抗PD-1-抗VEGFA的双功能抗体、其药物组合物及其用途的制作方法

本发明属于肿瘤治疗和免疫学生物学领域，涉及一种抗pd-1-抗vegfa的双功能抗体、其药物组合及其用途。具体地，本发明涉及一种抗人pd-1-抗人vegfa的双功能抗体、其药物组合及其用途。
背景技术：
肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提高。肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长期转为有血管的快速增殖期，血管的生成使肿瘤能获得足够的营养而完成血管切换期，如果没有血管的生成，原发肿瘤的生长不超过1－2mm，转移则无法实现。血管内皮生长因子(vegf)是一类能促进内皮细胞分裂增殖、促进新生血管的形成、提高血管通透性的生长因子，它与细胞表面的血管内皮生长因子受体结合，通过激活酪氨酸激酶信号转导途径发挥功能。在肿瘤组织中，肿瘤细胞、肿瘤侵入的巨噬细胞和肥大细胞能分泌高水平的vegf，以旁分泌的形式刺激肿瘤血管内皮细胞，促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞内皮细胞侵润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移，因而抑制肿瘤血管生成被认为是当前最具有前途的肿瘤治疗方法之一。vegf家族包括：vegfa、vegfb、vegfc、vegfd和pigf。血管内皮生长因子受体(vegfr)包括vegfr1(又称flt1)、vegfr2(又称kdr或flk1)、vegfr3(又称flt4)和neuropilin-1(nrp-1)。其中，前三种受体在结构上类似，都属于酪氨酸激酶超家族，均由膜外区、跨膜片段及膜内区三部分构成，其中膜外区由免疫球蛋白样结构域组成，膜内区属酪氨酸激酶区。vegfr1和vegfr2主要位于血管内皮细胞表面，vegfr3主要位于淋巴管内皮细胞表面。vegf家族分子对于几种受体有不同的亲和力。vegfa主要与vegfr1、vegfr2和nrp-1结合发挥作用。vegfr1是最早发现的受体，在正常生理情况下vegfr1与vegfa的亲和力比vegfr2与vegfa的亲和力高，但是其胞内段酪氨酸酶活性比vegfr2低(马莉，中国优生与遗传杂志，24(5)：146-148(2016))。vegfr2是血管发生和构建的主要调节者，与vegfr1相比vegfr-2具有很高的酪氨酸激酶活。vegfr2与配体vegfa结合后介导血管内皮细胞的增殖、分化等行为，以及血管的形成过程和血管的通透性(roskoskirjr.等人，critrevoncolhematol，62(3)：179-213.(2007))，vegfa与vegfr2结合后通过下游plc-γ-pkc-raf-mek-mapk信号传导通路介导胞内相关蛋白基因转录表达，促进血管内皮细胞增殖(takahashit等人，oncogene，18(13)：2221-2230.(1999))。vegfr3属于酪氨酸激酶家族成员之一，主要表达在胚胎时期的血管内皮细胞和成年期的淋巴管内皮细胞，vegfc和vegfd与vegfr3结合以刺激淋巴管内皮细胞的增殖与迁移，促进淋巴管的新生；nrp-1是一种非酪氨酸激酶跨膜蛋白，不能独立转导生物信号，而与vegf酪氨酸激酶受体形成复合物后才能介导信号传导。(马莉，中国优生与遗传杂志，24(5)：146-148(2016))。vegfa与vegfr2主要参与调控血管生成，vegfa与vegfr2结合前后会引发上下游通路中众多中间信号形成级联反应，最终以内皮细胞增殖、存活、迁移、通透性增加及浸润到周围组织等不同形式改变其生理功能(董宏超等人，《现代肿瘤医学》，2014年9月第22卷，第9期，第2231-3页)。目前已经有多种靶向人vegf特别是vegfa的人源化单克隆抗体，如贝伐单抗(bevacizumab)，其于2004年期间陆续被美国食品药品管理局批准用于治疗非小细胞肺癌、肾细胞癌、宫颈癌、转移性结直肠癌等多种肿瘤。细胞程序性死亡受体-1(programmedcelldeathprotein，pd-1),又被称为cd279，是i型跨膜糖蛋白膜表面受体，属于cd28免疫球蛋白超家族，表普遍达于t细胞，b细胞以及髓样细胞都。pd-1有两个天然配体，pd-l1和pd-l2。pd-l1和pd-l2均属于b7超家族，组成性地或诱导性地表达于多种细胞膜表面，包括非造血系统细胞以及多种肿瘤细。pd-l1主要表达于t细胞、b细胞、dc以及微血管内皮细胞和多种肿瘤细胞。pd-l2则仅表达于抗原呈递细胞如树突状细胞和巨噬细胞。pd-1与其配体的相互作用可抑制淋巴的活化，抑制t细胞的增殖以及il-2、ifn-γ等细胞因子的分泌。有大量研究表明肿瘤微环境可保护肿瘤细胞免受免疫细胞的破坏，而肿瘤微环境中浸润的淋巴细胞pd-1表达上调，且多种原发肿瘤组织在免疫组化分析中均表现为pd-l1阳性，如肺癌、肝癌、卵巢癌、皮肤癌、结肠癌、胶质瘤等。同时，pd-l1在肿瘤的表达与癌症患者的不良预后显著相关。阻断pd-1与其配体的相互作用可促进肿瘤特异性的t细胞免疫，提高肿瘤细胞的免疫清除效率。大量临床试验表明，靶向pd-1或pd-l1的抗体可促进cd8+t细胞浸润到肿瘤组织，上调抗肿瘤的免疫效应因子，如il-2、ifn-γ，颗粒酶b以及穿孔素，从而有效抑制肿瘤的生长。此外，抗pd-1的抗体还可用于治疗病毒慢性感染。病毒慢性感染往往伴随着病毒特异性的效应t细胞功能丧失和数量的减少。通过注射pd-1抗体可阻断pd-1和pd-l1的相互作用，从而有效抑制效应t细胞在病毒慢性感染中的耗竭。由于pd-1抗体的广谱抗肿瘤前景和惊人的药效，业界普遍认为针对pd-1通路的抗体将带来治疗多种肿瘤治疗的突破性的进展：用于治疗非小细胞性肺癌，肾细胞癌，卵巢癌，黑色素瘤(hometm.b.,parisig.,etal.,anti-pd-1therapyinmelanoma.seminoncol.2015jun；42(3):466-473)，淋巴瘤以及贫血(heldsa,heinea,etal.,advancesinimmunotherapyofchronicmyeloidleukemiacml.currcancerdrugtargets.2013sep；13(7):768-74)。在2012年和2013年的美国癌症协会(aacr)年会以及美国临床肿瘤协会(asco)年会上揭晓的前所未有的临床药效数据后，既成为全球制药行业最炙手可热的在研新药。双功能抗体亦称为双特异性抗体(bispecificantibody)，是同时靶向两种不同抗原的特异性药物，其可通过免疫分选纯化生产。另外，也可通过基因工程获得，基因工程在结合位点优化，合成形式的考量以及产量等方面都具有相应的灵活性，所以具有一定的优势。目前，其存在形式已被证明有超过45种(kontermannre.bispecificantibodiesforcancerimmunotherapy:currentperspectives.biodrugs2010；24:89-98)。目前已开发的多种双特异性抗体为igg-scfv形式即morrison模式(1997colomamj,morrisonsl.designandproductionofnoveltetravalentbispecificantibodies.natbiotechnol.naturebiotechnology,1997；15:159-163)，由于这种类似于天然存在的igg形式，其在抗体工程、表达和纯化上所具有的优势，已被证明是双功能抗体的一种理想存在形式(millerbr,demarestsj,etal.,stabilityengineeringofscfvsforthedevelopmentofbispecificandmultivalentantibodies.proteinengdessel2010；23:549-57；fitzgeraldj,lugovskoya.rationalengineeringofantibodytherapeuticstargetingmultipleoncogenepathways.mabs2011；3:299-309)。目前，尚需要开发一种同时靶向pd-1和vegf(例如vegfa)的双功能抗体药物。技术实现要素：本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，基于已上市的vegfa单抗avastin(bevacizumab)和之前得到的14c12h1l1(请参见中国专利公开cn106977602a)，获得了能够同时结合vegfa和pd-1，并阻断vegfa与vegfr2结合、阻断pd-1与pd-l1结合的人源化双功能抗体，命名为vp101。本发明人惊奇地发现，vp101能够：有效地结合人免疫细胞表面的pd-1，解除pd-l1和pd-1介导的免疫抑制，促进人免疫细胞分泌ifn-γ和il-2；有效地抑制vegfa诱导的血管内皮细胞的增殖，从而抑制肿瘤诱发的血管发生；和/或具有用于制备防治肝癌、肺癌、黑色素瘤、肾肿瘤、卵巢癌、淋巴瘤等恶性肿瘤的药物的潜力。由此提供了下述发明：本发明的一个方面涉及一种双特异性抗体，其包括：靶向vegfa的第一蛋白功能区，和靶向pd-1的第二蛋白功能区；优选地，所述第一蛋白功能区为抗vegfa的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗vegfa的抗体的重链可变区包含氨基酸序列分别如seqidno:15－seqidno:17所示的hcdr1－hcdr3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如seqidno:18－seqidno:20所示的lcdr1-lcdr3；和所述第二蛋白功能区为抗pd-1的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗pd-1的抗体的重链可变区包含氨基酸序列分别如seqidno:21－23所示的hcdr1－hcdr3，并且其轻链可变区包含氨基酸序列分别如seqidno:24－26所示的lcdr1－lcdr3。在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述抗vegfa的抗体或其抗原结合片段选自fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab、互补决定区片段、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体；和/或，所述抗pd-1的抗体或其抗原结合片段选自fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab、互补决定区片段、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。