本发明属于生物学和基因工程
技术领域：
：，尤其涉及一种喜盐芽胞杆菌钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlt及鉴定。
背景技术：
：环境中如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产。其中，盐碱被认为是最具危害性的非生物类胁迫因素之一。高盐碱环境不仅对细菌细胞本身产生毒害作用，而且高浓度的渗透压和离子压力也严重影响了细菌的正常生理功能。同时，在农业生产上具有重要经济价值，并可作为微生物肥料的细菌耐盐碱能力却十分有限，诸如根瘤菌、固氮菌、磷细菌、钾细菌和根际促生菌等，这严重制约着其在农业生产中的应用前景。解决其最为有效的办法之一就是从耐盐碱细菌中克隆高效的耐盐碱基因，再将其导入可用作为微生物肥料的细菌，以构建高效耐盐碱基因的工程菌株。所以，细菌耐盐碱基因的克隆与功能鉴定及其耐盐碱分子遗传机制的研究在过去的几十年中一直是一个重要的研究课题。在原核生物中，na+/h+逆向转运蛋白是普遍存在的次级转运蛋白，它催化胞内碱性阳离子如na+，li+或k+的流出，以置换外部质子，这在对减少有毒碱性阳离子的胞质浓度和在碱性条件下维持细胞内ph稳态都起着至关重要的作用(padane，1994；itom，1999；quinnmj，2012)。由于na+/h+逆向转运蛋白同时还具有li+/h+逆向活性，因此也称为na+(li+)/h+逆向转运蛋白。其中有些报道有时候会显示出k+/h+逆向转运活性(itom，1999；quinnmj，2012)。根据基因的功能，人们将细菌中的耐盐碱基因主要分为三大类：(1)编码渗调蛋白的基因：此类基因编码的渗调蛋白主要负责细菌在盐碱压力下初期对渗透压变化的响应，起到的主要是缓冲作用。(2)编码全细胞调控因子的基因：这类基因则是从全细胞水平启动细胞整体调控应对机制。(3)编码阳离子转运蛋白的基因：其功能主要是解除na+、li+、k+等阳离子在细胞内积累所造成的毒害作用以及维持碱性ph值条件下的细胞内ph值平衡的最终执行者。因此，阳离子转运蛋白在细菌耐盐碱方面起到决定性作用。在细菌中发现的能够输出na+的主要基因包括：负责向细胞内输入h+同时向细胞外输出na+或li+的钠(锂)/氢逆向转运蛋白基因、通过脱甲基偶联输出na+的甲基四氢叶酸甲烷喋呤辅酶m甲基转移酶基因、通过偶联atp产生输入na+的f-atp酶或p-atp酶基因或通过水解atp输出na+的v-atp酶基因、通过还原泛醌输出na+的nadh泛醌氧化还原酶基因以及在控制脱掉羧酸的过程中偶联na+输出的脱羧酶基因。在各类阳离子输出蛋白中，钠(锂)/氢逆向转运蛋白在输出na+、li+等阳离子以及维持细胞内ph值平衡起到的作用最为显著。与一般非嗜盐菌相比，中度嗜盐菌中耐盐碱基因种类更多，其耐盐碱分子遗传机制也更加复杂。因此，从这类菌中获得新型的耐盐碱基因以及高效耐盐碱的关键基因的几率更大，不仅可以增进人们对细菌耐盐分子遗传机制的了解，而且所克隆的关键耐盐碱基因还可以用于构建高效耐盐碱的基因工程菌株。此外，细菌与植物的耐盐碱分子遗传机制具有很大的相似性，它们在高盐碱条件下，均在细胞内积累相似的亲合性物质，并且采用相似的阳离子转运蛋白等转运钠离子等阳离子。因此，对中度嗜盐菌中耐盐碱基因的克隆和功能研究对理解植物的耐盐碱分子遗传机制具有重要的启示作用，并且关键耐盐碱基因还可以用于构建耐盐碱的转基因植物或有效的耐盐碱微生物肥料。hct家族(2-hydroxycarboxylatetransporterfamily,hctfamily)转运蛋白是一类以跨膜的h+梯度或na+梯度作为驱动力负责转运均具有“ho-cr2-cooh”结构式的2-羟基羧酸的次级转运蛋白。目前，该家族中功能已被鉴定的成员共有7个，它们转运的底物是柠檬酸或苹果酸，或二者均是(sobczaki，2005)。根据转运底物的种类以及方向，已鉴定的hct家族蛋白可分为四类：(1)依赖na+的同向转运蛋白(symporter)cits(vanderrestme，1992)、(2)依赖h+的同向转运蛋白cimh(krombp，2001)和maep(kawais，1997)、(3)既不依赖na+也不依赖h+的逆向转运蛋白(antiporter)mlep(poolmanb，1991)、citp(marty-teyssetc，1995)和citw(cn，2002)以及(4)依赖na+的苹果酸/乳酸逆向转运蛋白mlen(yiwei，2000)。肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumonia)中，cits被鉴定是一个依赖na+的柠檬酸转运蛋白，转运机制是向细胞内同向输入na+和柠檬酸，因而该蛋白也被称为柠檬酸/na+同向转运蛋白(vanderrestme，1992)。在枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)中，cimh被鉴定是一个依赖h+的柠檬酸/苹果酸转运蛋白，转运机制是向内输入柠檬酸或苹果酸的同时偶联输入h+(krombp，2001)。在牛链球菌(streptococcusbovis)中，maep是一个依赖h+的苹果酸转运蛋白，转运机制是向内同向输入h+和苹果酸，所以该蛋白也被称为苹果酸/h+同向转运蛋白(malate/h+symporter)(kawais，1997)。在乳酸乳球菌(lactococcuslactis)中，mlep被鉴定是一个苹果酸/乳酸逆向转运蛋白(poolmanb，1991)。在肠膜明串珠菌(leuconostocmeseneroides)中，citp被鉴定是一个柠檬酸/乳酸逆向转运蛋白(marty-teyssetc，1995)。在肺炎克雷伯菌(k.pneumonia)中，citw被鉴定是一个柠檬酸/乙酸逆向转运蛋白(cn，2002)。