一种包含密码子优化CFP10基因的结核DNA疫苗的制作方法

本发明属于含有抗原或抗体的医药配制品技术领域，尤其涉及一种包含密码子优化cfp10基因的结核dna疫苗。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：结核病是危害严重的感染病；现在较广泛应用的卡介苗的预防结核病效果不理想。dna疫苗是第三代疫苗，有较广阔前景。cfp10是一种潜在的结核疫苗候选分子。但先前利用cfp10构建的结核病dna疫苗，因为其编码dna是适应结核菌特征的，不适合在哺乳动物细胞(小鼠/人)高效表达cfp10蛋白，从而影响dna疫苗效果。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有利用cfp10构建的结核病dna疫苗，因为其编码dna是适应结核菌特征的，其部分密码子具有结核菌偏嗜性，而在哺乳动物细胞(小鼠/人)内相应的氨基酸由其相应的细胞偏嗜性的dna密码子编码，故尽管结核菌编码cfp10的dna密码子可以在哺乳动物细胞(小鼠/人)(包括人体细胞内)表达，但由于其dna密码子是结核菌偏嗜性的，而不是哺乳动物细胞(小鼠/人)偏嗜性的，故其在哺乳动物细胞(小鼠/人)表达效率较低，不适合在哺乳动物细胞(小鼠/人)高效表达cfp10蛋白，导致最终的表达蛋白量偏低，从而影响疫苗的免疫效果。

解决上述技术问题的难度和意义：

如何避免天然cfp10基因的结核菌偏嗜性，使含cfp10基因的结核dna疫苗能在哺乳动物细胞(小鼠/人)内高效表达，从而增强疫苗的免疫效果是研究的核心问题和难点。本发明根据自然界生物的氨基酸密码子存在简并性，即遗传密码编码的20组氨基酸中，除了蛋氨酸和色氨酸只由唯一的密码子编码，其余的氨基酸均存在对应多个密码子编码的现象，将目的抗原cfp10的基因按照表达哺乳动物细胞(小鼠/人)的密码子使用偏好进行优化，使cfp10在哺乳动物细胞(小鼠/人)内得以高效表达，以增强疫苗的免疫效果，从而解决目前结核dna疫苗免疫效果低的问题。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种包含密码子优化cfp10基因的结核dna疫苗。

本发明是这样实现的，一种包含密码子优化cfp10基因的结核dna疫苗，所述包含密码子优化cfp10基因的结核dna疫苗，即为包含密码子优化cfp10基因的真核表达质粒。

所述密码子优化cfp10基因序列为seqidno：1。

dna疫苗的本质，是含有某种蛋白质抗原编码基因的重组真核表达质粒，该重组质粒可直接注射或经基因枪、体内电转染至动物体内，使外源基因(重组质粒中含有的即某种蛋白质抗原编码基因)在动物体内表达，产生相应的抗原激活机体免疫系统，诱导出特异性的体液免疫和细胞免疫应答。

本发明的另一目的在于提供一种所述包含密码子优化cfp10基因的结核dna疫苗的制备方法，所述包含密码子优化cfp10基因的结核dna疫苗的制备方法包括以下步骤：

步骤一，优化cfp10密码子；

根据结核菌cfp10的蛋白序列，及已知的哺乳动物细胞(小鼠/人)的dna密码子偏嗜性优化编码cfp10蛋白的dna密码子，将结核菌偏嗜性的密码子优化为密码子为哺乳动物细胞(小鼠/人)偏嗜性的密码子。将密码子优化后的编码cfp10的dna序列经全基因合成技术进行合成，获得密码子优化的编码cfp10的dna。密码子优化cfp10编码dna序列为：

atggcagaaatgaagaccgacgcagcaacactggcacaggaagccgggaactttgaacggattagcggggacctgaaaacacagattgaccaggtggagagcaccgcaggatccctgcagggacagtggaggggcgccgctggaacagcagcccaggctgcagtggtcagattccaggaagccgctaacaagcagaaacaggagctggatgaaatctctaccaatattcggcaggctggagtccagtattcaagagcagatgaggagcagcagcaggcactgtcaagccagatggggttctaa

步骤二，构建密码子优化cfp10表达质粒。

将全基因合成的密码子优化的cfp10编码dna经基因工程技术装载入真核表达质粒(如pvax1)，构建含有密码子优化的cfp10编码dna的真核表达质粒(如pvax1/cfp10-o)，转化入工程菌，筛选后进行酶切和测序方法验证真核表达质粒构建成功。

