含驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶基因的重组载体构建及表达、分离纯化方法与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及含驯鹿nadph-细胞色素p450还原酶基因的重组载体及编码蛋白表达、分离纯化和活性测定的方法。

背景技术

nadph-细胞色素p450还原酶(nadph-cytochromep450reductase，cpr)是一种以fad和fmn作为辅基的细胞微粒体复合黄素蛋白，可以催化氧化型细胞色素c生成还原型细胞色素c(见附图1)，在人体主要分布于肝脏，分子量约78kd，是肝微粒体混合功能氧化酶-细胞色素p450酶系的重要组分。细胞色素p450(cytochromep450或cyp450，简称cyp450)代表着一个很大的可自身氧化的亚铁血红素蛋白家族，属于单氧酶的一类，因其在450纳米有特异吸收峰而得名。因其在内源性(如类固醇、类花生酸物质和脂肪酸)和外源性的化学物质(包括药物、植物毒素、致癌物质和环境污染物等)尤其在昆虫对杀虫剂的抗性机制以及选择毒性中，昆虫对寄主植物的适应性等方面和环境有害化学物质的氧化代谢方面起着重要的作用，而受到广泛的重视。此外，推测它能导致线粒体功能紊乱、细胞凋亡，还可能参与了一些疾病的发生，比如帕金森综合症。

现今，nadph-细胞色素p450还原酶的研究也逐渐受到生物医学领域的重视。cpr是哺乳动物体内具有重要生理作用的辅酶，它不但是细胞色素p450、血红素加氧酶和角鲨烯单加氧酶的电子供体，而且还能为7-胆固醇脱氢酶还原酶、细胞色素b5以及其他催化固醇合成、脂肪酸去饱和及延伸途径的酶蛋白提供电子。它可以催化底物的单电子还原，使带有不配对电子的底物自由基与分子氧结合，产生活性氧，这就是黄素蛋白酶催化的氧化还原循环。在这一循环中需要消耗nadph，其氧化速率可以反映细胞色素p-450重组酶系对底物的代谢情况。另外，在肿瘤细胞中转入cpr基因，有助于提高抗肿瘤药物的药物细胞毒作用。cpr不仅对某些有害物质有一定的代谢作用，而且是细胞色素p450酶系电子传递链上一个关键的酶。

总之，作为机体代谢系统的一个重要酶类，对nadph-细胞色素p450还原酶的研究一方面可以在一定程度上解决耐药性的问题，因其对某些有害物质的代谢作用，也可用于疾病的防御与治疗等有助于对药物代谢途径的正确分析，包括诱导、抑制，以及药物之间的相互作用；另一方面，作为重要的供氢酶，在生物转化工程、肿瘤治疗及生物制氢研究中cpr也将发挥重要作用，甚至意义还远不止如此。驯鹿的nadph-细胞色素p450还原酶催化活性比较高，然目前为止并未见报道。

本发明旨在提供一种涉及含驯鹿nadph-细胞色素p450还原酶基因的重组载体及编码蛋白表达、分离纯化和活性测定的方法。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种涉及含驯鹿nadph-细胞色素p450还原酶基因的重组载体及编码蛋白表达、分离纯化和活性测定的方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案如下：

1)根据从驯鹿的基因组上注释出的nadph-细胞色素p450还原酶基因和大肠杆菌密码子偏好性，得到优化后的驯鹿nadph-细胞色素p450还原酶核酸序列，同时，得到根据大肠杆菌密码子偏好性优化后的狍子和羊的nadph-细胞色素p450还原酶，用以作为驯鹿nadph-细胞色素p450还原酶的对照；

2)利用设计的引物，通过gibson连接方法，将优化后的驯鹿、狍子和羊nadph-细胞色素p450还原酶基因、adx和adr分别构建于大肠杆菌表达载体pet-28a，质粒的核酸验证结果见附图4，获得表达质粒如图1、2和3所示；