在枯草芽孢杆菌(b.subtilis)中，mlen被鉴定是一个依赖na+的苹果酸/乳酸逆向转运蛋白，该蛋白同时具有苹果酸/乳酸逆向转运蛋白和钠(锂)/氢逆向转运蛋白的功能，转运机制是在向细胞内输入苹果酸同时向细胞外输出乳酸钠，即以一种“苹果酸-2-2h+/na+-乳酸-1”的形式进行物质转运(yiwei，2000)。以上hct家族蛋白中，仅有cits和mlen具有转运na+的功能。然而，前者向胞内同向输入na+，而后者以偶联苹果酸/乳酸逆向转运的方式向外输出na+，并且与枯草芽孢杆菌(b.subtilis)的钠(锂)/氢逆向转运蛋白nhac表现出较高的同源性，但仅能恢复大肠杆菌突变株(e.coli)ep432(nhaa-,nhab-)的耐盐能力至0.4mnacl(vanderrestme，1992；yiwei，2000)。sdmlt是一个具有高效耐盐碱能力的新型hct家族蛋白，然而其具体功能仍然未知。因此，sdmlt的功能鉴定以及对其负责转运2-羟基羧酸和na+、li+等阳离子的功能分析，对进一步揭示hct家族蛋白转运2-羟基羧酸的分子机制以及钠(锂)/氢逆向转运蛋白耐盐碱的分子机制具有重要研究意义，而且有助于指导我们对sdmlt蛋白进行分子改造，以提升其基因sdmlt用作构建高效耐盐碱的基因工程菌株的潜力。综上所述，现有技术存在的问题是：对于sdmlt其具体功能仍然未知；对sdmlt的功能鉴定以及对其负责转运2-羟基羧酸和na+、li+等阳离子的功能分析，对进一步揭示hct家族蛋白转运2-羟基羧酸的分子机制以及钠(锂)/氢逆向转运蛋白耐盐碱的分子机制缺乏指导意义，而且现有技术对基因sdmlt用作构建高效耐盐碱的基因工程菌株没有指导方向。技术实现要素：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种喜盐芽胞杆菌钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlt及鉴定。本发明的目的是从肇东盐单胞菌中获得新型或者高效耐盐碱的关键基因，用以深入分析细菌耐盐碱的分子机制，以及构建转基因耐盐碱作物和微生物，进而充分开发和利用盐碱地。因此，通过基因文库和功能互补相结合的方法，我们在基因文库构建中常以载体所携带的抗性作为筛选条件之外，利用盐敏感缺陷株e.coliknabc的生理特性，还在筛选培养基中加入0.2mnacl作为第二条件，成功地从安达喜盐芽胞杆菌中克隆到，一种钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlt，所述喜盐芽胞杆菌钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlt是一个全长1327bp的完整开放阅读框orf，orf的核苷酸序列如seqidno.1。本发明的另一目的在于提供一种利用上述喜盐芽胞杆菌逆向转运蛋白基因sdmlt编码的蛋白sdmlt，核苷酸序列如seqidno.2。进一步，所述蛋白sdmlt由442个氨基酸残基组成，并且具有na+(li+、k+)/h+逆向转运蛋白活性，所述活性具有ph依赖性。所述的安达喜盐芽孢杆菌sdmlt基因编码的蛋白是一种新型的依赖na+的苹果酸/乳酸逆向转运蛋白，即同时具有苹果酸/乳酸逆向转运蛋白和钠/氢逆向转运蛋白的双重功能，属于依赖na+的新型hct家族转运蛋白。本发明的另一目的在于提供一种如上述喜盐芽胞杆菌钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlt的鉴定方法，包括以下步骤：(1)通过基因文库和功能互补相结合的方法，以0.2mnacl的氨苄抗性固体培养基作为筛选工具，首先得到含有耐盐碱基因的片段；(2)利用生物信息学软件对基因片段进行分析，确定耐盐碱的基因，通过pcr扩增得到sdmlt基因，该基因的核苷酸序列如seqidno.1所示；构建含有sdmlt基因的原核表达载体；(3)通过基因功能互补的方法，首先对该基因的生理功能进行鉴定；再通过荧光猝灭技术手段(以吖啶橙(ao)作为荧光探针，检测荧光猝灭及恢复情况。即向盛2.5ml缓冲液b的石英杯中加入2μm荧光探针吖啶橙(ao)和40μg的反转膜，抽吸混匀；再加入终浓度为5mm的tris-d-乳酸并混匀反应体液，这里乳酸作为底物，通过呼吸链产生跨膜ph梯度，所以此时荧光强度已开始下降。利用荧光分光光度计来监控跨膜ph梯度(即δph)的变化。荧光监控参数设置：激发光(ex)波长492nm，发射光(em)波长526nm；当荧光强度下降至稳定状态时，向反应体系加入终浓度为5mm的nacl、kcl、licl，以破坏δph，此时荧光强度开始升高；根据荧光强度的恢复程度判断并表示na+(li+，k+)/h+逆向转运蛋白活性的有无及大小)，对sdmlt基因编码的蛋白功能进行鉴定。进一步，所述构建含有sdmlt基因的原核表达载体为构建pet19-sdmlt原核表达载体，构建方法包括：根据sdmlt基因序列，首先利用primer5软件设计特性引物sdmlt-f、sdmlt-r特异引物，并在基因的5’和3’端分别引入ndei、bamhi两个酶切位点，然后进行sdmlt的pcr扩增；将pcr扩增产物末端加“a”后连入peasy-t3载体，然后化转到trans1-t1感受态细胞中，进行蓝白斑筛选出亚克隆；再用ndei、bamhi两种内切酶处理连有sdmlt的peasy-t3-sdmlt，并同时对pet19b-sdmlt原核表达载体做相同处理，对处理后的pet19b-sdmlt和sdmlt片段进行回收并连接，通过热激法将构建好的表达载体pet19-sdmlt导入异源表达宿主e.coliknabc中。其具体方法如下：取e.coliknabc感受态细胞，向其中加入适量的pet19-sdmlt重组质粒，轻轻混匀，冰浴30min；然后将盛有上述混合物的离心管至于42℃水浴中热激90s；之后快速移至冰浴，放置10min；再将入37℃预热的新鲜培养基进行复苏45min；最后，取适当体积均匀涂布在含有氨苄抗性的lbk培养基上。本发明的另一目的在于提供一种利用上述蛋白sdmlt构建的用于验证蛋白sdmlt具有na+(li+、k+)/h+逆向转运蛋白活性的大肠杆菌k12dcta基因敲除突变株。