在本发明的一些实施方式中，所述双特异性抗体为igg-scfv模式。在本发明的一些实施方式中，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列分别如seqidno:15－17的hcdr1－hcdr3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如seqidno:18－20的lcdr1－lcdr3；和所述第二蛋白功能区为单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列分别如seqidno:21－23所示的hcdr1－hcdr3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如seqidno:24－26所示的lcdr1－lcdr3；或者，所述第一蛋白功能区为单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列分别如seqidno:21－23所示的hcdr1－hcdr3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如seqidno:24－26所示的lcdr1－lcdr3；和所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列分别如seqidno:15－17的hcdr1－hcdr3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如seqidno:18－20的lcdr1－lcdr3。在本发明一个具体的实施方式中，本发明涉及一种双特异性抗体，其包括：靶向vegfa的第一蛋白功能区，和靶向pd-1的第二蛋白功能区；其中，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列如seqidno:15－17的hcdr1－hcdr3，其轻链可变区包含氨基酸序列如seqidno:18－20的lcdr1－lcdr3；和所述第二蛋白功能区为单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列如seqidno:21－23所示的hcdr1－hcdr3，其轻链可变区包含氨基酸序列如seqidno:24－26所示的lcdr1－lcdr3；或者，所述第一蛋白功能区为单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列如seqidno:21－23所示的hcdr1－hcdr3，其轻链可变区包含氨基酸序列如seqidno:24－26所示的lcdr1－lcdr3；和所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列如seqidno:15－17的hcdr1－hcdr3，其轻链可变区包含氨基酸序列如seqidno:18－20的lcdr1－lcdr3。在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:5所示，所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:7所示；和所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:9所示；所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:11所示；或者，所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:9所示；所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:11所示；和重链可变区的氨基酸序列如seqidno:5所示，所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:7所示。在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述的免疫球蛋白包括非-cdr区，且所述非-cdr区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述的免疫球蛋白，其恒定区来自人抗体；优选地，所述免疫球蛋白的恒定区选自人igg1、igg2、igg3或igg4的恒定区。在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述的免疫球蛋白，其重链恒定区为人iggamma-1chaincregion或人iggamma-4chaincregion，并且其轻链恒定区为人igkappachaincregion。在本发明的一些实施方案中，所述免疫球蛋白的恒定区是人源化的，例如，重链恒定区均采用iggamma-1chaincregion，accession:p01857；轻链恒定区均采用igkappachaincregion，accession:p01834。在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区直接连接或者通过连接片段连接；优选地，所述连接片段为(ggggs)m，m为正整数，例如1、2、3、4、5或6。其中，ggggs(seqidno:14)为linker的构成单元。在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区独立地为1个、2个或者2个以上。在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述免疫球蛋白为1个；所述单链抗体为2个，并且优选为两个相同的单链抗体。在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述免疫球蛋白为igg、iga、igd、ige或igm；优选为igg,例如igg1、igg2、igg3或igg4。在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述单链抗体连接在免疫球蛋白的重链的c末端。由于免疫球蛋白由两条重链，因此，一个免疫球蛋白分子连接有两个单链抗体分子。优选地，两个单链抗体分子相同。在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述单链抗体为两条，每条单链抗体的一端分别连接在免疫球蛋白的两条重链的c末端或n末端。在本发明的一些实施方式中，所述单链抗体的vh与vl之间存在二硫键。在抗体的vh和vl之间引入二硫键的方法是本领域熟知的，例如可参见美国专利申请us5,747,654；rajagopal等人，prot.engin.10(1997)1453-1459；reiter等人，naturebiotechnology14(1996)1239-1245；reiter等人，proteinengineering8(1995)1323-1331；webber等人，molecularimmunology32(1995)249-258；reiter等人，immunity2(1995)281-287；reiter等人，jbc269(1994)18327-18331；reiter等人，inter.j.ofcancer58(1994)142-149；或，reiter等人，cancerres.54(1994)2714-2718；其通过引用并入本文。在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述的双特异性抗体以小于10-5m，例如小于10-6m、10-7m、10-8m、10-9m或10-10m或更小的kd结合vegfa蛋白和/或pd-1蛋白；优选地，所述kd通过biacore分子相互作用仪或fortebio分子相互作用仪测得。本发明的另一方面涉及一种分离的核酸分子，其编码本发明中任一项所述的双特异性抗体。本发明还涉及一种载体，其包含本发明的分离的核酸分子。本发明还涉及一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子，或者包含本发明的载体。本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的双特异性抗体的方法，其包括在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收所述双特异性抗体的步骤。本发明的再一方面涉及一种偶联物，其包括双特异性抗体以及偶联部分，其中，所述双特异性抗体为本发明中任一项所述的双特异性抗体，所述偶联部分为可检测的标记；优选地，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。本发明的再一方面涉及一种试剂盒，其包含本发明中任一项所述的双特异性抗体，或者包含本发明所述的偶联物；优选地，所述试剂盒还包含第二抗体，其能够特异性结合所述双特异性抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的双特异性抗体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测vegfa和/pd-1在样品中的存在或其水平。本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明中任一项所述的双特异性抗体或者包含本发明的偶联物；可选地，其还包括药学上可接受的辅料。本发明的双特异性抗体或者本发明的药物组合物可以配制成药学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的双特异性抗体，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如无菌无热原水。此外，本发明的双特异性抗体可以以单位剂量形式存在于药物组合物中，以便于施用。在某些实施方案中，所述单位剂量为至少1mg，至少5mg，至少10mg，至少15mg，至少20mg，至少25mg，至少30mg，至少45mg，至少50mg，至少75mg，或至少100mg。在所述药物组合物为液体(例如，注射剂)剂型的情况下，其可以包含浓度至少为0.1mg/ml，如至少0.25mg/ml，至少0.5mg/ml，至少1mg/ml，至少2.5mg/ml，至少5mg/ml，至少8mg/ml，至少10mg/ml，至少15mg/ml，至少25mg/ml，至少50mg/ml，至少75mg/ml，或至少100mg/ml的本发明的双特异性抗体。