出现共显性标记条带，则为真实性杂交种，反之为假杂种。辣椒杂交种纯度＝具有目的共显性条带的株数/待鉴定的总株数×100％。该种方法进行纯度鉴定，结果更加真实可靠。

综上，本发明的技术方案具有以下技术效果：

1、本发明建立的加工型辣椒三系配套杂交种真实性和纯度鉴的体系，通过将杂交种培养至芽苗期即可进行DNA提取，InDel-PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳观察其条带。其优点：周期短、操作简单、费用低、稳定性好、条带扩增清晰、易于区分，鉴定结果更为准确，普通实验室即可完成操作。为加工型辣椒的鉴定和保护提供了基础条件。

2、本发明确定了供试杂交种的培育方式，将杂交种在培养皿中培养12-25 天，至芽苗期，即可提取DNA，不受时间季节的限制，相比叶片提取，更加快速。

3、本发明方法将辣椒杂交种的真实性和纯度鉴定相结合，利用真实性鉴定的引物进行纯度鉴定。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种基于InDel分子标记鉴定辣椒雄性不育三系配套杂交种真实性和纯度的方法

<160> 92

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA