拟南芥PPR1基因在调控植物抗镉性能中的应用的制作方法

本发明涉及拟南芥ppr1基因在调控植物抗镉性能中的应用，属于分子生物学和基因工程领域。

背景技术

随着工业发展，工矿企业产生的工业废弃物及农业生产中农药的大量应用，使人类赖以生存的土壤和水源受到严重污染。农田土壤中的镉不仅影响作物的产量和品质，还可通过食物链影响人类的健康。农产品中镉的残留和富集给人类健康带来极大的安全隐患。更危险的是，土壤镉污染具有不可逆转性，被镉污染的土壤可能要100～200年甚至更长的时间才能够恢复。镉是这些废弃物及农药中的一种有毒重金属，对动植物健康和生态系统有很大危害(devriesetal.,2007)。因此，镉污染已成为全球非常重要且急需解决的环境问题之一。人们在关注如何用物理、化学和生物技术对污染的环境进行修复的同时,也在关注如何提高植物和作物抗重金属镉的能力。通过农作物及产品摄入是镉进入人体并危害人类身心健康的重要来源之一，因此培育在污染土壤上生长的无镉或低镉作物新品种成为生物学家关注的重点。镉不是高等植物必需的成分，无任何生物功能。土壤中的镉可通过植物阳离子zn和fe的转运蛋白或者非特异的nramp家族蛋白吸收并在各种组织中积累(grossoehmeetal.,2006)。在一定浓度范围外，重金属胁迫才会使植物生理生化过程及代谢异常。植物在重金属作用下可产生大量活性氧自由基，这些活性氧自由基与细胞膜上的不饱和脂肪酸相互作用，使细胞膜透性增加，膜两侧物质无阻力进出细胞膜，致使细胞生理生化过程紊乱。重金属胁迫也会对植物细胞核膜造成损伤，凝集染色质、核仁解体、细胞膜通透性增加、线粒体的呼吸作用和叶绿体的光合作用异常等镉积累会使叶绿素合成降低,光合器官受损,植物光合作用明显减弱(bietal.,2009)。镉降低氮等营养吸收，破坏碳和氮代谢，导致生长发育延缓甚至死亡，其中镉诱导过氧化物积累被认为可能是导致植物细胞伤害的重要原因(rodriguez-serranoetal.,2009)。目前,已有的遗传学证据和基因组表达谱分析结果显示,拟南芥中络合素(pcs)和谷胱甘肽(gsh)很可能在植物降低镉毒害中起关键作用(majumdaretal.,2018)。但对植物细胞如何消解重金属镉的毒害作用及植物在生理生化、细胞尤其分子水平的响应机制还知之甚少。模式植物拟南芥为进行上述几个层面的研究提供了有力的途径。最近已经发现拟南芥无论是萌发还是幼苗生长对于镉的响应都非常显著,而这种响应过程伴随过氧化物的积累及相关酶活性的改变(garnieretal.,2006)，说明植物对镉的响应有保守的机制(garnieretal.,2006)。

ppr蛋白是由核基因编码的35个简并氨基酸作为重复单位串联排列组成的蛋白质，这些由35个简并氨基酸组成的重复单位称为ppr基序。在蛋白质分子中包含的ppr基序的数目从2～26个不等,平均是12个,由于其串连重复排列，约占蛋白质序列的2/3左右。一般情况下，ppr蛋白由n端的信号序列、串联重复的基序单元和c端结构域组成。ppr蛋白在细胞器的基因表达过程中具有重要的生理功能，几乎参与了基因表达的各个阶段，包括转录、rna剪接、rna编辑、翻译以及rna稳定性的保持。ppr蛋白是一种rna结合蛋白，在拟南芥中发现有多于200个蛋白含有rna结合基序,大多数对应于rrm和kh类，其他包括rna螺旋、pabp、grp和拟南芥花期调控基因fac。