本发明的双特异性抗体或药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一个优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体或药物组合物通过静脉输注或注射给予。本发明所提供的双特异性抗体或药物组合物可以单独使用或联合使用，也可以与另外的药学活性剂(例如肿瘤化疗药物)联合使用。这种另外的药学活性剂可以在施用本发明的双特异性抗体或本发明的药物组合物之前、同时或之后施用。在本发明中，可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的双特异性抗体或者本发明的偶联物在制备预防和/或治疗恶性肿瘤的药物中的用途；优选地，所述肿瘤选自结肠癌、直肠癌、肺癌例如非小细胞性肺癌、肝癌、卵巢癌、皮肤癌、胶质瘤、黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、胃肠道癌、乳腺癌、脑癌和白血病。本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的双特异性抗体或者本发明的偶联物在制备如下药物或试剂中的用途：(1)检测样品中的vegfa水平的药物或试剂，阻断vegfa与vegfr2结合的药物或试剂，下调vegfa的活性或其水平的药物或试剂，解除vegfa对血管内皮细胞增殖的刺激作用的药物或试剂，抑制血管内皮细胞增殖的药物或试剂，或者阻断肿瘤血管生成的药物或试剂；和/或(2)阻断pd-1与pd-l1结合的药物或试剂，下调pd-1的活性或其水平的药物或试剂，解除pd-1对机体免疫抑制的药物或试剂，促进t淋巴细胞中ifn-γ分泌的药物或试剂，或者促进t淋巴细胞中il-2分泌的药物或试剂。在本发明的一个实施方案中，所述用途是非治疗目的的和/或非诊断目的的。本发明的再一方面涉及一种在体内或在体外的方法，包括施加细胞以有效量的本发明任一项所述的双特异性抗体或者本发明的偶联物的步骤，所述方法选自如下：(1)检测样品中的vegfa水平的方法，阻断vegfa与vegfr2结合的方法，下调vegfa的活性或其水平的方法，解除vegfa对血管内皮细胞增殖的刺激作用的方法，抑制血管内皮细胞增殖的方法，或者阻断肿瘤血管生成的方法；和/或(2)阻断pd-1与pd-l1结合的方法，下调pd-1的活性或其水平的方法，解除pd-1对机体免疫抑制的方法，促进t淋巴细胞中ifn-γ分泌的方法，或者促进t淋巴细胞中il-2分泌的方法。在本发明的一个实施方案中，所述体外方法是非治疗目的的和/或非诊断目的的。本发明的体外实验中，抗vegfa抗体及抗vegfa-抗pd-1双功能抗体均能抑制huvec细胞增殖，抗pd-1抗体及抗vegfa-抗pd-1双功能抗体均能促进ifnγ和/或il-2的分泌激活免疫反应。本发明的再一方面涉及一种预防和/或治疗恶性肿瘤的方法，包括给予受试者有效量的本发明中任一项所述的双特异性抗体或者本发明的偶联物的步骤；优选地，所述肿瘤选自结肠癌、直肠癌、肺癌例如非小细胞性肺癌、肝癌、卵巢癌、皮肤癌、胶质瘤、黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、胃肠道癌、乳腺癌、脑癌和白血病。本发明的双特异性抗体的治疗或预防有效量的典型非极限范围是0.02－50mg/kg，例如0.1－50mg/kg，0.1－25mg/kg，或1－10mg/kg。应注意的是，剂量可随需要治疗的症状的类型和严重性不同而发生变化。此外，本领域技术人员理解，对于任一特定患者，特定的给药方案应根据患者需要和医生的专业评价而随时间调整；此处给出的剂量范围只用于举例说明目的，而不限定本发明药物组合物的使用或范围。在本发明中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。根据本发明中任一项所述的双特异性抗体或者偶联物，其用于预防和/或治疗恶性肿瘤；优选地，所述肿瘤选自结肠癌、直肠癌、肺癌例如非小细胞性肺癌、肝癌、卵巢癌、皮肤癌、胶质瘤、黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、胃肠道癌、乳腺癌、脑癌和白血病。根据本发明中任一项所述的双特异性抗体或者偶联物，其用于：(1)检测样品中的vegfa水平，阻断vegfa与vegfr2结合，下调vegfa的活性或其水平，解除vegfa对血管内皮细胞增殖的刺激作用，抑制血管内皮细胞增殖，或者阻断肿瘤血管生成；和/或(2)阻断pd-1与pd-l1结合，下调pd-1的活性或其水平，解除pd-1对机体免疫抑制，促进t淋巴细胞中ifn-γ分泌，或者促进t淋巴细胞中il-2分泌。抗体治疗药物，特别是单克隆抗体(mab)已在多种疾病的治疗中取得了良好的疗效。获取这些治疗性抗体的传统实验方法是采用抗原免疫动物，在免疫动物体内获取靶向抗原的抗体，或通过亲和力成熟的方法来改进那些与抗原的亲和力较低的抗体。然而，这些方法需要大量时间和精力，大多数时候也并不能针对抗原上的特定表位。轻链和重链的可变区决定抗原的结合；每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(cdr)(重链(h)的cdr包含hcdr1、hcdr2、hcdr3，轻链(l)的cdr包含lcdr1、lcdr2、lcdr3；其由kabat等人命名，见sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition(1991),第1-3卷,nihpublication91-3242,bethesdamd)。通过本领域技术人员所熟知的技术手段，例如通过vbase2数据库分析下面的(1)-(13)项中的单克隆抗体序列的cdr区的氨基酸序列，结果如下：(1)bevacizumab重链可变区的氨基酸序如seqidno:5所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:7所示。其重链可变区的3个cdr区的氨基酸序列如下：hcdr1:gytftnyg(seqidno:15)hcdr2:intytgep(seqidno:16)hcdr3:akyphyygsshwyfdv(seqidno:17)其轻链可变区的3个cdr区的氨基酸序列如下：lcdr1:qdisny(seqidno:18)lcdr2:fts(seqidno:19)lcdr3:qqystvpwt(seqidno:20)(2)14c12h1l1重链可变区的氨基酸序如seqidno:9所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:11所示。其重链可变区的3个cdr区的氨基酸序列如下：hcdr1:gfafssyd(seqidno:21)hcdr2:isgggryt(seqidno:22)hcdr3:anrygeawfay(seqidno:23)其轻链可变区的3个cdr区的氨基酸序列如下：lcdr1:qdinty(seqidno:24)lcdr2:ran(seqidno:25)lcdr3:lqydefplt(seqidno:26)(3)vp101其重链可变区的9个cdr区的氨基酸序列如下：hcdr1:gytftnyg(seqidno:15)hcdr2:intytgep(seqidno:16)hcdr3:akyphyygsshwyfdv(seqidno:17)hcdr4:gfafssyd(seqidno:21)hcdr5:isgggryt(seqidno:22)hcdr6:anrygeawfay(seqidno:23)hcdr7:qdinty(seqidno:24)hcdr8:ran(seqidno:25)hcdr9:lqydefplt(seqidno:26)其轻链可变区的3个cdr区的氨基酸序列如下：lcdr1:qdisny(seqidno:18)lcdr2:fts(seqidno:19)lcdr3:qqystvpwt(seqidno:20)在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。如本文中所使用的，当提及vegfa蛋白(genbankid：np_001165097.1)的氨基酸序列时，其包括vegfa蛋白的全长，还包括vegfa的融合蛋白，例如与小鼠或人igg的fc蛋白片段(mfc或hfc)进行融合的片段。然而，本领域技术人员理解，在vegfa蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“vegfa蛋白”应包括所有此类序列，包括其天然或人工的变体。并且，当描述vegfa蛋白的序列片段时，其还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。在本发明的一个实施方案中，vegfa蛋白的氨基酸序列如seqidno:1的下划线部分所示(不含末尾的6个his，共302个氨基酸)。如本文中所使用的，当提及vegfr2蛋白(kdr)(genbankid：np_002244)的氨基酸序列时，其包括vegfr2蛋白的全长，或者vegfr2的胞外片段vegfr2-ecd或者包含vegfr2-ecd的片段；还包括vegfr2-ecd的融合蛋白，例如与小鼠或人igg的fc蛋白片段(mfc或hfc)进行融合的片段。然而，本领域技术人员理解，在vegfr2蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语vegfr2蛋白”应包括所有此类序列，包括其天然或人工的变体。并且，当描述vegfr2蛋白的序列片段时，其还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。在本发明的一个实施方案中，vegfr2的胞外片段vegfr2-ecd的氨基酸序列如seqidno:4的波浪线部分所示(766个氨基酸)。如本文中所使用的，如果没有特别说明，所述vegfr为vegfr1和/或vegfr2；其具体蛋白序列为现有技术中已知序列，可以参考现有文献或者genbank中公开的序列。例如，vegfr1(vegfr1,ncbigeneid:2321)；vegfr2(vegfr2,ncbigeneid:3791)。如本文中所使用的，当提及pd-1蛋白(programmedcelldeathprotein1,ncbigenbank:nm_005018)的氨基酸序列时，其包括pd-1蛋白的全长，或者pd-1的胞外片段pd-1ecd或者包含pd-1ecd的片段；还包括pd-1ecd的融合蛋白，例如与小鼠或人igg的fc蛋白片段(mfc或hfc)进行融合的片段。然而，本领域技术人员理解，在pd-1蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“pd-1蛋白”应包括所有此类序列，包括其天然或人工的变体。并且，当描述pd-1蛋白的序列片段时，其还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。