本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种幽门螺旋杆菌的深层液体培养方法。
（二）
背景技术：
1983年，澳大利亚学者marshall和warren成功地从胃炎和消化性溃疡患者的胃粘膜标本中分离出幽门螺旋杆菌。
幽门螺旋杆菌（helicobacterpylori，简称hp），革兰氏阴性，弯曲杆菌目，螺旋杆菌科，寄生在胃粘膜上皮与粘液间，是目前发现唯一能够在胃内存活的微生物。资料研究表明，幽门螺旋杆菌感染与慢性胃炎¸消化性胃溃疡和淋巴瘤的发病密切相关，根除幽门螺旋杆菌可有效预防上述疾病。目前如何根除hp所致的消化系统疾病已成为消化界学者关注的热点。
我国幽门螺旋杆菌感染率超过50%，儿童/青少年的感染率为25%-30%，根治幽门螺旋杆菌的方法是采用以抗生素治疗为主的三联或四联疗法。随着幽门螺旋杆菌耐药性的提高，其根除率降低；幽门螺旋杆菌感染作为一种感染性疾病，最理想的治疗策略是应用疫苗和抗体，在疫苗和抗体的研制和生产过程中需要大量的幽门螺旋杆菌菌体抗原。目前文献报道中提供的幽门螺旋杆菌培养方法一般是采用固体斜面¸固体平板或液体摇瓶培养方法，这些方法仅能提供少量的幽门螺旋杆菌菌体，不能够满足工业化幽门螺旋杆菌抗原生产的需要。
（三）
技术实现要素：
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种步骤简单、生产成本低的幽门螺旋杆菌的深层液体培养方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种幽门螺旋杆菌的深层液体培养方法，包括如下步骤：
（1）将布氏肉汤培养基装入三角瓶，三角瓶的橡胶塞上装有带无菌过滤器的进出气管，灭菌后向三角瓶内加入胎牛血清，加入平板培养的幽门螺旋杆菌的菌丝体；
（2）通过橡胶塞上的进出气管将三角瓶内的气体用三元气置换，之后于37℃下进行摇床培养，中间换气若干次；
（3）将布氏肉汤培养基加入种子罐，灭菌后加入胎牛血清，接入培养好的幽门螺旋杆菌摇瓶培养液，37℃下于三元气保护下培养，控制溶氧大于25%；
（4）将培养好的幽门螺旋杆菌种子液转入发酵罐内的布氏肉汤培养基中，加入胎牛血清连续或间歇通入三元气使溶氧维持在25%以上，37℃下培养至耗氧量变缓，放罐，得到产品。
hp由于其特殊的生物学特性，对培养条件要求十分苛刻，空气或厌氧条件下都会对其产生抑制作用。本发明培养过程始终处于三元气体的保护下，避免了因长时间暴露于空气中而使菌种的活性受到抑制。
本发明的更优技术方案为：
步骤（1）、（3）和（4）中，胎牛血清于56℃下保温0.5h进行补体去除，之后再使用。
步骤（2）、（3）和（4）中，三元气为体积比为5:15:80的氧气、二氧化碳和氮气的混合气体。
步骤（1）中，胎牛血清的添加量为布氏肉汤培养基质量的8-12%，幽门杆菌的接种量为1-2个平板/200ml培养液。
步骤（3）中，种子罐中培养液的od600值为0.1-0.3，胎牛血清的添加量为培养液质量的4-8%，接种量为5-10%。
步骤（4）中，发酵罐中培养液的od600值为0.2-0.6，胎牛血清的添加量为培养液质量的0-4%，接种量为1-5%。
步骤（3）的种子罐和步骤（4）的发酵罐中，溶氧零点值标定为1%，标定条件为121℃灭菌保压阶段。
步骤（3）的种子罐和步骤（4）的发酵罐中，斜率值标定条件为灭菌后降温至37℃，吹干滤芯，用三元气置换种子罐或发酵罐内的空气，保持罐压0.05mpa，至溶氧显示值2-5分钟内跳动幅度小于2%。
本发明步骤简单，培养基中仅使用少量胎牛血清，大大低于传统浅层培养基中10%的添加量，生产成本大幅度降低，填补了目前国内外幽门螺旋杆菌深层液体培养的技术空白，为幽门螺旋杆菌抗原的工业化生产奠定了基础。
（四）具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
