本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种γ-聚谷氨酸的合成菌株以及高效制备大分子γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术：
γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamicacid，以下简称γ-pga）是由d-谷氨酸和l-谷氨酸单体通过γ-酰胺键连接而成的一类均聚氨基酸，可由微生物发酵合成。由于γ-pga具有极佳的成膜性、成纤维性、可塑性、粘合性、保湿型、可降解性等优异的理化和生物学特性，在工农业、化妆品与医药等领域极具应用潜力。
聚谷氨酸的制备方法有化学合成、提取和微生物发酵三种方法。微生物发酵法比前两种方法的生产成本低，生产过程对环境的污染小，产量高等优势，所以现在主要采用微生物发酵法生产γ-pga。国内外对γ-pga的发酵工艺进行了广泛的研究，主要以液体深层发酵的培养基配方和培养工艺为主。南京工业大学筛选得到一种γ-pga高产菌株bacillussubtilisnx-2，并对液体发酵生产γ-pga做了比较全面的研究，并申请了专利，专利公开号为cn1346891.华中农业大学也进行了γ-pga产生菌的筛选和工艺的研究，其菌种和液体生产工艺也已经申请了专利，专利公开号为cn1536071.kubota在osakacityuniversity土壤中分离得到一种bacillussubtilisf201，该菌株在最佳发酵条件下可达到50g/l的最高产量，这是文献报道的最高产量（kubotah.bioscibiotecbiochem，1993:1212-1213）。
虽然γ-pga的发酵生产取得了较大的进展，但是仍然存在生产周期较长，生产效率低下的问题。因此，高产量、高效率、低成本生产γ-pga仍有待进一步研究。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种γ-聚谷氨酸高产菌，该菌株能够高效合成高分子量的γ-聚谷氨酸。
本发明还要解决的技术问题是提供利用上述γ-聚谷氨酸生产菌制备γ-聚谷氨酸的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
申请人从盐碱地土壤中筛选得到一种γ-聚谷氨酸产生菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌（bacillussubtilishzy-1），该菌株已保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号cctccm2018226,保藏日期为2018年4月23日。其性状特征如下所述：
（1）形态特征
在lb琼脂培养基上营养细胞为0.6-1.2x1.2-4um大小的杆菌，37℃培养2-3天形成芽孢，芽孢大小为0.3-0.7x1.0-2.0um，为椭圆形。
（2）培养性质
1）葡萄糖、酵母膏、琼脂培养基平板培养：30-35℃培养12h可大量生长，菌落呈圆形，边缘整齐湿润、粘稠、半透明状。
2）葡萄糖、酵母膏液体培养基：在液体表面形成白色的菌膜，培养液浑浊。
3)葡萄糖、酵母膏穿刺培养：菌体在表面生长，底部不生长。
（3）生理生化性质：如表1所示
表1bacillussubtilishzy-1的生理生化性质
（4）16srdna序列分析
测得16srdna大部分序列，长度1426bp，具体如seqidno.1所示。将所测序列与genbank数据库中的相关种进行比较，构建以16srdna全序列为基础的系统发育树，具体如seqidno.2所示。结果表明该菌株与枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）同源性为99%。结合形态、细胞化学成分及16srdna全序列分析的系统发育研究结果，可以将其分类定位为枯草芽孢杆菌，具体为枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）w84的一个亚种.