3)将表达质粒分别转入大肠杆菌高效表达菌株bl21(de3)中，将载有表达质粒的菌株在2yt培养基中培养，经过iptg诱导表达，菌体收集，高压破碎，之后过镍离子柱纯化，得到目的蛋白，跑sds-page蛋白胶电泳，验证其大小，见附图5，在人工合成体系中作反应，检测其活性还原型细胞色素c的生成速率，然后利用蛋白测定试剂盒检测其蛋白浓度，计算nadph-细胞色素p450还原酶蛋白活性；

4)检测结果显示，含驯鹿nadph-细胞色素p450还原酶基因的菌株表达获得酶的催化活性是含羊nadph-细胞色素p450还原酶基因的菌株表达获得酶的20倍，是含狍子nadph-细胞色素p450还原酶基因的菌株表达获得酶的5倍(见附图6)。

附图说明

图1为驯鹿的nadph-细胞色素p450还原酶质粒图谱；

图2为狍子的nadph-细胞色素p450还原酶质粒图谱；

图3为羊的nadph-细胞色素p450还原酶质粒图谱；

图4为本发明中构建好的质粒核酸验证结果；

图5为本发明实施过程中的sds-page电泳图；

图6为本发明实施过程中的nadph-细胞色素p450还原酶活性对比结果。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1质粒构建过程：

根据gibson技术的要求设计好本发明中需要的引物(引物的5f端带有20-40bp左右同源臂)，将根据大肠杆菌密码子偏好优化后的基因和pet-28a载体分别利用pcr技术线性化，然后将线性化后的基因和载体加入到gibson体系中，孵育，连接，转化大肠杆菌dh5α，进行质粒扩增，挑取单克隆，验证，留阳性克隆备用。

实施例2表达载体转化过程：

将上述阳性克隆提取质粒，取200ng该质粒，与50μl商业大肠杆菌感受态bl21(de3)混合均匀，冰上孵育30min，然后42℃热击45s，再在冰上放置2min，然后加入300μl的lb培养基，37℃复苏1h，后涂布于有卡那霉素抗性(pet28a质粒为卡那抗性)的lb固体平板培养基中。过夜培养，挑取单克隆验证，阳性克隆留取备用。

实施例3蛋白的表达纯化：

1)种子液培养：挑取上述包含目的质粒的bl21(de3)菌株，接种于含5mllb液体培养基(kan+，100μg/ml)的小试管中，37℃、220rpm过夜培养，作为种子液。

2)转接：将种子液按1％接种量转入800ml2yt液体培养基(kan+，100μg/ml)中，37℃、220rpm，摇床培养(约4-6h)至od600约为0.6-0.8。

3)诱导：降低摇床温度至16℃，待培养的菌液温度降低后，加入异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthio-β-d-galactoside，iptg)至终浓度0.5mm，诱导表达14-16h。

4)收菌：表达完成后，将上述培养菌液收集到瓶中，将离心机预冷到4℃，6000rpm，离心30min。

5)清洗：去除上清，加入30ml蛋白缓冲液(磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液)，用旋涡振荡器重悬菌体。将重悬的菌体再次离心6000rpm，10min。倒掉上清，加入30ml蛋白缓冲液，用旋涡振荡器将菌体重悬(不能有固体颗粒状)，倒入50ml离心管中，-80℃冰箱保存。

6)破菌：将上述收集好的菌液采用高压低温破碎仪在压力1200bar，4℃条件下进行破菌3-4次，使细胞充分裂解，从而将表达的目的蛋白释放并溶于蛋白缓冲液中。

7)离心：将破碎好的菌液于预冷好4℃的离心机中8000rpm，离心50min，取离心后的沉淀、上清，制样，并收集上清液；

8)纯化及浓缩：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：

(1)柱平衡：先用蒸馏水洗2个柱体积，再用20mm咪唑蛋白缓冲液平衡ni亲和层析柱1个柱体积。

(2)上样：将上清按0.5ml/min流速缓慢经过ni亲和层析柱，再重复一次。

(3)洗脱杂蛋白：采用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，再用50ml含50mm咪唑的蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样。