（1）取3.9g哥伦比亚琼脂粉，定容至100ml，25℃下ph7.3±0.2，121℃灭菌15min，冷却至30-40℃；每100ml加入8ml脱纤维羊血，混匀，倒入平皿，待凝固后，倒置备用。冰箱冷藏储存时间不超过2周；
（2）从深冷冰箱取hp冷冻管1只，室温融化；
（3）用移液枪吸取100μl加入制备好的无菌血平板培养基，用涂布棒涂布均匀；
（4）倒置放入真空罐中，盖好罐盖。连接真空泵，开启真空泵，打开罐盖上的排气阀，抽真空至-0.095mpa以下。关闭排气阀，关闭真空泵，断开连接。然后连接装有三元气的气瓶，打开真空罐盖上的进气阀，打开气瓶阀门，充气至真空罐上的压力表为0.05-0.06mpa，关闭气瓶和真空罐阀门；
（5）将真空罐放入37℃恒温培养箱培养48-72h，即为hp固体平板。
实施例2：
（1）取28g布氏肉汤，溶于1000ml蒸馏水中，分装三角瓶，每750ml三角瓶中分装200ml；
（2）三角瓶配有橡胶塞，并装有带无菌过滤器的排气管和进气管，121℃灭菌15min，备用；
（3）将胎牛血清于56℃水浴加热30min，去除补体；
（4）接种时，每200ml布氏肉汤中加入去除补体的胎牛血清20ml；
（5）从三角瓶中吸取2ml布氏肉汤于2ml冷冻管中，用接种铲将2个平板中的hp菌层全部刮下，放入冷冻管中，轻轻研磨，振荡均匀；
（6）用吸管将以上2ml菌液全部接入装有200ml布氏肉汤的三角瓶中，塞上胶塞，用真空泵抽真空至-0.09mpa以下，然后冲入三元气；
（7）于37℃培养48h，摇床转速100转/分；培养期间，每天通入三元气2次，每次1小时；
（8）摇瓶种子液指标：菌丝细长，呈s、双s或多s形，弯曲度小，od600值0.1-0.3。
实施例3：
（1）称取布氏肉汤培养基224g，用去离子水溶解，加入10l全自动发酵罐中，定容至4.6l；
（2）121℃，15分钟灭菌，消后体积7l左右；保压期间，溶氧零点值标定为1%；
（3）用无菌压缩空气向发酵罐中通气1h左右，流量0.4-1.2m³/h，吹干滤芯；
（3）将压缩空气切换为三元气，对发酵罐中的空气进行置换，至ph由7.5左右下降为6.5左右并保持稳定，溶氧显示值下降至稳定值并于2分钟内跳动幅度小于2%，罐压稳定在0.05mpa，此时标定斜率值为100%；
（4）点燃火焰圈，打开接种盖，接入实例2中培养好的hp摇瓶种子液400ml，加入去除补体的胎牛血清400ml，用三元气保压；
（5）压力保持0.05-0.07mpa，发酵罐转速300转/分钟,37℃培养；
（6）溶氧下降至40%，开始通入三元气0.5h，流量0.1m³/h；之后间歇通入三元气，使溶氧维持在40%以上；
（7）培养至36h左右，转种。种子指标：菌丝细长，呈s、双s或多s形，弯曲度小，od600值0.2-0.6，耗氧量旺盛，无c形、o形等异形菌丝。
实施例4：
（1）称取布氏肉汤培养基5600g，用去离子水溶解，加入500l全自动发酵罐中，定容至135l；
（2）121℃，15分钟灭菌，消后体积200l左右；保压期间，溶氧零点值标定为1%；
（3）用无菌压缩空气向发酵罐中通气1h左右，流量12-20m³/h，吹干滤芯；
（4）将压缩空气切换为三元气，对发酵罐中的空气进行置换，置换完毕，标定溶氧斜率值为100%；
（5）移种管道消毒2h，将实例3中培养好的hp种子液7l全部接入发酵罐中；
（6）移种完毕，将4l胎牛血清从种子罐接种口加入种子罐中并压入发酵罐中；
（7）用三元气将压力保持在0.05-0.07mpa，发酵罐转速300转/分钟，37℃培养；
（8）溶氧下降至40%，开始连续通入三元气，流量0.2m³/h；全程溶氧维持在40%-60%，溶氧低，则提高通气量和加大转速；
（9）30h后，hp菌耗氧量逐渐下降，降低三元气通气量或改成间歇通气，36h左右放罐；
（10）指标：90%以上菌丝细长，呈s或双s形，od600值0.3-0.8，少量菌丝呈弯杆或c形；
（11）hp培养液降温至10℃以下放罐，用管式离心机离心，收集hp菌体，冷藏或冻藏备用。