本发明的另一目的在于提供一种一种如上述大肠杆菌k12dcta基因敲除突变株的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌k12dcta基因敲除突变株的构建方法包括以下步骤：使用野生型大肠杆菌e.colik12为实验菌株(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，以pkd46作为同源重组的协助质粒，pkd3((购自优宝生物))为pcr扩增提供氯霉素抗性基因的模板，为重组转化体提供筛选标记；设计敲除dcta基因的同源重组引物dcta-p1，dcta-p2，5’端为50nt的dcta基因两侧的同源臂，3’端为20nt的用于扩增氯霉素抗性基因的引物，以pkd3质粒为模板，扩增氯霉素抗性基因cat，产物片段长1115bp，胶回收后用于电转化；在dcta基因上下游200-300bp设计验证引物dcta验证f，dcta验证r，用于pcr扩增敲除后基因组，并用于测序验证；dcta基因敲除结果验证：使用dcta验证引物f、r直接菌液pcr经氯霉素抗性筛选得到的突变株，并用未敲除的原始菌株e.colik12作对照，并将pcr产物直接用于测序：dcta基因敲除后，大肠杆菌苹果酸摄取能力丧失：大肠杆菌k12中dcta基因敲除后，失去苹果酸摄取能力，在作为苹果酸作唯一碳源的m9培养基中的无法生长。本发明的另一目的在于提供一种利用上述喜盐芽胞杆菌逆向转运蛋白基因sdmlt制备的对开发微生物肥料。本发明的另一目的在于提供一种利用上述喜盐芽胞杆菌逆向转运蛋白基因sdmlt构建的提高耐盐碱性的转基因植物。本发明的另一目的在于提供一种利用上述蛋白sdmlt构建的钠/氢逆向转运蛋白。本发明的优点及积极效果为：本发明的sdmlt是一个具有高效耐盐碱能力的新型hct家族蛋白，本发明的sdmlt的功能鉴定以及对其负责转运2-羟基羧酸和na+、li+等阳离子的功能分析，对进一步揭示hct家族蛋白转运2-羟基羧酸的分子机制以及钠(锂)/氢逆向转运蛋白耐盐碱的分子机制具有重要研究意义，而且有助于指导对sdmlt蛋白进行分子改造，提升了其基因sdmlt用作构建高效耐盐碱的基因工程菌株的潜力。本发明公开安达喜盐芽胞杆菌新型钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlt及鉴定方法，从此菌中获取并具有序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列，并能够获得含有该基因的重组载体和宿主细胞，本发明所提出的sdmlt基因对盐碱地土壤改良具有重要意义，可用于构建高的效耐盐碱工程菌、开发微生物肥料和提高植物耐盐碱性的转基因领域的研究。本发明从安达喜盐芽孢杆菌中获取的sdmlt基因可使盐敏感突变株knabc的耐盐碱能力有了显著的提高。其编码的蛋白sdmlt为膜蛋白，多表达于细菌的内膜上，并且该蛋白具有na+(li+、k+)/h+逆向转运蛋白活性。本发明所提出的sdmlt基因丰富了微生物耐盐碱基因资源，可用于构建高的效耐盐碱工程菌或抗逆作物等，特别是耐盐和耐碱胁迫的植株具有重大价值。附图说明图1是本发明实施例提供的在线生物软件分析sdmlt蛋白的跨膜区及疏水性图；图中：a.蛋白的跨膜区预测(黑色方块表示跨膜区)；b.蛋白的疏水性分析。图2是本发明实施例提供的sdmlt与同系物的氨基酸序列的比对；ht_pcits,putativecitsfromhalobacillustrueperi(accessionno.cdq28507)；hs_pcits,putativecitsfromhalobacillussp.bab-2008(accessionno.zp_20420905)；bsp_pcits,putativecitsfrombacillussp.sg-1(accessionno.zp_01858294)；bh_pcits,putativecitsfrombacillushalodurans(accessionno.np_241266)；bp_pcits,putativecitsfrombacilluspseudofirmus(accessionno.yp_003428555)；oi_pcits,putativecitsfromoceanobacillusiheyensis(accessionno.np_694139)；cs_pcits,putativecitsfromchromohalobactersalexigens(accessionno.yp_572761)；he_pcits,putativecitsfromhalomonaselongata(accessionno.yp_003898786)；ps_pcits,putativecitsfrompseudomonasstutzeri(accessionno.yp_005937072)；ll_mlep,mlepfromlactococcuslactis(accessionno.bal50852)；kp_cits,citsfromklebsiellapneumoniae(accessionno.p31602)；lm_citp,citpfromleuconostocmesenteroides(accessionno.aaa60396)；sb_maep,maepfromstreptococcusbovis(accessionno.aab18291)；bs_cimh,cimhfrombacillussubtilis(accessionno.baa11726)；kp_citw,citwfromklebsiellapneumoniae(accessionno.aal60462)；bs_mlen,mlenfrombacillussubtilis(accessionno.baa12644)；图3是本发明实施例提供的pet19-sdmlt原核表达载体构建流程图；图4是本发明实施例提供的sdmlt的pcr产物电泳图；图中：m:dl2000plusⅱ。