步骤三，证明密码子优化cfp10表达质粒可更高效表达cfp10蛋白。

大量提取含有密码子优化的cfp10编码dna的真核表达质粒(如pvax1/cfp10-o)和先期构建的含有天然cfp10编码dna的同种载体的真核表达质粒(如pvax1/cfp10)，分别转染至哺乳动物细胞(小鼠/人)(如hela细胞)，培养后，通过rt-pcr、间接免疫荧光法方法验证构建的含有密码子优化的cfp10编码dna的真核表达质粒可哺乳动物细胞(小鼠/人)(如hela细胞)内有效表达cfp10蛋白，且表达量高于含天然cfp10编码dna的真核表达质粒。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：对cfp10的编码密码子进行哺乳动物细胞(小鼠/人)密码子偏嗜性改造，改变编码cfp10的编码密码子，使其在哺乳动物细胞(小鼠/人)体更高效表达cfp10蛋白，且表达的cfp10蛋白的氨基酸序列不变，从而提升dna疫苗的免疫效果。

附图说明

图1是本发明实施例提供的包含密码子优化cfp10基因的结核dna疫苗的制备方法流程图。

图2是本发明实施例提供的各组免疫后小鼠抗体igg水平示意图。

图3是本发明实施例提供的elisa检测免疫后6w小鼠血清中的ifn-γ浓度示意图。

图4是本发明实施例提供的各实验组和对照组elispotsfc数量比较示意图。

图5是本发明实施例提供的各组小鼠t淋巴细胞增殖指数(pi值)的分析示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供的包含密码子优化cfp10基因的结核dna疫苗转入人体细胞进行表达，并与未优化密码子的天然cfp10真核表达质粒转入细胞比较cfp10表达水平；密码子优化cfp10真核表达质粒(dna疫苗)在人体细胞表达水平优于未优化密码子的天然cfp10真核表达质粒。

本发明实施例提供的包含密码子优化cfp10基因的结核dna疫苗

如图1所示，本发明实施例提供的包含密码子优化cfp10基因的结核dna疫苗的制备方法包括以下步骤：

s101：优化cfp10密码子；根据结核菌cfp10的蛋白序列，及已知的哺乳动物细胞(小鼠/人)的dna密码子偏嗜性优化编码cfp10蛋白的dna密码子，将结核菌偏嗜性的密码子优化为密码子为哺乳动物细胞(小鼠/人)偏嗜性的密码子。将密码子优化后的编码cfp10的dna序列经全基因合成技术进行合成，获得密码子优化的编码cfp10的dna。密码子优化cfp10编码dna序列为seqidno：1：

atggcagaaatgaagaccgacgcagcaacactggcacaggaagccgggaactttgaacggattagcggggacctgaaaacacagattgaccaggtggagagcaccgcaggatccctgcagggacagtggaggggcgccgctggaacagcagcccaggctgcagtggtcagattccaggaagccgctaacaagcagaaacaggagctggatgaaatctctaccaatattcggcaggctggagtccagtattcaagagcagatgaggagcagcagcaggcactgtcaagccagatggggttctaa。

s102：构建密码子优化cfp10真核表达质粒和天然cfp10真核表达质粒。

将全基因合成的密码子优化的cfp10编码dnacfp10-o经基因工程技术装载入真核表达质粒pvax1，构建含有密码子优化的cfp10编码dna的真核表达质粒pvax1/cfp10-o；转化入工程菌，筛选后进行酶切和测序方法验证真核表达质粒构建成功。同时，从结核分枝杆菌h37ra株基因组中，pcr扩增天然密码子cfp10基因，经ecorⅰ和hindⅲ双酶切后，纯化后的酶切产物cfp10基因与经同样酶切处理的真核表达载体pvax1连接，构建包含天然密码子cfp10基因的重组质粒pvax1/cfp10，用酶切及测序的方法鉴定pvax1/cfp10-o和pvax1/cfp10重组真核表达质粒构建成功。