如本文中所使用的，术语ec50是指半最大效应浓度(concentrationfor50％ofmaximaleffect)，是指能引起50％最大效应的浓度。如本文中所使用的，术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(l)链和一条“重”(h)链)组成的免疫球蛋白分子。从一般意义上，重链可以理解为抗体中分子量较大的多肽链，轻链是指抗体中分子量较小的多肽链。轻链可分类为κ和λ轻链。重链通常可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“j”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“d”区。各重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由3个结构域(ch1、ch2和ch3)组成。各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。vh和vl区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(cdr))，其间散布有较保守的称为构架区(fr)的区域。各vh和vl由按下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末端排列的3个cdr和4个fr组成。各重链/轻链对的可变区(vh和vl)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循kabatsequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987and1991))，或chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:878-883的定义。特别地，重链还可以包含3个以上cdr，例如6、9、或12个。例如在本发明的双功能抗体中，重链可以是igg抗体的重链的c端连接另一个抗体的scfv，这种情况下重链含有9个cdr。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，igg(例如，igg1，igg2，igg3或igg4亚型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗体。如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，fundamentalimmunology,ch.7(paul,w.,ed.,第2版，ravenpress,n.y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab和互补决定区(cdr)片段、单链抗体(例如，scfv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。如本文中所使用的，术语“fd片段”意指由vh和ch1结构域组成的抗体片段；术语“fv片段”意指由抗体的单臂的vl和vh结构域组成的抗体片段；术语“dab片段”意指由vh结构域组成的抗体片段(ward等人,nature341:544-546(1989))；术语“fab片段”意指由vl、vh、cl和ch1结构域组成的抗体片段；术语“f(ab')2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个fab片段的抗体片段。在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scfv)，其中vl和vh结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,bird等人,science242:423-426(1988)和huston等人,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883(1988))。此类scfv分子可具有一般结构：nh2-vl-接头-vh-cooh或nh2-vh-接头-vl-cooh。合适的现有技术接头由重复的ggggs氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(ggggs)4的接头，但也可使用其变体(holliger等人(1993)，proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由alfthan等人(1995)，proteineng.8:725-731，choi等人(2001)，eur.j.immunol.31:94-106，hu等人(1996)，cancerres.56:3055-3061，kipriyanov等人(1999)，j.mol.biol.293:41-56和roovers等人(2001)，cancerimmunol.描述。在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中vh和vl结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,holligerp.等人,proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448(1993)，和poljakr.j.等人,structure2:1121-1123(1994))。可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组dna技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(nature,256:495,1975)，但也可采用重组dna技术获得(如参见u.s.p4,816,567)。如本文中所使用的，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，而轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(u.s.p4,816,567tocabillyetal.；morrisonetal.,proc.natl.acad.sci.usa,81:68516855(1984))。如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分cdr区被一非人源抗体(供体抗体)的cdr区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(fr)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，jonesetal.,nature,321:522525(1986)；reichmannetal.,nature,332:323329(1988)；presta,curr.op.struct.biol.,2:593596(1992)；和clark,immunol.today21:397402(2000)。如本文中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，epitopemappingprotocolsinmethodsinmolecularbiology，第66卷，g.e.morris，ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek293细胞或人细胞等的动物细胞。如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5m，例如小于大约10-6m、10-7m、10-8m、10-9m或10-10m或更小的亲和力(kd)结合该抗原。在本发明的一些实施方案中，术语“靶向”是指特异性结合。如本文中所使用的，术语“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10-5m，例如小于大约10-6m、10-7m、10-8m、10-9m或10-10m或更小的解离平衡常数(kd)结合抗原，例如，如使用表面等离子体共振术(spr)在biacore仪中测定的。如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。如本文中所使用的，术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如remington'spharmaceuticalsciences.editedbygennaroar,19thed.pennsylvania:mackpublishingcompany,1995)，并且包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如pd-1与pd-l1结合或者vegf表达过高相关的疾病如肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如pd-1与pd-l1结合或者vegf表达过高相关的疾病如肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。发明的有益效果本发明的双特异性抗体vp101能够很好地特异性与vegfa结合，并且能够十分有效地阻断vegfa与vegfr2的结合，特异地解除vegfa对机体免疫抑制以及对血管形成的促进作用；vp101能够很好地特异性与pd-1结合，并且能够十分有效地阻断pd-1与pd-l1的结合，特异地解除pd-1对机体免疫抑制，激活免疫反应。附图说明图1：双功能抗体vp101的sds-page检测结果。从左至右的4个泳道的样品及其上样量依次为：非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体，1μg；还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体，1μg；marker，5μl；bsa，1μg。图2：抗体14c12h1l1与pd-1结合的动力学特征参数检测结果。图3：抗体vp101与pd-1结合的动力学特征参数检测结果。图4：抗体nivolumab与pd-1结合的动力学特征参数检测结果。图5：抗体bevacizumab与vegf结合的动力学特征参数检测结果。图6：抗体vp101与vegf结合的动力学特征参数检测结果。图7：采用间接elisa方法检测抗体vp101与vegfa的结合活性。图8：采用间接elisa方法检测抗体vp101与pd-1的结合活性。图9：采用竞争elisa方法检测抗体vp101与vegfr2竞争结合vegfa的活性。