拟南芥ppr1位于拟南芥1号染色体上，基因号为at1g06580，ppr1基因长度为1500bp左右。目前对ppr1的研究仅限于ppr1作为拟南芥mir400的靶基因之一参与调控植物病毒防御过程(拟南芥参与植物对致病真菌和细菌的防御主要是以mir400靶基因的形式)，研究表明，过表达ppr1能够明显提升拟南芥的抗病毒性能，而其突变体对致病细菌和真菌更加敏感。目前，关于ppr1如何参与cd胁迫还未见报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明提供了拟南芥ppr1基因的新用途——在调控植物抗镉性能中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

拟南芥ppr1基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

拟南芥ppr1蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

拟南芥ppr1基因、拟南芥ppr1蛋白在调控植物抗镉性能中的应用，在制备/培育具有抗镉性能的转基因植物中的应用。本发明通过研究发现，拟南芥ppr1基因能够显著降低植物在根的伸长量上的抗镉性，降低microrna400的表达，可提高植物的耐镉性，获得具有抗镉性能的植物(比野生型植株更抗镉)，过表达microrna400，可降低植物的耐镉性，获得抗镉性能弱的植物(比野生型植株更不抗镉)(注：拟南芥microrna400在调控植物耐镉性中的应用，已递交发明专利申请，目前尚未公开，其申请号为2018107000138)。

一种植物表达载体，其含有上述拟南芥ppr1基因。优选的，所述植物表达载体所用的质粒为pbi121。

一种遗传工程化的宿主细胞，其含有上述植物表达载体，或其基因组中插入了拟南芥ppr1基因。

所述遗传工程化的宿主细胞的构建方法为常规技术手段，将植物表达载体导入宿主细胞，使植物表达载体/拟南芥ppr1基因在宿主细胞中有效表达。

上述植物表达载体、遗传工程化的宿主细胞在制备具有抗镉性能的转基因植物(抗镉性能优于野生型植株)中的应用。所述植物包括拟南芥。

本发明通过trizol法提拟南芥rna，并进行反转录，以拟南芥cdna为模板，通过特异引物进行pcr扩增，回收纯化pcr产物，并测序。得到ppr1基因，将其连接于表达载体上，并利用农杆菌侵染法转化拟南芥，数据显示该ppr能够显著提高转基因拟南芥在根的伸长量上的抗镉性。同时通过购买该ppr的突变体，突变体与野生型相比抗镉性显著降低。本发明所述的ppr可为培育农作物新品种提供理论依据和基因来源，有助于从根本上改善经济作物的抗镉性能。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

附图说明

图1：野生型拟南芥、转基因拟南芥及突变体拟南芥在正常1/2ms培养基、含有95μmcdso4的1/2ms培养基上的根的伸长情况；其中，a：正常1/2ms培养基；b：含有95μmcdso4的1/2ms培养基。wt代表野生型拟南芥，oe3、oe9代表转基因拟南芥，ppr1代表突变体拟南芥。

图2：野生型拟南芥、转基因拟南芥及突变体拟南芥在正常1/2ms培养基、含有95μmcdso4的1/2ms培养基上的根的伸长统计情况；其中，其中，a：正常1/2ms培养基；b：含有95μmcdso4的1/2ms培养基。横坐标表示不同株系拟南芥，纵坐标表示根的伸长量。wt代表野生型拟南芥，oe3、oe9代表转基因拟南芥，ppr1代表突变体拟南芥。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1：拟南芥ppr1的克隆