s103：证明密码子优化cfp10表达质粒可更高效表达cfp10蛋白。大量提取含有密码子优化的cfp10编码dna的真核表达质粒pvax1/cfp10-o和含有天然cfp10编码dna的同种载体的真核表达质粒(如pvax1/cfp10，经梭华-sofasttm介导体外分别转染至hela细胞，培养后，通过rt-pcr、间接免疫荧光法方法验证构建的含有密码子优化的cfp10编码dna的真核表达质粒pvax1/cfp10-o可在hela细胞内有效表达cfp10蛋白，且表达量高于含天然cfp10编码dna的真核表达质粒pvax1/cfp10。将pvax1/cfp10-o和pvax1/cfp10重组质粒以肌肉注射辅以体内电穿孔的方式体内瞬时转染小鼠骨骼肌，免疫组织化学法检测证明含有密码子优化的cfp10编码dna的真核表达质粒pvax1/cfp10-o可在小鼠骨骼肌细胞内有效表达cfp10蛋白，且表达量高于含天然cfp10编码dna的真核表达质粒pvax1/cfp10。

s104：证明密码子优化cfp10真核表达质粒(结核dna疫苗)可诱导机体产生更高的免疫应答水平。

下面结合具体分析对本发明做进一步描述。

将28只spf级balb/c小鼠分为4组，即pvax1/cfp10-o组，pvax1/cfp10组，pvax1空质粒组，ns(生理盐水)组，分别以pvax1/cfp10-o、pvax1/cfp10、pvax1质粒和ns经肌肉注射辅以体内电穿孔途径进行免疫，每2w加强免疫一次，共免疫3次。间接elisa法检测初次免疫后0、2、4、6w小鼠血清中cfp10特异性抗体igg的水平；elisa法检测末次免疫后2w(第6w)小鼠血清中ifn-γ的浓度；elispot法检测末次免疫后2w(第6w)小鼠脾淋巴细胞和重组蛋白cfp10共培养后产生ifn-γ的t淋巴细胞数量；流式细胞仪检测cfse标记的末次免疫后2w(第6w)小鼠t淋巴细胞经重组蛋白cfp10刺激后的增殖动力学变化，用flowjo软件分析其增殖指数。结果发现pvax1/cfp10-o和pvax1/cfp10组小鼠血清cfp10特异性igg抗体水平检测显示随免疫次数的增多呈上升趋势，在相同的免疫时间内，pvax1/cfp10-o组高于pvax1/cfp10组。末次免疫后2w(第6w)，两组igg抗体水平达到最高，且pvax1/cfp10-o组小鼠血清cfp10特异性igg抗体水平明显高于pvax1/cfp10组和pvax1组及ns组(p﹤0.05)，pvax1/cfp10组高于pvax1组及ns组(p﹤0.05)，而pvax1组和ns组小鼠血清cfp10特异性igg抗体水平差异无统计学意义(p﹥0.05)；pvax1/cfp10-o组小鼠血清ifn-γ浓度明显高于pvax1/cfp10组和pvax1组及ns组(p﹤0.01)，pvax1/cfp10组小鼠血清ifn-γ浓度高于pvax1组及ns组(p﹤0.01)，而pvax1组和ns组小鼠血清ifn-γ浓度差异无统计学意义(p﹥0.05)；elispot结果显示pvax1/cfp10-o组斑点数明显多于pvax1/cfp10组和pvax1组及ns组(p﹤0.01)，pvax1/cfp10组斑点数多于pvax1组及ns组(p﹤0.01)，而pvax1组及ns组斑点数差异无统计学意义(p﹥0.05)；各组t细胞的增殖指数检测显示pvax1/cfp10-o组(2.89±0.39％)明显高于pvax1/cfp10组(2.06±0.16％)(p﹤0.05)，pvax1/cfp10组明显高于pvax1组和ns组(p﹤0.05)，而pvax1组和ns组之间差异无统计学意义(p﹥0.05)。证明密码子优化cfp10真核表达质粒可诱导机体产生更高的免疫应答水平。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>蚌埠医学院

<120>一种包含密码子优化cfp10基因的结核dna疫苗

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>303

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atggcagaaatgaagaccgacgcagcaacactggcacaggaagccgggaactttgaacgg60

attagcggggacctgaaaacacagattgaccaggtggagagcaccgcaggatccctgcag120

ggacagtggaggggcgccgctggaacagcagcccaggctgcagtggtcagattccaggaa180

gccgctaacaagcagaaacaggagctggatgaaatctctaccaatattcggcaggctgga240

gtccagtattcaagagcagatgaggagcagcagcaggcactgtcaagccagatggggttc300

taa303