图10：采用竞争elisa方法检测抗体vp101与pd-l1竞争结合pd-1的活性。图11：facs法检测抗体14c12h1l1、vp101与293t-pd-1细胞表面蛋白pd-1结合ec50。图12：facs法检测抗体14c12h1l1、vp101与pd-l1竞争结合293t-pd-1细胞表面蛋白pd-1的活性。图13：bevacizumab、vp101对huvec细胞增殖的影响。图14：vp101对dc和pbmc混合培养体系中ifn-γ分泌的影响。图15：elisa法检测抗体14c12h1l1、vp101对pbmc、raji-pd-l1细胞混合培养所诱导的细胞因子il-2的分泌的影响。图16：elisa法检测抗体14c12h1l1、vp101对pbmc、raji-pd-l1细胞混合培养所诱导的细胞因子ifn-γ的分泌的影响。图17：不同浓度vp101对肿瘤生长的抑制作用。图18：不同浓度vp101对小鼠体重的影响。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。制备例1：融合蛋白pd-1-mfc、pd-1-hfc和pd-l1-hfc的制备融合蛋白pd-1-mfc、pd-1-hfc和pd-l1-hfc的制备以及sds-page电泳检测完全参照中国专利公开cn106632674a的制备例1进行。其中，本制备例中的融合蛋白pd-1-mfc、pd-1-hfc和pd-l1-hfc的氨基酸序列及其编码核酸序列分别与中国专利公开cn106632674a的制备例1中的pd-1-mfc、pd-1-hfc和pdl-1-hfc相同。制得了融合蛋白pd-1-mfc、pd-1-hfc和pd-l1-hfc。制备例2：融合蛋白vegfa-his的表达和纯化1.构建vegfa-his质粒以vegfahumancdna(购自origene公司)为模板进行pcr扩增并用普通dna产物纯化试剂盒纯化回收hvegfa-his片段。将回收后的hvegfa-his片段与表达载体pcdna3.1使用xbai&hindiii-hf酶切，胶回收目的基因片段和线性表达载体，通过t4连接酶连接，并将全部连接产物转化dh5a化学感受态细胞，涂布带有amp的agar平板，挑选分离良好的单菌落进行菌落pcr鉴定，将pcr鉴定结果为阳性的克隆子接种到lb培养基培养，并取菌液送广州英俊公司测序验证。测序结果比对显示，阳性重组子插入序列完全正确。2.融合蛋白vegfa-his的表达和纯化按照lipofectamin转染试剂盒(购自invitrogen公司)方法将重组质粒vegfa-his转染293f细胞(购自invitrogen公司)7天后，将培养液通过高速离心、上清浓缩并换液至bindingbuffera后上样至histrap柱，用elutionbuffera线性洗脱蛋白，初纯样品用hitrapdesalting柱换液至bindingbufferb并上样至hitrapq柱，用elutionbufferb线性洗脱蛋白、回收目标样品并换液至pbs。取纯化后样品加入还原型蛋白电泳上样缓冲液，进行sds-page电泳检测。制得了融合蛋白vegfa-his。vegfa-his的氨基酸序列如下(171aa)：apmaegggqnhhevvkfmdvyqrsychpietlvdifqeypdeieyifkpscvplmrcggccndeglecvpteesnitmqimrikphqgqhigemsflqhnkcecrpkkdrarqenpcgpcserrkhlfvqdpqtckcsckntdsrckarqlelnertcrcdkprrhhhhhh(seqidno:1)其中，下划线部分为vegfa的氨基酸序列。编码vegfa-his的核酸序列(513bp)gcacccatggccgagggcggcggccagaaccaccacgaggtggtgaagttcatggacgtgtaccagagaagctactgccaccccatcgagaccctggtggacatcttccaggagtaccccgacgagatcgagtacatcttcaagcccagctgcgtgcccctgatgagatgcggcggctgctgcaacgacgagggcctggagtgcgtgcccaccgaggagagcaacatcaccatgcagatcatgagaatcaagccccaccagggccagcacatcggcgagatgagcttcctgcagcacaacaagtgcgagtgcagacccaagaaggacagagccagacaggagaacccctgcggcccctgcagcgagagaagaaagcacctgttcgtgcaggacccccagacctgcaagtgcagctgcaagaacaccgacagcagatgcaaggccagacagctggagctgaacgagagaacctgcagatgcgacaagcccagaagacatcatcaccatcaccac(seqidno:2)制备例3：融合蛋白vegfr2-hfc的表达和纯化1.基因vegfr2-hfc的合成：对基因vegfr2(vascularendothelialgrowthfactorreceptor2,ncbigenbank:np_002244)的胞外片段vegfr2ecd所对应的氨基酸分别与tev及人igg的fc蛋白片段(hfc)进行融合设计(seqidno:3)。委托金斯瑞公司合成相应的编码核酸序列(seqidno:4)。vegfr2:vascularendothelialgrowthfactorreceptor2,ncbigenbank:np_002244；hfc:iggamma-1chaincregion，accession：p01857，106-330；融合蛋白vegfr2-hfc的氨基酸序列：(998aa)其中，带波浪下划线的为vegfr2的ecd部分，加边框部分为tev酶切位点，带实线下划线的为hfc部分。编码融合蛋白vegfr2-hfc的核酸序列：(2997bp)其中，带波浪下划线的为vegfr2的ecd部分，加边框为tev酶切位点，带实线下划线的为hfc部分。2.puc57simple-vegfr2-hfc质粒的构建：分别将金斯瑞公司将合成的vegfr2-hfc编码基因克隆到puc57simple(金斯瑞公司提供)表达载体中，获得puc57simple-vegfr2-hfc质粒。3.pcdna3.1-vegfr2-hfc重组质粒的构建：分别将质粒puc57simple-vegfr2-hfc进行酶切(xbai和bamhi)，电泳回收得到的融合基因片段vegfr2-hfc与pcdna3.1表达载体(购自invitrogen公司)进行连接反应，获得pcdna3.1-vegfr2-hfc，转染感受态大肠杆菌细胞dh5a(购自tiangen公司)，转染和培养按照说明书进行。筛选得到阳性的pcdna3.1-vegfr2-hfc克隆菌落，按照常规方法扩增大肠杆菌，然后采用试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，dp103-03)并按照试剂盒的说明书提取得到pcdna3.1-vegfr2-hfc重组质粒。4.重组质粒pcdna3.1-vegfr2-hfc转染293f细胞按照lipofectamin转染试剂盒(购自invitrogen公司)方法将重组质粒pcdna3.1-vegfr2-hfc转染293f细胞(购自invitrogen公司)。5.vegfr2-hfc蛋白的sds-page电泳检测将重组质粒pcdna3.1-vegfr2-hfc转染293f细胞7天后，将培养液通过高速离心、微孔滤膜抽真空过滤以及mabselectsure柱进行纯化得到vegfr2-hfc融合蛋白样品，并取部分样品加入还原型蛋白电泳上样缓冲液，进行sds-page电泳检测。制得了融合蛋白vegfr2-hfc。制备例4：抗vegfa的抗体bevacizumab的制备上市的vegfa单抗avastin(bevacizumab)的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列参照中国专利公开cn1259962a。编码重链可变区和轻链可变区的核酸序列委托金斯瑞公司合成。bevacizumab重链可变区的氨基酸序列：(123aa)evqlvesggglvqpggslrlscaasgytftnygmnwvrqapgkglewvgwintytgeptyaadfkrrftfsldtskstaylqmnslraedtavyycakyphyygsshwyfdvwgqgtlvtvss(seqidno:5)编码bevacizumab重链可变区的核酸序列：(369bp)gaggtgcagctggtcgagtccgggggggggctggtgcagccaggcgggtctctgaggctgagttgcgccgcttcagggtacaccttcacaaactatggaatgaattgggtgcgccaggcaccaggaaagggactggagtgggtcggctggatcaacacttacaccggggaacctacctatgcagccgactttaagcggcggttcaccttcagcctggatacaagcaaatccactgcctacctgcagatgaacagcctgcgagctgaggacaccgcagtctactattgtgctaaatatccccactactatgggagcagccattggtattttgacgtgtgggggcaggggactctggtgacagtgagcagc(seqidno:6)bevacizumab轻链可变区的氨基酸序列：(107aa)diqmtqspsslsasvgdrvtitcsasqdisnylnwyqqkpgkapkvliyftsslhsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqystvpwtfgqgtkveik(seqidno:7)编码bevacizumab轻链可变区的核酸序列：(321bp)gatattcagatgactcagagcccctcctccctgtccgcctctgtgggcgacagggtcaccatcacatgcagtgcttcacaggatatttccaactacctgaattggtatcagcagaagccaggaaaagcacccaaggtgctgatctacttcactagctccctgcactcaggagtgccaagccggttcagcggatccggatctggaaccgactttactctgaccatttctagtctgcagcctgaggatttcgctacatactattgccagcagtattctaccgtgccatggacatttggccaggggactaaagtcgagatcaag(seqidno:8)重链恒定区均采用iggamma-1chaincregion，accession:p01857；轻链恒定区均采用igkappachaincregion，accession:p01834。