菌株bacillussubtilisw84可采用如下防水剂保藏：将bacillussubtilisw84接于固体平板培养基，30-37℃培养10-24h，可用于4℃短期保藏。或将培养好的bacillussubtilisw84接入20-40%（v/v）无菌甘油冻存管中，-50—-80℃冷冻长期保藏。
γ-聚谷氨酸产生菌可用于生产γ-聚谷氨酸。
利用上述的γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：
（1）种子培养：将活化后的bacillussubtilisw84菌种接种于含有碳源、氮源、谷氨酸钠、无机盐和水的无菌种子培养基中，摇床温度30-37℃，转速150-220rpm振荡培养8-14h至对数生长期中期。
（2）发酵培养：将种子液接入含有碳源、氮源、谷氨酸钠、无机盐和水的无菌发酵培养基中，接种量1-10%（v/v），摇瓶装液量50-500ml/1000ml，摇床温度30-37℃，转速180-220rpm下培养24-36h；或者接入含有碳源、氮源、谷氨酸钠、无机盐和水的无菌发酵罐中，接种量1-10%（v/v），通气量0.4-3.0vvm，30-37℃下培养24-40h。
（3）γ-pga的提取与纯化：①发酵液的酸化处理：调发酵液ph至2.0-4.5；②发酵液除菌：采用微滤膜滤除菌体；③超滤浓缩：加入3-10倍体积的纯净水稀释，采用超滤膜对稀释后的无菌发酵液进行浓缩除杂，并重复稀释浓缩步骤3-5次，直至浓缩后的体积为原发酵液的15-50%；④γ-聚谷氨酸的分离纯化：将超滤浓缩后的液体调ph3.0-7.5后，直接采用低级醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-聚谷氨酸成品；或将超滤浓缩后的液体调ph至5.0-7.5后，加入钠盐后，在采用低级醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-聚谷氨酸盐的成品。
其中，种子培养基或发酵培养基中，碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、柠檬酸钠和糖蜜中的任意一种或几种任意比例的组合；优选葡萄糖、蔗糖、柠檬酸钠中的任意一种或几种任意比例的组合；最优选葡萄糖。氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母膏、玉米浆、尿素、氯化铵、硫酸铵中的任意一种或几种任意比例的组合；优选蛋白胨、酵母膏和硫酸铵中的任意一种或几种任意比例的组合。无机盐为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸锰和氯化钙中的一种或几种任意比例的组合。
其中，种子培养基包含如下浓度的组分：碳源20-100g/l、氮源5-50g/l、谷氨酸钠10-100g/l、无机盐0.5-50g/l,其余为水，ph6.0-7，5；优选的方式是种子培养基包含如下浓度的组分:碳源20-40g/l、氮源15-40g/l、谷氨酸钠10-50g/l、无机盐4-50g/l,其余为水，ph6.5-7，5。
其中，发酵培养基包含如下组分碳源20-100g/l、氮源5-50g/l、谷氨酸钠10-160g/l、无机盐0.5-50g/l,其余为水，ph5.5-7.5。优选的方式是发酵培养基包含如下浓度的组分:碳源40-100g/l、氮源15-40g/l、谷氨酸钠50-150g/l、无机盐10-50g/l,其余为水，ph6.5-7，5。
步骤（2）中要分批补加碳源。
步骤（2）中要分批补加谷氨酸钠。
步骤（2）中要适时调节培养基的ph值。
步骤（3）中微滤除菌所使用的微滤膜孔径为0.1-0.5um。
步骤（3）中超滤浓缩所使用的超滤膜截留分子量为200-1500kda。
步骤（3）中所述的低级醇为甲醇或乙醇。
步骤（3）中所用于调节ph值的物质为硫酸、盐酸、磷酸、氢氧化钠、氢氧化钾或氨水。
步骤（3）中γ-聚谷氨酸的分离和纯化时加入的钠盐为氯化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸铵、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠或谷氨酸钠中的一种或几种任意比例的组合。
步骤（3）中分离和纯化γ-聚谷氨酸时加入的钠盐的含量为0.5-20%。
本发明方法获得的γ-pga产品理化性质如下：
本产品能溶于水，不溶于甲醇、乙醇和丙酮等有机溶剂；本产品经高温酸水解后与茚三酮显色反应呈阳性；水解产物经氨基酸分析仪检测只出现一个谷氨酸峰。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有以下优势：
1）本发明使用的枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）w84对碳源和氮源的利用较为广泛，且可以直接利用谷氨酸钠。这对于实现γ-pga的工业化生产是极其有利的条件。
2）通过对培养条件的优化，本发明使用的枯草芽孢杆菌微生物菌株bacillussubtilisw84可以高效的发酵生产γ-pga，产量可达60-120g/l。
3）本发明使用的枯草芽孢杆菌微生物菌株bacillussubtilisw84制备的γ-pga的分子量主要集中于1000kda以上。这一特性使得本发明所生产的γ-聚谷氨酸可广泛应用在农业、化妆品等领域。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应该也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
一种γ-聚谷氨酸产生菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌（bacillussubtilishzy-1），该菌株已保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号cctccm2018226,保藏日期为2018年4月23日。其性状特征如下所述：
（1）形态特征
在lb琼脂培养基上营养细胞为0.6-1.2x1.2-4um大小的杆菌，37℃培养2-3天形成芽孢，芽孢大小为0.3-0.7x1.0-2.0um，为椭圆形。
（2）培养性质
1）葡萄糖、酵母膏、琼脂培养基平板培养：30-35℃培养12h可大量生长，菌落呈圆形，边缘整齐湿润、粘稠、半透明状。
2）葡萄糖、酵母膏液体培养基：在液体表面形成白色的菌膜，培养液浑浊。
3)葡萄糖、酵母膏穿刺培养：菌体在表面生长，底部不生长。
（3）生理生化性质：如表1所示
表1bacillussubtilishzy-1的生理生化性质
（4）16srdna序列分析
测得16srdna大部分序列，长度1426bp，具体如seqidno.1所示。将所测序列与genbank数据库中的相关种进行比较，构建以16srdna全序列为基础的系统发育树，具体如seqidno.2所示。结果表明该菌株与枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）同源性为99%。结合形态、细胞化学成分及16srdna全序列分析的系统发育研究结果，可以将其分类定位为枯草芽孢杆菌，具体为枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）w84的一个亚种.