图5是本发明实施例提供的重组质粒peasyt3-sdmlt构建图；图中：(a)、重组质粒peasyt3-sdmlt酶切电泳图谱，1-7:peasyt3-sdmlt的酶切产物；(b)、sdmlt的pcr产物电泳图谱及重组质粒peasyt3-sdmlt的电泳图谱，1-7:pcrofsdmlt，8-14:重组质粒peasyt3-sdmlt，m:dl2000plusⅱ；图6是重组质粒pet19-sdmlt构建图；图中(a).重组质粒pet19-sdmlt电泳图谱，m:1kbdnaladder，1-10：pet19-sdmlt重组质粒；(b).sdmlt的pcr产物电泳图谱，m：dl2000plusⅱ，1-10：pet19-sdmlt的pcr样品；(c).pet19-sdmlt重组质粒双酶切电泳图谱，m:1kbdnaladder，1-3：pet19-sdmlt重组质粒的酶切产物；图7是本发明实施例提供的大肠杆菌(e.coli)knabc的耐盐碱生长测试图；图中：a.nacl，b.licl，c.ph；图8是大肠杆菌(e.coli)dh5α的耐盐碱生长测试图；图中：a.nacl，b.licl，c.ph；图9是本发明实施例提供的sdmlt蛋白活性的鉴定图；图10是本发明实施例提供的不同ph值条件sdmlt蛋白活性的ph轮廓图；图中：a.na+/h+逆向转运活性，b.li+/h+逆向转运活性，c.k+/h+逆向转运活性；图11是安达喜盐芽胞杆菌(halobacillusandanensis)sdmlt与枯草芽胞杆菌(bacillussubtilissubsp.subtilis)str.168中同源物的序列比对图；图12是本发明实施例提供的大肠杆菌(e.coli)k12的dcta基因敲除策略流程；图13是本发明实施例提供的大肠杆菌k12δdcta敲除的测序验证示意图；图中：阴影部分为含有氯霉素抗性基因cat的插入片段，下划线部分为敲除用引物50nt同源臂；图14是本发明实施例提供的大肠杆菌k12δdcta在含有0.2％l-苹果酸的m9培养基中的生长情况图；图15是本发明实施例提供的sdmlt基因与大肠杆菌k12δdcta突变株的24h内的互补实验图；图16是本发明实施例提供的sdmlt基因与大肠杆菌k12δdcta突变株的72h内的互补实验图；图17是本发明实施例提供的大肠杆菌k12δdcta在含有0.2％l-苹果酸但去除na+的m9培养基中的24h生长情图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作详细描述。本发明以安达喜盐芽孢杆菌作为分离新型有效的耐盐碱基因的对象供体，借助大肠杆菌(escherichiacoli)盐敏感突变株knabc(δnhaa，δnhab，δchaa)的生理特征，将基因文库筛选和功能互补相结合的技术手段，成功获得耐盐碱基因sdmlt，利用各种生物软件对该段核苷酸序列进行生物信息学分析，发现该基因序列全长1327bp，其编码的sdmlt蛋白由442个氨基酸残基组成，预测其分子量为46650daiton，等电点pi为9.23，这与hct家族转运蛋白氨基酸残基数在421-456之间的事实相符，具有11个跨膜区，且与已鉴定的hct家族转运蛋白进行同源性比较表明该蛋白是属于2-羟基羧酸转运蛋白家族(2-hydroxycarboxylatetransporterfamily，hctfamily)，而且其逆向转运苹果酸/乳酸的功能需要依赖na+，所以，本发明将其基因命名为sdmlt(sodium-dependentmalate/lactatetransporter)，其编码的蛋白命名为sdmlt。功能互补实验显示sdmlt基因能够恢复大肠杆菌(e.coli)knabc对0.4mnacl、5mmlicl以及碱性ph的抗性，暗示基因sdmlt具有耐盐碱能力并可能具有钠/氢逆向转运蛋白活性；而且，基因sdmlt能够使大肠杆菌(e.coli)dh5α的nacl的抗性从0.8m提高到1.2m，这暗示该基因可以用于构建高效耐盐碱的基因工程菌株。除此之外，本发明利用荧光猝灭技术，发现sdmlt具有钠/氢逆向转运蛋白活性。同源比对和系统进化发育学分析表明，sdmlt是一种新型有效的耐盐碱基因。为了进一步验证是否sdmlt为一个cits型na+/苹果酸同向转运蛋白，本发明首先敲出大肠杆菌(e.coli)k12中仅有的一个四碳2-羟基羧酸转运蛋白，成功构建了大肠杆菌k12dcta基因敲除突变株，使其失去苹果酸摄取能力，在以苹果酸作唯一碳源的m9培养基中的无法生长。本发明将空载体puc18、pet19作为负对照，puc-sdmlt、pet-sdmlt以及puc-dp11(sdmlt基因插入puc18的原始克隆)均转化获得大肠杆菌(e.coli)k12δdcta敲除突变株感受态细胞。结果表明：24h内，δdcta/puc-sdmlt在含有0.2％l-苹果酸的m9基本培养基的生长，与大肠杆菌(e.coli)k12的生长情况类似，相比之下，大肠杆菌(e.coli)k12δdcta敲除突变株以及δdcta/puc18均无法生长。为了进一步证实sdmlt一个na+/苹果酸同向转运蛋白，即苹果酸的摄取是否依赖于na+，本发明在0.2％l-苹果酸的m9基本培养基中使用kh2po4替换掉培养基中由于nah2po4，以去除掉培养基中含有的na+。结果表明：只有大肠杆菌(e.coli)k12能够生长，而e.colik12δdcta、δdcta/puc-sdmlt、δdcta/pet-sdmlt、δdcta/puc18、δdcta/pet-sdmlt在24h内均无法生长，以上结果表明，sdmlt一个na+/苹果酸同向转运蛋白。因此，在上述分析的基础上，本发明实施例提出了安达喜盐芽孢杆菌新型钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlt的克隆鉴定及用途。