将bevacizumab的重链cdna和轻链的cdna分别克隆到pcdna3.1载体中，获得抗体bevacizumab的重组表达质粒。将重组质粒转染293f细胞。将293f细胞培养液纯化后进行检测。制得了抗vegfa单抗avastin(bevacizumab)。制备例5：抗pd-1的人源化抗体14c12h1l1的制备和检测完全参照中国专利公开cn106977602a中实施例3－4的记载进行。人源化抗体14c12h1l1的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列以及其编码核酸序列也与中国专利公开cn106977602a中实施例3－4所记载的相同，在此亦提供如下：人源化抗体14c12h1l1重链可变区的氨基酸序列：(118aa)evqlvesggglvqpggslrlscaasgfafssydmswvrqapgkgldwvatisgggrytyypdsvkgrftisrdnsknnlylqmnslraedtalyycanrygeawfaywgqgtlvtvss(seqidno:9)编码人源化抗体14c12h1l1重链可变区的核酸序列：(354bp)gaagtgcagctggtcgagtctgggggagggctggtgcagcccggcgggtcactgcgactgagctgcgcagcttccggattcgcctttagctcctacgacatgtcctgggtgcgacaggcaccaggaaagggactggattgggtcgctactatctcaggaggcgggagatacacctactatcctgacagcgtcaagggccggttcacaatctctagagataacagtaagaacaatctgtatctgcagatgaacagcctgagggctgaggacaccgcactgtactattgtgccaaccgctacggggaagcatggtttgcctattgggggcagggaaccctggtgacagtctctagt(seqidno:10)人源化抗体14c12h1l1轻链可变区的氨基酸序列：(107aa)diqmtqspssmsasvgdrvtftcrasqdintylswfqqkpgkspktliyranrlvsgvpsrfsgsgsgqdytltisslqpedmatyyclqydefpltfgagtklelk(seqidno:11)编码人源化抗体14c12h1l1轻链可变区的核酸序列：(321bp)gacattcagatgactcagagcccctcctccatgtccgcctctgtgggcgacagggtcaccttcacatgccgcgctagtcaggatatcaacacctacctgagctggtttcagcagaagccagggaaaagccccaagacactgatctaccgggctaatagactggtgtctggagtcccaagtcggttcagtggctcagggagcggacaggactacactctgaccatcagctccctgcagcctgaggacatggcaacctactattgcctgcagtatgatgagttcccactgacctttggcgccgggacaaaactggagctgaag(seqidno:12)制得了抗pd-1的人源化抗体14c12h1l1。制备例6：人抗鸡蛋溶酶体抗体(humananti-henegglysozymeigg，anti-hel，即humanigg，简称higg)，其序列来自于acierno等人发表的affinitymaturationincreasesthestabilityandplasticityofthefvdomainofanti-proteinantibodies研究中fabf10.6.6序列的可变区序列(acierno等人.jmolbiol.2007；374(1):130-46.)。制备方法如下：humanigg委托南京金斯瑞生物对抗体的重轻链(全序列或可变区)基因进行氨基酸的密码子优化和基因合成，参照《分子克隆实验指南(第三版)》介绍的标准技术，采用pcr、酶切、dna胶回收、连接转化、菌落pcr或酶切鉴定等标准的分子克隆技术将重轻链基因分别亚克隆到哺乳动物表达系统的抗体重链表达载体和抗体轻链表达载体，并进一步对重组表达载体的重轻链基因进行测序分析。测序验证正确后，中大量制备去内毒素级别的表达质粒并将重轻链表达质粒瞬时共转染hek293细胞进行重组抗体的表达。培养7天后收集细胞培养液，进行rproteina柱(ge)亲和纯化，收获的抗体样品用sds-page和sec-hplc标准分析技术对其进行质量鉴定。制得了higg。用于下面的实施例7－8。实施例1：双功能抗体vp101的重链和轻链的序列设计、制备和检测1.序列设计本发明中的双功能抗体vp101的结构模式属于morrison模式(igg-scfv)，即在一个igg抗体的两条重链的c端均连接另一个抗体的scfv片段，其重链和轻链的主要组成设计如下面的表1。表1：vp101的重链和轻链的组成设计上面的表1中:(1)右下角标注“v”的，是指相应重链的可变区或者相应轻链的可变区。没有标注“v”的，相应重链或者轻链为包含恒定区的全长。这些可变区或者全长的氨基酸序列及其编码核酸序列均参照上面的制备例中记载的相应序列。(2)linker1的氨基酸序列为ggggsggggsggggsggggs(seqidno:13)2.抗体vp101的表达和纯化分别将vp101的重链cdna序列和轻链的cdna序列克隆到puc57simple(金斯瑞公司提供)载体中，分别获得puc57simple-vp101h和puc57simple-vp101l质粒。分别将质粒puc57simple-vp101h和puc57simple-vp101l进行酶切(hindiii&ecori)，电泳回收得到的重链轻链分别亚克隆到pcdna3.1载体中，提取重组质粒共转染293f细胞。细胞培养7天后，将培养液通过高速离心、上清浓缩后上样至hitrapmabselectsure柱，用elutionbuffer一步洗脱蛋白并回收目标样品抗体vp101，并换液至pbs。2.抗体vp101的检测将纯化后的样品分别加入还原型蛋白电泳上样缓冲液和非还原型蛋白电泳上样缓冲液，煮沸后进行sds-page电泳检测。vp101的电泳图如图1所示，还原型蛋白样品目标蛋白在75kd和25kd处，非还原型蛋白样品(单个抗体)目标蛋白在200kd处。以下的实验中用到的人源化抗体vp101，如果没有特别说明，均为参照本实施例的方法制得。实施例2：人源化抗体vp101的动力学参数测定1.人源化抗体vp101与pd-1-hfc结合的动力学参数测定采用biacore分子相互作用仪分子相互作用仪检测抗体与人pd-1的亲和力常数。以hbs-ep作为缓冲液，采用bicaore标准氨基偶联方式将人pd-1-hfc固定于cm5芯片表面，固定的信号值为78.3ru。抗体与人pd-1结合，抗体浓度为1.56-50nm(两倍稀释)，流速为30μl/min，结合的时间为180s，解离时间为420s。芯片使用10mm甘氨酸，ph1.7再生，流速为30μl/min，时间为120s。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。使用biacorecontrol2.0软件进行数据采集，biacoret200evaluation2.0软件进行数据分析。抗体vp101、14c12h1l1和对照抗体nivolumab(购自百时美-施贵宝公司，商品名opdivo)与pd-1-hfc结合的动力学参数见表2，动力学特征参数检测结果分别如图2、图3和图4所示。表2：人源化抗体vp101、14c12h1l1和对照抗体nivolumab与pd-1-hfc结合的动力学参数抗体名称kd(m)kon(1/ms)kon误差kdis(1/s)kdis误差rmax(nm)14c12h1l15.88e-101.62e+053.70e+029.51e-054.93e-0732.52-46.80vp1019.93e-109.44e+047.55e+029.37e-051.07e-0611.44-21.91nivolumab5.56e-104.62e+057.69e+022.57e-047.24e-0737.13-42.50kd为亲和力常数；kon为抗原抗体结合速率；kdis为抗原抗体解离速率；kd＝kdis/kon。结果表明，抗体vp101与抗原有较好的亲和力。2.人源化抗体vp101与vegfa结合的动力学参数测定使用fortebio分子相互作用仪测定人源化抗体vp101与抗原vegfa结合的动力学参数。使用edc/nhs激活ar2g传感器，采用氨基偶联的方式把vegfa-his固定到激活的ar2g传感器上，使用1m乙醇胺，ph8.5封闭传感器。传感器在pbst中平衡后，固定在传感器上的抗原与抗体结合，抗体浓度为3.13-100nm(两倍梯度稀释)，结合时间为300s，抗原抗体在pbst中解离，时间600s。抗体vp101和对照抗体bevacizumab与vegfa结合的动力学参数见表3，动力学特征参数检测结果分别如图5和图6所示。表3：抗体vp101和对照抗体bevacizumab与vegfa结合的动力学参数抗体名称kd(m)kon(1/ms)kon误差kdis(1/s)kdis误差rmax(nm)vp1013.30e-101.54e+051.14e+045.07e-055.26e-050.2883-0.5679bevacizumab6.64e-107.58e+044.31e+035.03e-054.66e-050.2194-0.5711结果表明，抗体vp101与抗原均有较好的亲和力，且亲和力优于对照抗体bevacizumab。实施例3：elisa方法检测抗体vp101与抗原的结合活性1.间接elisa方法测定抗体vp101与抗原vegfa-his的结合活性方法具体如下：用vegfa-his包被酶标板，37℃孵育2小时。洗板后，1％bsa封闭2小时。洗板后加入梯度稀释的抗体，37℃孵育30分钟。洗板后加入酶标记的羊抗人igg二抗工作液，37℃孵育30分钟。洗板后加入tmb显色液避光显色5min，加入终止液终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的od数值。用softmaxpro6.2.1软件对数据进行分析处理。检测抗体vp101与抗原vegfa-his结合的结果如图7所示。各剂量的荧光强度见表4。以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行曲线拟合，计算抗体的结合ec50，结果如下表4所示。表4：双功能抗体分别与vegfa-his的结合(间接elisa)结果显示，抗体vp101能有效地结合vegfa蛋白，并且其结合效率呈剂量依赖关系，这两者与人vegfa的结合活性相当。2.