菌株bacillussubtilisw84可采用如下防水剂保藏：将bacillussubtilisw84接于固体平板培养基，30-37℃培养10-24h，可用于4℃短期保藏。或将培养好的bacillussubtilisw84接入20-40%（v/v）无菌甘油冻存管中，-50—-80℃冷冻长期保藏。
γ-聚谷氨酸产生菌可用于生产γ-聚谷氨酸。
利用上述的γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：
（1）种子培养：将活化后的bacillussubtilisw84菌种接种于含有碳源、氮源、谷氨酸钠、无机盐和水的无菌种子培养基中，摇床温度30-37℃，转速150-220rpm振荡培养8-14h至对数生长期中期。
（2）发酵培养：将种子液接入含有碳源、氮源、谷氨酸钠、无机盐和水的无菌发酵培养基中，接种量1-10%（v/v），摇瓶装液量50-500ml/1000ml，摇床温度30-37℃，转速180-220rpm下培养24-36h；或者接入含有碳源、氮源、谷氨酸钠、无机盐和水的无菌发酵罐中，接种量1-10%（v/v），通气量0.4-3.0vvm，30-37℃下培养24-40h。
（3）γ-pga的提取与纯化：①发酵液的酸化处理：调发酵液ph至2.0-4.5；②发酵液除菌：采用微滤膜滤除菌体；③超滤浓缩：加入3-10倍体积的纯净水稀释，采用超滤膜对稀释后的无菌发酵液进行浓缩除杂，并重复稀释浓缩步骤3-5次，直至浓缩后的体积为原发酵液的15-50%；④γ-聚谷氨酸的分离纯化：将超滤浓缩后的液体调ph3.0-7.5后，直接采用低级醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-聚谷氨酸成品；或将超滤浓缩后的液体调ph至5.0-7.5后，加入钠盐后，在采用低级醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-聚谷氨酸盐的成品。
其中，种子培养基或发酵培养基中，碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、柠檬酸钠和糖蜜中的任意一种或几种任意比例的组合；优选葡萄糖、蔗糖、柠檬酸钠中的任意一种或几种任意比例的组合；最优选葡萄糖。氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母膏、玉米浆、尿素、氯化铵、硫酸铵中的任意一种或几种任意比例的组合；优选蛋白胨、酵母膏和硫酸铵中的任意一种或几种任意比例的组合。无机盐为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸锰和氯化钙中的一种或几种任意比例的组合。
其中，种子培养基包含如下浓度的组分：碳源20-100g/l、氮源5-50g/l、谷氨酸钠10-100g/l、无机盐0.5-50g/l,其余为水，ph6.0-7，5；优选的方式是种子培养基包含如下浓度的组分:碳源20-40g/l、氮源15-40g/l、谷氨酸钠10-50g/l、无机盐4-50g/l,其余为水，ph6.5-7，5。
其中，发酵培养基包含如下组分碳源20-100g/l、氮源5-50g/l、谷氨酸钠10-160g/l、无机盐0.5-50g/l,其余为水，ph5.5-7.5。优选的方式是发酵培养基包含如下浓度的组分:碳源40-100g/l、氮源15-40g/l、谷氨酸钠50-150g/l、无机盐10-50g/l,其余为水，ph6.5-7，5。
步骤（2）中要分批补加碳源。
步骤（2）中要分批补加谷氨酸钠。
步骤（2）中要适时调节培养基的ph值。
步骤（3）中微滤除菌所使用的微滤膜孔径为0.1-0.5um。
步骤（3）中超滤浓缩所使用的超滤膜截留分子量为200-1500kda。
步骤（3）中所述的低级醇为甲醇或乙醇。
步骤（3）中所用于调节ph值的物质为硫酸、盐酸、磷酸、氢氧化钠、氢氧化钾或氨水。
步骤（3）中γ-聚谷氨酸的分离和纯化时加入的钠盐为氯化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸铵、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠或谷氨酸钠中的一种或几种任意比例的组合。
步骤（3）中分离和纯化γ-聚谷氨酸时加入的钠盐的含量为0.5-20%。
下面结合具体的实施例，详细描述本发明的γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法。
实施例1：
斜面培养基组分：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，琼脂15g/l，ph7.0,121℃灭菌20分钟。
种子培养基的配制：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，ph7.0，121℃灭菌20分钟。
发酵培养基配制：葡萄糖40g/l，蛋白胨5g/l，谷氨酸钠30g/l，k2hpo4·3h2o2g/l，mgso40.25g/l，硫酸铵3g/l，硫酸锰0.1g/l,ph7.0，115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）w84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量为20ml/250ml,摇床转速200rpm，37℃培养24h。
发酵结束后，检测发酵液γ-pga含量约达65g/l。硫酸调发酵液ph至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量500kda）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调ph至6.5，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-pga。
实施例2：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖20g/l；谷氨酸钠5g/l；磷酸氢二钾2g/l；硫酸镁2.5g/l；酵母膏5g/l；硫酸锰0.2g/l，ph7.0。115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
发酵培养基的配制：葡萄糖40g/l，蛋白胨5g/l，谷氨酸钠50g/l，磷酸氢二钾8g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸铵3g/l，硫酸锰0.1g/l,ph7.0，115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）w84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量为20ml/250ml,摇床转速200rpm，37℃培养20h。