其中，所述的sdmlt基因长1327bp，是一个完整开放阅读框(orf)，orf的核苷酸序列如seqidno.1所示。更进一步的，本发明还提出了sdmlt基因的编码蛋白在构建高效的耐盐碱工程菌、开发微生物肥料和提高植物耐盐碱性的转基因领域的用途。其中，所述的sdmlt为sdmlt基因在异源原核宿主细胞中表达的蛋白，核苷酸序列如seqidno.2。再进一步的，本发明实施例还提出了一种耐盐碱基因的鉴定方法，包括以下步骤：(1)通过基因文库和功能互补相结合的方法，以0.2mnacl的氨苄抗性固体培养基作为筛选工具，首先得到含有耐盐碱基因的片段；(2)利用生物信息学软件对基因片段进行分析，确定可能的耐盐碱的基因，通过pcr扩增得到sdmlt基因，该基因的核苷酸序列如seqidno.1所示；构建含有sdmlt基因的原核表达载体；(3)通过基因功能互补的方法，首先对该基因的生理功能进行鉴定；再通过荧光猝灭技术手段，对sdmlt基因编码的蛋白功能进行鉴定。同时，本发明实施例还提出了一种构建e.colik12δdcta敲除突变株的方法，包括以下步骤：(1)使用野生型大肠杆菌e.colik12为实验菌株，以pkd46(orir101，repa101ts，parab-gam-bet-exo，amp)作为同源重组的协助质粒，pkd3(orirγ，cat，bla)为pcr扩增提供氯霉素抗性基因的模板，为重组转化体提供筛选标记。(2)设计敲除dcta基因的同源重组引物(dcta-p1，dcta-p2)，5’端为50nt的dcta基因两侧的同源臂，3’端为20nt的用于扩增氯霉素抗性基因的引物，以pkd3质粒为模板，扩增氯霉素抗性基因cat，产物片段长1115bp，胶回收后用于电转化。在dcta基因上下游200-300bp设计验证引物(dcta验证f，dcta验证r)，用于pcr扩增敲除后基因组，并用于测序验证。(3)dcta基因敲除结果验证使用dcta验证引物f、r直接菌液pcr经氯霉素抗性筛选得到的突变株，并用未敲除的原始菌株e.colik12作对照，并将pcr产物直接用于测序。(5)dcta基因敲除后，大肠杆菌苹果酸摄取能力丧失大肠杆菌k12中dcta基因敲除后，失去苹果酸摄取能力，在作为苹果酸作唯一碳源的m9培养基中的无法生长。实施例1.在线生物软件分析sdmlt蛋白的跨膜区及疏水性，如图1所示；本发明利用在线预测网站http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm-2.0/和http://web.expasy.org/protscale/对sdmlt基因编码的蛋白序列进行生物信息学分析，发现该基因编码的蛋白sdmlt具有11个跨膜区(如表1所示)，且蛋白呈现出高疏水性。表1sdmlt蛋白的推测的跨膜区图2是本发明实施例提供的sdmlt与同系物的氨基酸序列的比对；ht_pcits,putativecitsfromhalobacillustrueperi(accessionno.cdq28507)；hs_pcits,putativecitsfromhalobacillussp.bab-2008(accessionno.zp_20420905)；bsp_pcits,putativecitsfrombacillussp.sg-1(accessionno.zp_01858294)；bh_pcits,putativecitsfrombacillushalodurans(accessionno.np_241266)；bp_pcits,putativecitsfrombacilluspseudofirmus(accessionno.yp_003428555)；oi_pcits,putativecitsfromoceanobacillusiheyensis(accessionno.np_694139)；cs_pcits,putativecitsfromchromohalobactersalexigens(accessionno.yp_572761)；he_pcits,putativecitsfromhalomonaselongata(accessionno.yp_003898786)；ps_pcits,putativecitsfrompseudomonasstutzeri(accessionno.yp_005937072)；ll_mlep,mlepfromlactococcuslactis(accessionno.bal50852)；kp_cits,citsfromklebsiellapneumoniae(accessionno.p31602)；lm_citp,citpfromleuconostocmesenteroides(accessionno.aaa60396)；sb_maep,maepfromstreptococcusbovis(accessionno.aab18291)；bs_cimh,cimhfrombacillussubtilis(accessionno.baa11726)；kp_citw,citwfromklebsiellapneumoniae(accessionno.aal60462)；bs_mlen,mlenfrombacillussubtilis(accessionno.baa12644)。实施例2pet19-sdmlt原核表达载体的构建流程；如图3所示；根据sdmlt基因序列，首先利用primer5软件设计seqidno.3：sdmlt-f；seqidno.4：sdmlt-r特异引物(如表2所示)，并在基因的5’和3’端分别引入ndei、bamhi两个酶切位点，然后进行sdmlt基因的扩增(如表3所示)，预期扩增中间序列片段长度约为1327bp。表2hz_sdmlt基因表达载体构建引物序列表3pcr扩增反应将上述pcr产物末端加“a”后连入peasy-t3载体，然后化转到trans1-t1感受态细胞中，进行蓝白斑筛选出亚克隆。