间接elisa方法分别测定抗体vp101与抗原pd-1的结合活性方法具体如下：以人pd-1-mfc包被酶标板，4℃过夜，用1％的bsa于37℃封闭2h后，分别加入抗体，37℃孵育30min，洗板拍干，加入hrp标记羊抗人igg(h+l)二抗(jackson，109-035-088)，37℃孵育30min。洗板拍干，加入tmb(neogen，308177)进行显色反应5min，加入终止液终止显色。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的od数值。用softmaxpro6.2.1软件对数据进行分析处理。检测抗体vp101与抗原pd-1结合结果如图8所示。各剂量的荧光强度见表5。通过对结合的抗体vp101进行荧光定量分析，曲线模拟抗体的结合效率ec50，如下表5所示。表5：双功能抗体与pd-1的结合(间接elisa)结果显示，抗体vp101能有效地结合pd-1蛋白，并且其结合效率呈剂量依赖关系。3.竞争elisa方法分别测定抗体vp101与vegfr2竞争结合抗原vegfa的活性具体方法如下：用vegf-his包被酶标板，37℃孵育2小时。洗板后，1％bsa于37℃封闭1小时。洗板后加入梯度稀释的抗体和人vegfr2ecd-mfc-bio(终浓度为0.02μg/ml)，室温孵育2小时。洗板后加入hrp标记链霉亲和素sa-hrp(1:4000)工作液，37℃孵育30分钟。洗板后加入tmb显色液避光显色5min，加入终止液终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的od数值。用softmaxpro6.2.1软件对数据进行分析处理。检测结果如图9所示。各剂量的吸光强度见表6。通过对结合的抗体vp101进行吸光强度定量分析，曲线模拟抗体的结合效率获得结合ec50(表6)。表6：竞争elisa检测抗体与vegfr2-mfc竞争结合抗原vegfa-his结果显示，抗体vp101能有效地结合抗原vegfa，抑制vegfr2结合vegfa，并且抗体抑制vegfr2结合vegfa的效率呈剂量依赖关系。4.竞争elisa方法分别测定抗体vp101与pd-l1的竞争结合抗原pd-1具体方法如下：用pd-1-hfc包被酶标板，4℃过夜，1％bsa封闭2h后，分别将不同浓度的抗体与pd-l1-hfc混合10min(稀释浓度见表6)，37℃孵育30min后，洗板拍干。加入酶标二抗，37℃孵育30min。洗板拍干，加入tmb进行显色反应5min，加入终止液终止显色。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的od数值(见表6)。用softmaxpro6.2.1软件对数据进行分析处理。检测结果如图10所示。各剂量的吸光强度见表7。通过对结合的抗体vp101和进行吸光强度定量分析，曲线模拟抗体的结合效率获得结合ec50(表7)。表7：竞争elisa检测双功能抗体与pd-l1的竞争结合pd-1结果显示，抗体vp101能有效地结合抗原pd-1，抑制pd-1结合其配体pd-l1，并且抗体抑制pd-1结合其配体pd-l1的效率呈剂量依赖关系。实施例4：抗体vp101对细胞膜表面抗原的结合首先构建表达pd-1抗原的293t，然后采用流式细胞术分析验证抗体对细胞膜表面抗原的特异性结合能力。1.构建表达pd-1抗原的293t细胞pd-1的载体plenti6.3-pd-1(载体plenti6.3购自invitrogen公司)转染293t细胞，经筛选分别获得稳定表达pd-1的克隆群体293t-pd-1细胞。2.检测抗体对细胞表面抗原的结合采用常规胰酶消化方法上述步骤获得的表达抗原的293t-pd-1，并使每个收集管内细胞数为2×105，用pbsa(1％bsa)配制抗体浓度梯度稀释液，冰上与293t-pd-1细胞孵育2小时，每管加入100μlfitc羊抗人igg(1：500)冰上孵育1小时，用pbs洗涤，加入300μlpbsa重悬细胞，在流式细胞仪上用fitc通道检测荧光信号(mfi)。结果如图11所示，各浓度的mfi值见表8。通过对结合的14c12h1l1抗体进行荧光定量分析和曲线拟合，计算出vp101抗体的结合ec50为3.5nm。表8：facs检测vp101结合293t-pd-1表面抗原的荧光强度分析抗体(nm)0.140.411.233.7011.1133.33100ec50r2bevacizumab3.22.22.02.32.73.85.7-3.2nivolumab33.374.9171.9357.9481.9498.3478.42.133.314c12h1l148.199.7201.5409.0600.2655.4670.82.948.1vp10130.861.8135.7286.9487.7534.0528.63.530.8结果显示，vp101抗体能有效地结合293t-pd-1宿主细胞表面的pd-1抗原，其结合效率呈剂量依赖关系，bevacizumab对293t-pd-1无结合活性，表明vp101对293t-pd-1的结合是特异性的。实施例5：抗体vp101对细胞膜表面抗原的竞争性结合采用竞争流式细胞法测定vp101与pd-l1竞争结合细胞膜表面抗原pd-1的ec50，方法具体如下：取293t-pd-1细胞常规消化，每个样本30万细胞，离心洗涤；加入相应梯度稀释的抗体，每管100μl，冰上孵育30min；每管加入100μlpd-l1-mfc，混匀，使得最终浓度为20nm，冰上孵育1小时；加入500μl1％pbsa，5600rpm离心5min，去上清；每管加入100μl1:500稀释的fitcgoatantimouse抗体，混匀后冰上避光孵育40min；离心洗涤重悬，转移至流式上样管，上机测试。结果如图12所示，各浓度的mfi值见表9。通过荧光定量分析和曲线拟合，计算出抗体vp101、14c12h1l1的竞争结合ec50分别为8.33nm、4.37nm。表9：facs检测14c12h1l1、vp101竞争结合293t-pd-1表面抗原的荧光强度分析结果显示，vp101抗体能有效地阻断pdl-1对293t-pd-1宿主细胞表面的pd-1的结合，且呈剂量依赖关系。实施例6：vp101抗体抑制vegfa诱导的huvec细胞增殖的实验取生长状态良好的huvec细胞(购自americantypeculturecollection，atcc)，调整细胞浓度为1.5×104/ml，接种于96孔板，200μl/孔，于37℃、5％co2孵箱中培养24h后，观察细胞贴壁良好，弃培养基，用2％fbs的1640配制20nmvegfa加入96孔板中，200μl/well；加入不同浓度的抗体，继续培养72h，72h后弃培养基，加mtt，4h后弃mtt加dmso，放入酶标仪测定490nm处的od值。结果如图13所示。结果显示，人源化抗体vp101、bevacizumab均可有效抑制vegfa引起的huvec细胞增殖，且呈剂量依赖关系；并且在相同的剂量下，vp101的抑制vegfa引起的huvec细胞增殖的药理学活性高于bevacizumab。实施例7：在混合淋巴细胞反应促进细胞因子ifn-γ和il-2的分泌1.vp101、14c12h1l1、nivolumab在dc与pbmc混合培养体系中促进il-2及ifn-γ的分泌采用ficoll-paqueplus(gehealthcare)分离pbmc，将分离出来的pbmc加入il-4(peprotechk2513，1000u/ml)和gm-csf(peprotechh1513，1000u/ml)诱导6天后，额外加入tnf-α(peprotechg1513，200u/ml)诱导3天获得成熟dc细胞。共培养当天，采集另一供者外周血分离新鲜pbmc，将获得的成熟dc细胞与另一供者新鲜分离的pbmc按1:10的比例进行混合培养，同时加入不同浓度的抗体(higg做为对照)，共培养5－6天后，收集细胞上清，用elisa试剂盒检测ifn-γ(购自达科为公司)的含量。vp101在dc细胞和pbmc混合培养体系中对ifn-γ的分泌影响如图14所示。由图14可见，vp101可有效促进ifn-γ的分泌，且呈剂量依赖关系。并且在30nm和300nm的剂量上，vp101促进ifn-γ分泌的活性高于等剂量14c12h1l1，在30nm剂量水平中促进ifn-γ分泌的活性高于等剂量nivolumab。2.vp101、14c12h1l1、nivolumab在pbmc、raji-pd-l1混合培养体系促进il-2及ifn-γ的分泌通过慢病毒感染将pd-l1稳转raji细胞，加药筛选获得稳定表达pd-l1的raji-pd-l1细胞；pbmc使用seb刺激两天后与丝裂霉素c处理的raji-pd-l1混合培养。结果如图15、图16所示。结果显示，vp101能有效促进il-2和ifn-γ的分泌，在300nm的剂量水平下，vp101促进il-2分泌的活性显著优于等剂量14c12h1l1和nivolumab。其中，研究的同型对照抗体为人抗鸡蛋溶酶体(humananti-henegglysozymeigg，anti-hel，即humanigg，简称higg)，按照前面的制备例6制得。实施例8：vp101体内抑制肿瘤生长实验为检测vp101的体内抑瘤活性，首先用u87mg细胞(人胶质瘤细胞，购自atcc)，接种于到5－7周龄的雌性scidbeige小鼠(购买自维通利华)皮下，造模与具体给药方式见表10。给药后测量各组肿瘤的长宽，计算肿瘤体积。表10：vp101治疗u87mg移植瘤scidbeige小鼠模型的给药方案结果图17所示。结果表明：相比同型对照抗体higg(制备方法同前述制备例6)，bevacizumab，不同剂量vp101均能有效抑制小鼠肿瘤的生长，且高剂量vp101对肿瘤的抑制优于低剂量vp101。此外，如图18所示，vp101对荷瘤小鼠体重无影响。尽管本发明的内容就其公开的具体实施方式作出了完整而清晰的描述，但其不仅限于此。对于所属
技术领域：