(1)拟南芥rna的提取。

(2)ppr1基因的pcr扩增：以拟南芥cdna为模板，根据ppr1基因序列设计引物，进行pcr扩增，回收和纯化pcr扩增产物，并测序。引物为：

正向引物：5’-atgcgaagatcgattgtgattgtgattg-3’(seqidno.3)；

反向引物：5’-cttaattggcataagcccatcctctttttg-3’(seqidno.4)。

(3)pcr反应体系和扩增条件如表1所示。

表1

(4)测序送交生工公司进行测序。回收和纯化pcr扩增产物的具体操作如下：凝胶电泳后，用干净的刀片将带有目的片段(1500bp左右)的胶切割下来，放入到离心管中，胶不要切得过大，以避免回收时dna片段溶液含有大量的杂质。向离心管中加入等体积的xp2(bindingbuffer)溶液(体积/胶质量)后，在55℃条件下温浴10min，直到胶完全融化；将离心管中的溶液移到2ml的吸附柱中，离心1min，弃去液相；再次向吸附柱中加入0.5ml的xp2溶液，离心1min，弃去液相；向吸附柱加入0.70ml的spwwashbuffer溶液，离心1min，弃去液相；再次加入0.70ml的spwwashbuffer溶液，离心1min，弃去液相；再次离心1min后，将吸附柱放置在一个新的离心管上，静置10min，加入30μl的溶解液，静置1min，最后离心1min，得到的液相即为回收的dna溶液。

实施例2：重组表达载体的构建与转基因植物的制备

(1)重组表达载体的构建

根据拟南芥ppr1基因序列设计引物，pcr反应采用evo高保真酶进行pcr克隆。并通过t4dna连接到peasy-bluntsimplecloningkit载体(购买自transgen公司)中。将连接产物转化大肠杆菌后，取转化菌液涂在含有卡纳抗性的lb平板上，挑取菌落至含相应抗生素培养基溶液中摇菌培养确认后提取阳性克隆的质粒，酶切，电泳并将目的条带回收。回收的目的条带连入到双子叶植物双元表达载体pbi121(本实验室保存)表达载体。反应产物转化大肠杆菌后涂板、筛选阳性克隆、提取质粒，然后进行农杆菌转化等实验。

(2)农杆菌转化

冰浴融化农杆菌gv3101感受态细胞；加入3μl表达载体质粒，冰浴30min，液氮中冻1min，然后在37℃水浴5min；加入950μl无抗生素的yep培养基，28℃，200rpm，振荡培养4h；10000rpm离心1min以浓缩菌液，用100μlyep回溶菌体；将回溶后的菌体涂于附加50mg/l卡那霉素和100mg/l利福平的固体yep培养基上，28℃培养36～48h。菌液pcr检测阳性克隆。

(3)培养转基因植株

挑取农杆菌单菌落，加入6mllb(kan)培养基中，培养过夜；室温下，6000rpm，离心5min，收集菌体；用8～10ml侵染液(5％蔗糖，0.03～0.05％silwetl)悬浮菌体，混匀；将拟南芥的花序浸到侵染液中，侵染10～15s，然后将拟南芥取出放入暗箱中，上面覆膜，黑暗培养12h；将拟南芥取出，在长日照下正常培养，每隔5～7d侵染一次，一般侵染3～4次；收获侵染后成熟的拟南芥种子，干燥后储存。

(4)转基因植物筛

选取拟南芥种子，用70％乙醇消毒5min，再用2.6％的naclo消毒10min，用无菌水漂洗3～5遍，除净残留的naclo溶液；将消毒的拟南芥种子平铺到含有50mg/lkan的1/2ms培养基上，4℃黑暗处理2d；成层处理后，将培养皿置于光照培养箱中，22℃，生长7d左右，选取子叶仍为绿色的拟南芥幼苗转移到培养基质中培养；三周后，从每株上选取叶片，提取基因组dna，进行鉴定。

实施例3：野生型、ppr1过表达株系与突变体在不同镉浓度下的生长特性比较

ppr1过表达植株具有较强的镉胁迫耐性。将获得的两个ppr1过表达株系(实施例2获得)分别命名为oe3、oe9，突变体为ppr1。

将野生型拟南芥、oe3、oe9、ppr1分别在正常1/2ms培养基、含有95μmcdso41/2ms培养基上培养，结果如下：野生型、过表达株系和突变体在正常1/2ms培养基上长势相同，见图1a，说明该基因表达量上升或敲除不会影响植物的正常生长发育过程。野生型、过表达株系和突变体生长在含有95μmcdso41/2ms培养基上的时候，野生型植株根的伸长量要比ppr1过表达株系要短，突变体与野生型相比更短，见图1b。这些结果说明ppr1基因参与到植物耐镉过程。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。

序列表

<110>山东农业大学

<120>拟南芥ppr1基因在调控植物抗镉性能中的应用

<141>2018-09-12

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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