再用ndei、bamhi两种内切酶处理连有sdmlt基因的peasy-t3-sdmlt，并同时对表达载体pet19b做相同处理，对处理后的pet19b和sdmlt基因片段进行回收并连接，通过化转的发法将构建好的表达载体pet19-sdmlt导入异源表达宿主e.coliknabc中。图4是本发明实施例提供的sdmlt的pcr产物电泳图；图中：m:dl2000plusⅱ。图5是本发明实施例提供的重组质粒peasyt3-sdmlt构建图；图中：(a)、重组质粒peasyt3-sdmlt酶切电泳图谱，1-7:peasyt3-sdmlt的酶切产物；(b)、sdmlt的pcr产物电泳图谱及重组质粒peasyt3-sdmlt的电泳图谱，1-7:pcrofsdmlt，8-14:重组质粒peasyt3-sdmlt，m:dl2000plusⅱ；图6是重组质粒pet19-sdmlt构建图；图中(a).重组质粒pet19-sdmlt电泳图谱，m:1kbdnaladder，1-10：pet19-sdmlt重组质粒；(b).sdmlt的pcr产物电泳图谱，m：dl2000plusⅱ，1-10：pet19-sdmlt的pcr样品；(c).pet19-sdmlt重组质粒双酶切电泳图谱，m:1kbdnaladder，1-3：pet19-sdmlt重组质粒的酶切产物。实施例3sdmlt基因生理功能的鉴定：为了鉴定sdmlt基因的生理功能，本发明以knabc/pet19、dh5α/pet19为负对照，将亚克隆knabc/pet19-sdmlt和dh5α/pet19-sdmlt的菌液按1％接种量转接到含有不同盐浓度(图7&8)的新鲜lbk培养基中培养24h。一、knabc/pet19-sdmlt的耐盐碱测试sdmlt在大肠杆菌(e.coli)knabc的耐盐碱测试表明，基因sdmlt能够提供大肠杆菌(e.coli)knabc对0.4mnacl、5mmlicl以及碱性ph的抗性(图7)，暗示基因sdmlt具有耐盐碱能力并可能具有na+/h+逆向转运蛋白活性。二、dh5α/pet19-sdmlt的耐盐碱测试：sdmlt在野生型大肠杆菌(e.coli)dh5α的耐盐碱测试表明，基因sdmlt能够使大肠杆菌(e.coli)dh5α的nacl的抗性从0.8m提高到1.2m，而且提高了大肠杆菌(e.coli)dh5α对0.4mlicl以及碱性ph的抗性(图8)。这暗示该基因可以用于构建高效耐盐碱的基因工程菌株。图8是大肠杆菌(e.coli)dh5α的耐盐碱生长测试图；图中：a.nacl，b.licl，c.ph。实施例4hz_sdmlt基因表达蛋白的生物信息学分析一、sdmlt蛋白理化性质分析借助dnaman6.0对蛋白sdmlt的氨基酸残基组成分析显示，sdmlt由442个氨基酸残基组成，预测的分子量为46650daiton，等电点pi为9.23，这与hct家族转运蛋白氨基酸残基数在421-456之间的事实相符。高丰度的氨基酸残基依次为leu(65/442)、gly(54/442)、ala(45/442)、val(31/442)、met(25/442)、ser(24/442)、phe(23/442)和thr(23/442),其中最高丰度的氨基酸为leu(65/442)；低丰度的氨基酸依次为gln(9/442)、arg(5/442)、trp(4/442)、his(2/442)和cys(1/442),其中丰度最低的氨基酸为cys(1/442)。从氨基酸的组成预测sdmlt可能是低极性的跨膜蛋白。二、sdmlt与同系物的同源性比对我们克隆得到重组质粒puc-l能使恢复大肠杆菌(escherichiacoli)na+/h+逆向转运蛋白基因缺陷株knabc(δnhaa,δnhab,δchaa)在0.2mnacl的lbk培养基上生长。序列分析显示，puc-l重组质粒包含的外源dna长2698bp(图1-图3)，其中，orf2与多个推测的2-羟基羧酸转运蛋白家族(2-hydroxycarboxylatetransporterfamily,hct)转运蛋白表现出58.7％-74.1％的同源性，其中与ht_pcits(序列号cdq28507)的同源性最高，为90.0％(图2)。orf2与已鉴定的hct家族蛋白有12.2％-38.0％的同源性(图2)，说明sdmlt应该属于hct家族蛋白。本发明依据其同源性比对将orf2暂定为sdmlt(sodium-dependentmalate/lactatetransporter)。三、sdmlt与枯草芽胞杆菌(bacillussubtilissubsp.subtilis)str.168中同源物的序列比对本发明认为sdmlt具有独立行驶na+(li+,k+)/h+逆向转运蛋白活性，这样sdmlt很有可能采用后者输出na+。因此，需要进一步鉴定是否具有2-羟基羧酸转运蛋白的功能。由于在枯草芽胞杆菌(b.subtilissubsp.subtilis)str.168中存在3个sdmlt的同源物，且均已完成功能鉴定，我们采用同源比对的方式，可以快速预测sdmlt最可能的2-羟基羧酸转运蛋白的功能。如图11所示，sdmlt与maen(鉴定前被称为yufr，cits型na+/苹果酸同向转运蛋白)同源性最高，为37.3％；与cimh[h+/苹果酸(柠檬酸)同向转运蛋白]同源性其次，为33.9％；而与mlen(鉴定前被称为yqki，苹果酸-2h+/na+-乳酸逆向转运蛋白)同源性非常低，仅为12.0％。从同源性比对的结果可以看出，sdmlt的2-羟基羧酸转运蛋白功能应该最可能为一个cits型na+/苹果酸同向转运蛋白，而不是一个苹果酸-2h+/na+-乳酸逆向转运蛋白。这一初步的结果印证了本发明的猜想，即sdmlt具有独立行驶na+(li+,k+)/h+逆向转运蛋白活性。实施例5sdmlt蛋白功能的鉴定一、sdmlt蛋白活性的鉴定本发明将含有pet-sdmlt和pet19的knabc细胞，用法式细胞破碎机制备成反转膜，以吖啶橙作为荧光指示剂，检测其na+(li+，k+)/h+逆向转运蛋白活性(图9)。