发酵结束后，检测发酵液γ-pga含量约达80g/l。硫酸调发酵液ph至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量500kda）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调ph至6.5，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-pga。
实施例3：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖20g/l；谷氨酸钠5g/l；磷酸氢二钾2g/l；硫酸镁2.5g/l；酵母膏5g/l；硫酸锰0.2g/l，ph7.0。115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
发酵培养基的配制：蔗糖40g/l，蛋白胨5g/l，谷氨酸钠50g/l，磷酸氢二钾8g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸铵3g/l，硫酸锰0.1g/l,ph7.0，115℃灭菌15分钟。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）w84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量为20ml/250ml,摇床转速200rpm，37℃培养20h。
发酵结束后，检测发酵液γ-pga含量约达70g/l。硫酸调发酵液ph至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量500kda）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调ph至6.5，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-pga。
实施例4：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖20g/l；谷氨酸钠5g/l；磷酸氢二钾2g/l；硫酸镁2.5g/l；酵母膏5g/l；硫酸锰0.2g/l，ph7.0。115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
发酵培养基的配制：糖蜜40g/l，蛋白胨5g/l，谷氨酸钠50g/l，磷酸氢二钾8g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸铵3g/l，硫酸锰0.1g/l,ph7.0，115℃灭菌15分钟。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）w84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量为20ml/250ml,摇床转速200rpm，37℃培养20h。
发酵结束后，检测发酵液γ-pga含量约达78g/l。硫酸调发酵液ph至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量500kda）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调ph至6.5，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-pga。
实施例5：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖20g/l；谷氨酸钠5g/l；磷酸氢二钾2g/l；硫酸镁2.5g/l；酵母膏5g/l；硫酸锰0.2g/l，ph7.0。115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
发酵培养基的配制：葡萄糖40g/l，酵母膏5g/l，谷氨酸钠50g/l，磷酸氢二钾8g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸铵3g/l，硫酸锰0.1g/l,ph7.0，115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）w84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量为20ml/250ml,摇床转速200rpm，37℃培养20h。
发酵结束后，检测发酵液γ-pga含量约达87g/l。硫酸调发酵液ph至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量500kda）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调ph至6.5，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-pga。
实施例6：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖20g/l；谷氨酸钠5g/l；磷酸氢二钾2g/l；硫酸镁2.5g/l；酵母膏5g/l；硫酸锰0.2g/l，ph7.0。115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
发酵培养基的配制：葡萄糖40g/l，酵母粉5g/l，谷氨酸钠50g/l，磷酸氢二钾8g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸铵3g/l，硫酸锰0.1g/l,ph7.0，115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）w84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量为20ml/250ml,摇床转速200rpm，37℃培养20h。
发酵结束后，检测发酵液γ-pga含量约达89g/l。硫酸调发酵液ph至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量500kda）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调ph至6.5，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-pga。
实施例7：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖20g/l；谷氨酸钠5g/l；磷酸氢二钾2g/l；硫酸镁2.5g/l；酵母膏5g/l；硫酸锰0.2g/l，ph7.0。115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