(4)洗脱目的蛋白：分别用20ml含100mm，200mm，300mm咪唑蛋白缓冲液将目的蛋白洗脱下来，分别取前几滴流穿样品，制样，12％sds-page检测。

(5)浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50mlamicon超滤管(30kda，millipore公司)离心浓缩(4℃、3400r/min)，浓缩至1ml。再加10ml蛋白缓冲液，再浓缩至1ml，重复该过程1次，确保除去蛋白中的咪唑，得到纯化的目的蛋白，备用。

9)蛋白浓度测定。蛋白浓度测定采用piercebcaproteinassaykit(thermofisherscientific)。首先利用蛋白在280nm有吸光值进行蛋白浓度的初步测定，然后根据初测的值将蛋白浓度稀释到0.5-1mg/ml。将bcaproteinassaykit中试剂a与试剂b按50∶1的比例配置好做反应液。取200ul反应液放置在酶标板中，在反应液中加入25μl稀释后的蛋白，用枪吹吸混匀后放置在37℃下，反应30min。将酶标板放入酶标仪中测定562nm吸光值，并按照蛋白标准曲线进行数据处理，即可得到蛋白浓度cpr。蛋白溶液存于-80℃冰箱，备用。

实施例4蛋白的活性检测：

驯鹿的nadph-细胞色素p450还原酶有着较高的催化活性，可以催化氧化型细胞色素c生成还原型细胞色素c，还原型细胞色素c在550nm出有特征吸收峰，通过分光光度计测定550nm吸光度的增加速率，来计算nadph细胞色素还原酶的活性。

1)先将磷酸盐缓冲液在37℃水浴锅中保温，预热30min。

2)空白组：取1ml玻璃比色皿，依次加入蒸馏水50μl，磷酸盐缓冲液900μl，氧化型细胞色素c50μl，10μlnadph溶液，迅速混匀后，于550nm处，每10s测定的吸光值，测定5min，取斜率最大的2min内的吸光值，最小记为a1，最大记为a2。△0＝a2-a1

3)测定组：取1ml玻璃比色皿，依次加入蛋白溶液50μl，磷酸盐缓冲液900μl，氧化型细胞色素c50μl，10μlnadph溶液，迅速混匀后，于550nm处，每10s测定的吸光值，测定5min，取斜率最大的2min内的吸光值，最小记为b1，最大记为b2。△1＝b2-b1。

4)计算公式：

酶活性单位定义：37℃中，每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素c为1个酶活单位。计算公式如下：

nadph-细胞色素p450还原酶活性(nmol/min/mgprot)＝(△1-△0)÷e÷d×v总÷(cpr×v样)÷t＝526×(△1-△0)÷cpr

e：还原型细胞色素c摩尔消光系数，19100l/mol/cm＝0.0191l/μmol/cm；d：比色皿光径，1cm；v总：反应体系总体积，1.01ml＝0.00101l；cpr：蛋白溶液的蛋白浓度，mg/ml。v样：加入反应中上清液的体积50μl＝0.05ml；t：反应时间2min。

5)实施例中用到的溶液：

(1)磷酸盐缓冲液：称取13.9g磷酸氢二钾和2.69g磷酸二氢钾，溶于900ml蒸馏水中，再用蒸馏水定容至1l。

(2)氧化型细胞色素c溶液：1.77g氧化型细胞色素c溶于100ml水中，制备成20mm的母液，工作浓度为1mm。

(3)nadph溶液：7.4gnadph溶于100ml水中，制备成100mm的母液，工作浓度为1mm。

所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应在本发明的保护范围之列。

序列表

<110>嘉兴欣贝莱生物科技有限公司

<120>含驯鹿nadph-细胞色素p450还原酶基因的重组载体构建及表达、分离纯化方法

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