结果发现：在荧光猝灭的最低平衡点加入单一的单价阳离子溶液，反转膜knabc/pet-sdmlt的荧光值升高(图9-a、b、c左侧)，而负对照knabc/pet19b在加入单价阳离子溶液后荧光值没有变化(图9-a、b、c右侧)。所以，本发明认为sdmlt是具有转运na+(li+、k+)/h+逆向转运蛋白活性的。图9是本发明实施例提供的sdmlt蛋白活性的鉴定图。二、sdmlt蛋白活性的ph轮廓尽管knabc/pet19-sdmlt具有na+(li+,k+)/h+逆向转运蛋白活性，但是我们发现在ph6.0-8.5的范围内，na+(li+,k+)/h+逆向转运蛋白活性均很低。以往文献报道，一些外源na+/h+逆向转运蛋白的同源基因在大肠杆菌(e.coli)knabc中的活性的确很低，这可能与该菌株的所有na+(li+,k+)/h+逆向转运蛋白均被突变从而导致其同源基因无法正确表达。替换的方法是，采用大肠杆菌(e.coli)ep432(δnhaa,δnhab)中测定阳离子/氢离子逆向转运蛋白活性。结果发现，sdmlt基因在大肠杆菌(e.coli)ep432中的确表现出比在大肠杆菌(e.coli)knabc中更好的na+/h+逆向转运蛋白活性，且活性随ph变化而变化，在ph8.5表现出最高活性(图10-a)。这进一步确证了sdmlt具有na+/h+逆向转运蛋白活性。然而，类似的实验用于测试sdmlt的li+/h+逆向转运蛋白活性时，发现li+/h+逆向转运蛋白活性随ph变化而变化的趋势一致，且在ph8.5表现出最高活性，但在大肠杆菌(e.coli)ep432中表现出的li+/h+逆向转运蛋白活性却比在大肠杆菌(e.coli)knabc中的低(图10-b)。但与负对照相比，无论是knabc/pet19-sdmlt还是ep432/pet19-sdmlt均表现出更高的li+/h+逆向转运蛋白活性，这说明sdmlt具有li+/h+逆向转运蛋白活性。然而，类似的实验用于测试sdmlt的k+/h+逆向转运蛋白活性时，我们发现，k+/h+逆向转运蛋白活性随ph变化而变化的趋势一致，且在ph8.5表现出最高活性，但在ph8.0-9.0时，大肠杆菌(e.coli)ep432中表现出的k+/h+逆向转运蛋白活性略高于在大肠杆菌(e.coli)knabc中的活性，相比之下，在ph7.0-7.5时，大肠杆菌(e.coli)ep432中表现出的k+/h+逆向转运蛋白活性却比在大肠杆菌(e.coli)knabc中的低(图10-c)。但与负对照相比，无论是knabc/pet19-sdmlt还是ep432/pet19-sdmlt均表现出更高的k+/h+逆向转运蛋白活性，这说明sdmlt具有k+/h+逆向转运蛋白活性。实施例6大肠杆菌(e.coli)k12的dcta基因敲除为了进一步验证是否sdmlt为一个cits型na+/苹果酸同向转运蛋白，本发明首先需要获得大肠杆菌(e.coli)k12的苹果酸输出蛋白的基因突变株。在大肠杆菌(e.coli)k12中，只有dcta基因编码一个四碳2-羟基羧酸转运蛋白，该蛋白能够摄取含有四个碳原子的2-羟基羧酸。苹果酸即为四碳2-羟基羧酸，因此该突变株被用于来源与其它菌株的四碳2-羟基羧酸转运蛋白同源物的鉴定工作。为了获得大肠杆菌(e.coli)k12的dcta基因敲除突变株；本发明设计了同源重组的引物(dcta-p1，dcta-p2)，引物序列见表1，设计策略见图12。使用验证引物dcta-f、dcta-r直接菌液pcr经氯霉素抗性筛选得到的突变株。结果显示，原有的dcta基因已被pkd3质粒中的片段所替代(图13)。进一步本发明测试了大肠杆菌k12dcta基因敲除突变株摄取l-苹果酸的能力，结果显示，肠杆菌k12dcta基因敲除突变株失去苹果酸摄取能力，在作为苹果酸作唯一碳源的m9培养基中的无法生长(图14)。表1dcta基因敲除相关引物table1.dctageneknockoutrelatedprimersseqidno.5：dcta-p1：atgaaaacctctctgtttaaaagcctttactttcaggtcctgacagcgattgtgtaggctggagctgcttc；seqidno.6：dcta-p2：ttaagaggataattcgtgcgttttgccatccggcgcacgattattcagcacatatgaatatcctcctta；seqidno.7：dcta-f：tcgtgttagaccgcaagaac；seqidno.8：dcta-r：aaggcgtggagactgaagca。实施例7sdmlt基因在大肠杆菌(e.coli)k12δdcta敲除突变株的互补实验：为了进一步验证是否sdmlt为一个cits型na+/苹果酸同向转运蛋白，本发明将空载体puc18(负对照)、pet19(负对照)puc-sdmlt(sdmlt基因构建到puc18的载体)、pet-sdmlt(sdmlt基因构建到pet19的载体)以及puc-dp11(sdmlt基因插入puc18的原始克隆)均转化获得大肠杆菌(e.coli)k12δdcta敲除突变株感受态细胞，在含有0.2％l-苹果酸的m9基本培养基测试sdmlt是否恢复大肠杆菌(e.coli)k12δdcta敲除突变株摄取苹果酸的能力。如图15所示，在24h内，δdcta/puc-sdmlt在含有0.2％l-苹果酸的m9基本培养基的生长，与大肠杆菌(e.coli)k12的生长情况类似，相比之下，大肠杆菌(e.coli)k12δdcta敲除突变株以及δdcta/puc18均无法生长，有报道称mlen基因能够在三天内恢复大肠杆菌(e.coli)k12δdcta敲除突变株在含有0.2％l-苹果酸的m9基本培养基的生长，即使我们培养3天，大肠杆菌(e.coli)k12δdcta敲除突变株以及δdcta/puc18也均无法生长。本发明构建了融合到pet19上his-tag标签的sdmlt基因表达载体。因此，本发明也验证了pet-sdmlt能否恢复大肠杆菌(e.coli)k12δdcta敲除突变株的互补实验。