发酵培养基的配制：葡萄糖40g/l，玉米浆5g/l，谷氨酸钠50g/l，磷酸氢二钾8g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸铵3g/l，硫酸锰0.1g/l,ph7.0，115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）w84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量为20ml/250ml,摇床转速200rpm，37℃培养20h。
发酵结束后，检测发酵液γ-pga含量约达75g/l。硫酸调发酵液ph至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量500kda）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调ph至6.5，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-pga。
实施例8：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖20g/l；谷氨酸钠5g/l；磷酸氢二钾2g/l；硫酸镁2.5g/l；酵母膏5g/l；硫酸锰0.2g/l，ph7.0。115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
发酵培养基的配制：葡萄糖45g/l，蛋白胨5g/l，谷氨酸钠45g/l，磷酸氢二钾12g/l，磷酸二氢钾2g/l，硫酸镁2.5g/l，硫酸铵5g/l，硫酸锰0.1g/l,ph7.0，115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）w84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量为20ml/250ml,摇床转速200rpm，37℃培养20h。
发酵结束后，检测发酵液γ-pga含量约达97g/l。硫酸调发酵液ph至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量500kda）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调ph至6.5，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-pga。
实施例9：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖20g/l；谷氨酸钠5g/l；磷酸氢二钾2g/l；硫酸镁2.5g/l；酵母膏5g/l；硫酸锰0.2g/l，ph7.0。115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
发酵培养基的配制：葡萄糖45g/l，蛋白胨5g/l，谷氨酸钠45g/l，磷酸氢二钾12g/l，磷酸二氢钾2g/l，硫酸镁2.5g/l，硫酸铵5g/l，硫酸锰0.1g/l,ph7.0，115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）w84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入6l发酵罐中培养基中，接种量5%（v/v），发酵罐装液量4l,转速280rpm，33℃培养24h。
发酵过程中根据发酵液中残糖量和谷氨酸量，及时补加葡萄糖和谷氨酸钠，使其维持适当浓度。
发酵结束后，检测发酵液γ-pga含量约达118g/l。硫酸调发酵液ph至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量800kda）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调ph至6.5，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-pga。
实施例10：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖20g/l；谷氨酸钠5g/l；磷酸氢二钾2g/l；硫酸镁2.5g/l；酵母膏5g/l；硫酸锰0.2g/l，ph7.0。115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
发酵培养基的配制：葡萄糖45g/l，蛋白胨5g/l，谷氨酸钠45g/l，磷酸氢二钾12g/l，磷酸二氢钾2g/l，硫酸镁2.5g/l，硫酸铵5g/l，硫酸锰0.1g/l,ph7.0，115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）w84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入6l发酵罐中培养基中，接种量5%（v/v），发酵罐装液量4l,转速280rpm，33℃培养24h。
发酵过程中根据发酵液中残糖量和谷氨酸量，及时补加葡萄糖和谷氨酸钠，使其维持适当浓度。
发酵结束后，检测发酵液γ-pga含量约达118g/l。硫酸调发酵液ph至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量800kda）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调ph至6.5，加入2%的碳酸氢钠或碳酸钠固体，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到白色粉末晶体γ-pga。
实施例11
一种γ-聚谷氨酸产生菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌（bacillussubtilishzy-1），该菌株已保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号cctccm2018226,保藏日期为2018年4月23日。
实施例12
γ-聚谷氨酸产生菌的用途，可用于生产γ-聚谷氨酸。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
核苷酸或氨基酸序列表
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序列表
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