的人员来说，通过这些表述的指导而对本发明作出修改和替代是有可能发生的，这些改进和替代包含在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。sequencelisting<110>中山康方生物医药有限公司<120>抗pd-1-抗vegfa的双功能抗体、其药物组合物及其用途<130>idc180012<160>26<170>patentinversion3.2<210>1<211>171<212>prt<213>artificial<220><223>vegfa-his的氨基酸序列<400>1alaprometalagluglyglyglyglnasnhishisgluvalvallys151015phemetaspvaltyrglnargsertyrcyshisproilegluthrleu202530valaspilepheglnglutyrproaspgluileglutyrilephelys354045prosercysvalproleumetargcysglyglycyscysasnaspglu505560glyleuglucysvalprothrglugluserasnilethrmetglnile65707580metargilelysprohisglnglyglnhisileglyglumetserphe859095leuglnhisasnlyscysglucysargprolyslysaspargalaarg100105110glngluasnprocysglyprocyssergluargarglyshisleuphe115120125valglnaspproglnthrcyslyscyssercyslysasnthraspser130135140argcyslysalaargglnleugluleuasngluargthrcysargcys145150155160asplysproargarghishishishishishis165170<210>2<211>513<212>dna<213>artificial<220><223>编码vegfa-his的核酸序列<400>2gcacccatggccgagggcggcggccagaaccaccacgaggtggtgaagttcatggacgtg60taccagagaagctactgccaccccatcgagaccctggtggacatcttccaggagtacccc120gacgagatcgagtacatcttcaagcccagctgcgtgcccctgatgagatgcggcggctgc180tgcaacgacgagggcctggagtgcgtgcccaccgaggagagcaacatcaccatgcagatc240atgagaatcaagccccaccagggccagcacatcggcgagatgagcttcctgcagcacaac300aagtgcgagtgcagacccaagaaggacagagccagacaggagaacccctgcggcccctgc360agcgagagaagaaagcacctgttcgtgcaggacccccagacctgcaagtgcagctgcaag420aacaccgacagcagatgcaaggccagacagctggagctgaacgagagaacctgcagatgc480gacaagcccagaagacatcatcaccatcaccac513<210>3<211>998<212>prt<213>artificial<220><223>融合蛋白vegfr2-hfc的氨基酸序列<400>3metglnserlysvalleuleualavalalaleutrpleucysvalglu151015thrargalaalaservalglyleuproservalserleuaspleupro202530argleuserileglnlysaspileleuthrilelysalaasnthrthr354045leuglnilethrcysargglyglnargaspleuasptrpleutrppro505560asnasnglnserglysergluglnargvalgluvalthrglucysser65707580aspglyleuphecyslysthrleuthrileprolysvalileglyasn859095aspthrglyalatyrlyscysphetyrarggluthraspleualaser100105110valiletyrvaltyrvalglnasptyrargserpropheilealaser115120125valseraspglnhisglyvalvaltyrilethrgluasnlysasnlys130135140thrvalvalileprocysleuglyserileserasnleuasnvalser145150155160leucysalaargtyrproglulysargphevalproaspglyasnarg165170175ilesertrpaspserlyslysglyphethrileprosertyrmetile180185190sertyralaglymetvalphecysglualalysileasnaspgluser195200205tyrglnserilemettyrilevalvalvalvalglytyrargiletyr210215220aspvalvalleuserproserhisglyilegluleuservalglyglu225230235240lysleuvalleuasncysthralaargthrgluleuasnvalglyile245250255asppheasntrpglutyrproserserlyshisglnhislyslysleu260265270valasnargaspleulysthrglnserglyserglumetlyslysphe275280285leuserthrleuthrileaspglyvalthrargseraspglnglyleu290295300tyrthrcysalaalaserserglyleumetthrlyslysasnserthr305310315320phevalargvalhisglulysprophevalalapheglyserglymet325330335gluserleuvalglualathrvalglygluargvalargileproala340345350lystyrleuglytyrproproprogluilelystrptyrlysasngly355360365ileproleugluserasnhisthrilelysalaglyhisvalleuthr370375380ilemetgluvalsergluargaspthrglyasntyrthrvalileleu385390395400thrasnproileserlysglulysglnserhisvalvalserleuval405410415valtyrvalproproglnileglyglulysserleuileserproval420425430aspsertyrglntyrglythrthrglnthrleuthrcysthrvaltyr435440445alaileproproprohishisilehistrptyrtrpglnleugluglu450455460glucysalaasngluproserglnalavalservalthrasnprotyr465470475480procysgluglutrpargservalgluasppheglnglyglyasnlys485490495ilegluvalasnlysasnglnphealaleuilegluglylysasnlys500505510thrvalserthrleuvalileglnalaalaasnvalseralaleutyr515520525lyscysglualavalasnlysvalglyargglygluargvalileser530535540phehisvalthrargglyprogluilethrleuglnproaspmetgln545550555560prothrgluglngluservalserleutrpcysthralaaspargser565570575thrphegluasnleuthrtrptyrlysleuglyproglnproleupro580585590ilehisvalglygluleuprothrprovalcyslysasnleuaspthr595600605leutrplysleuasnalathrmetpheserasnserthrasnaspile610615620leuilemetgluleulysasnalaserleuglnaspglnglyasptyr625630635640valcysleualaglnasparglysthrlyslysarghiscysvalval645650655argglnleuthrvalleugluargvalalaprothrilethrglyasn660665670leugluasnglnthrthrserileglygluserilegluvalsercys675680685thralaserglyasnproproproglnilemettrpphelysaspasn690695700gluthrleuvalgluaspserglyilevalleulysaspglyasnarg705710715720asnleuthrileargargvalarglysgluaspgluglyleutyrthr725730735cysglnalacysservalleuglycysalalysvalglualaphephe740745750ileilegluglyalaglnglulysthrasnleugluserarggluasn755760765leutyrpheglnglythrhisthrcysproprocysproalaproglu770775780leuleuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysasp785790795800thrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalasp805810815valserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspgly820825830valgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasn835840845serthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrp850855860leuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleupro865870875880alaproileglulysthrileserlysalalysglyglnproargglu885890895proglnvaltyrthrleuproproserargaspgluleuthrlysasn900905910glnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspile915920925alavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthr930935940thrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserlys945950955960leuthrvalasplysserargtrpgln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