如图16所示，δdcta/pet-sdmlt在72h内能够恢复大肠杆菌(e.coli)k12δdcta敲除突变株在含有0.2％l-苹果酸的m9基本培养基的生长，然而，大肠杆菌(e.coli)k12δdcta敲除突变株以及δdcta/pet19也均无法生长。以上结果表明，sdmlt为一个苹果酸摄取蛋白。为了进一步证实sdmlt一个na+/苹果酸同向转运蛋白，即苹果酸的摄取是否依赖于na+，本发明在0.2％l-苹果酸的m9基本培养基中使用kh2po4替换掉培养基中由于nah2po4，以去除掉培养基中含有的na+。如图17所示，只有大肠杆菌(e.coli)k12能够生长，而e.colik12δdcta、δdcta/puc-sdmlt、δdcta/pet-sdmlt、δdcta/puc18、δdcta/pet-sdmlt在24h内均无法生长，即使培养到72h也是类似情况(结果未出示)。以上结果表明，sdmlt一个na+/苹果酸同向转运蛋白。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。<110>东北农业大学<120>喜盐芽胞杆菌钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlt及鉴定<160>8<210>1<211>1329<212>dna<213>安达喜盐芽孢杆菌（halobacillusandaensis）<400>1atgtccagttcagctgaaagagtccgtacacaacaacctgtaaagactaatgttacttctctaaaccacgaaaagaaagcggttacaatatttggtattccacctatttggttttttgcgattacagctttgacgttagtcagcatgtatacaggaaacttaccaggggggatgcttggcagtctgctcgttatgatggtccttggcgagctctttggatggatcggtgataaaaccccaattcttaaaacctatttaggaggcggggcaattttagccatctttggtgctgcatatatggtgtatgctggtttaattcctgattcaaccgttacgatgatcaacgacttcatgaaagatggaggcttcttaaacttctatattgctgccttaattacaggtagtattctaggaatgaataagcagatcttgataaaagtcggcctcaaatacttcttaccgatctttggtgcggtgttcggagccatgattgtggctggtctgttcggtgccctcgtcggattctctttaactgatgctgtgcttgtgattacaatgccgatcatgggaggcggaatgggagctggagccgttcctatgagtcaaatttatagtgaactaatggggaatgatcctagttactatatttctatgctcgttccagctttagctttaggtaacgtttttgctattattctagcaagtatgctgaatatccttggaaaaaaagtaccgtctttaactgggaatggccagctattgaaggggttcgaatataaagaagaaaaatcatcgtttgatattcaaaagatggggattggactaatggcagcgatcctattcttttcgatcggaacattagcagccggatttatcccgctgcatgcttacgccttaatgatcattattgtagccttggccaaaatcgcagacatcattccgaaaaatatcttagatggagcgaaccaatggtataagtttgtggctaagaactggacacttgctctcttgttcgggattggaatcgcctataccgacttaaatactgtacttgaagccttaacacttcaatacatcgtcacagtgcttggtgtcgtagtgggtgctgtcatcggtgcaggacttcttggtaaacttgtcggtttctatcctattgaatctgcaatcacggcaggactatgtatggctaacatgggaggcacaggagatgtagctgttctatcttcatcaagaagaatggaacttatgccattcgctcagatttcctctcgtttaggaggagccatcatcttgctgctggctggtttacttattccgttgctaatgtaa<210>2<211>442<212>prt<213>安达喜盐芽孢杆菌（halobacillusandaensis）<400>2metserserseralagluargvalargthrglnglnprovallysthrasnvalthrserleuasnhisglulyslysalavalthrilepheglyileproproiletrpphephealailethralaleuthrleuvalsermettyrthrglyasnleuproglyglymetleuglyserleuleuvalmetmetvalleuglygluleupheglytrpileglyasplysthrproileleulysthrtyrleuglyglyglyalaileleualailepheglyalaalatyrmetvaltyralaglyleuileproaspserthrvalthrmetileasnaspphemetlysaspglyglypheleuasnphetyrilealaalaleuilethrglyserileleuglymetasnlysglnileleuilelysvalglyleulystyrpheleuproilepheglyalavalpheglyalametilevalalaglyleupheglyalaleuvalglypheserleuthraspalavalleuvalileth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