一种抗D-二聚体单克隆抗体及其制备方法与流程

本发明涉及一种抗d-二聚体单克隆抗体及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

d-二聚体是交联纤维蛋白经纤溶酶作用后的终末产物。在凝血过程中，凝血酶在水解纤维蛋白原后，即相继释放出纤维蛋白肽a(fpa)和肽b(fpb)，剰余部分为可溶性纤维蛋白単体(sfm)，在转行酰胺酶作用下，sfm转变为纤维蛋白，继而血液凝固，其过程是经过一系列交联反应后完成，此后形成的纤维蛋白性质稳定，一般不溶解，但可被纤溶酶所降解，交联纤维蛋白在纤溶酶降解过程中逐渐生成若干种多聚体，d-二聚体即是其特异的产物之一，其分子量为184000～202000da。在病理状态下，凝血与纤溶的动态平衡遭到破坏，凝血倾向增强，从而纤维蛋白降解产物增加，导致d-二聚体含量増加。d-二聚体水平的增高，表明体内有纤维蛋白血栓形成和纤溶发生，所以临床上可作为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物。

d-二聚体的检测对多种疾病的诊断及治疗有重要的价值。尤其可在无症状的高危患者中对深静脉血栓进行早期筛选；与肺泡-动脉氧分压差联合检测可作为排除诊断肺栓塞的首选筛选试验。此外还可辅助诊断肝脏疾病；对脑梗死进行诊断及预后判断；鉴别恶性肿瘤。其他能够引起d-二聚体升高的因素还有：创伤性的骨折、严重感染、稳定性冠心病、重症感染、儿童过敏性紫癜急性期、脓毒血症、结节病等。

常用的d-二聚体检测方法主要有：elisa法、胶乳凝集法和发色底物法。这检测方法都需要选用具有高度特异性和高亲和力的抗d-二聚体单克隆抗体为载体。抗d-二聚体单克隆抗体的品质直接影响试剂盒检验结果的准确性和可靠性。因此开发和制备特异性强、亲和力高的抗d-二聚体单克隆抗体是开发各类高品质d-二聚体检测试剂盒的核心所在。

目前，抗d-二聚体的制备方法通常是采用杂交瘤细胞表达或者通过抽取动物的腹水经过提取后获得，这种制备方法不仅生产工艺复杂而且成本高，且批次之间的稳定性较差，不利于抗d-二聚体抗体的产业化生产。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高度特异性的抗d-二聚体单克隆抗体及其制备方法，为检测试剂盒的制作提供可靠的基础。

本发明首先提供了一种抗d-二聚体单克隆抗体，其轻链氨基酸序列如seqidno.5所示，其重链氨基酸序列如seqidno.6所示。

本发明还提供了表达所述抗d-二聚体单克隆抗体的重组cho细胞株，是以pcho1.0为表达载体，在中华仓鼠卵巢细胞中表达所述抗d-二聚体单克隆抗体。

本发明还提供了培养所述重组cho细胞株制备抗d-二聚体单克隆抗体的方法，是将种子细胞按(1.0±0.4)×10⁶个/ml的接种密度用dynamis(gibco)培养基稀释至3l细胞培养反应器中，初始培养体积为1l，设置搅拌转速为250～280r/min，ph设置为6.95±0.15，通过碳酸氢钠溶液和co2调节ph；溶解氧设置为40±20％；1～4天培养温度设置为36.5±0.5℃；培养第5天降温至33.5±0.5℃；培养第14天收获；第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补料培养基为feedcplus，补料体积为初始培养体积的4％。

进一步地，所述方法是用dynamis(gibco)培养基将重组cho细胞按0.6×10⁶个/ml的接种密度稀释至3l细胞培养反应器中，初始培养体积为1l；设置搅拌转速为250r/min；ph设置为7.00，deadband设置为0.10，通过碳酸氢钠溶液和co2调节ph；溶解氧设置为40％，1～4天培养温度设置为36.5℃；培养第5天降温至33.0℃；培养第14天收获；第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补料培养基为feedcplus(gibco)，补料体积为初始培养体积的4％。

进一步地，培养结束后，对培养上清首先进行深层过滤(采用millipore的d0hc和x0hc)去除细胞，澄清收获液采用gemabselectedsure填料进行亲和纯化。

本发明提供了一种抗d-二聚体单克隆抗体的筛选和优化方法，本发明首先通过杂交瘤细胞制备出抗d-二聚体单克隆抗体，再对所得抗体的序列进行优化，在亲和力保持不变的前提下，抗d-二聚体单克隆抗体的产量提高了54％，极大的降低了生产的成本。本发明方法与现有的杂交瘤细胞培养及小鼠腹水提取方法相比，不仅大幅提高了表达量、降低了生产成本，还能够有效的控制了产品批次之间的稳定性。

附图说明

图1为杂交瘤细胞培养过程中的生长曲线

图2为杂交瘤细胞培养过程中的细胞活率曲线

图3为杂交瘤细胞培养过程中的蛋白表达曲线

图4为序列优化前和优化后的cho细胞培养过程中的细胞生长曲线

图5为序列优化前和优化后的cho细胞培养过程中的细胞活率曲线

图6为序列优化前和优化后的cho细胞培养过程中的蛋白表达曲线

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。

细胞密度和活率的检测方法：细胞密度的检测采用台盼蓝染色法，细胞液与台盼蓝溶液1：1混合后，经过vi-cell计数仪检测可得到细胞密度和活率。

蛋白表达量的检测：蛋白含量的检测采用proteina-hplc的方法，色谱柱为tskgelproteina-5pw(20μm,4.6mm×35mm)；流动相a为：无水磷酸二氢钠2.4g/l，氯化钠8.7g/l，ph7.0；流动相b为：无水磷酸二氢钠2.4g/l，氯化钠8.7g/l，ph2.7。流速2.5ml/min，检测波长为280nm。

实施例1：抗d-二聚体单克隆抗体的筛选

一、动物免疫

取雌性6周龄的balb/c小鼠，首次免疫用浓度为6mg/ml的d-二聚体纯品，经腹腔和四肢腋下注射，总量1ml；每隔2周以同样的方法加强免疫1次，共免疫3次，末次免疫后的第4天，从经三次免疫后的小鼠的眼球采血，离心分离血清，用elisa法选出效价高的小鼠准备融合。

二、杂交瘤细胞系的制备

取完成免疫过程的小鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0融合，在融合前一天制备饲养细胞；融合时无菌下取小鼠脾细胞，与sp2/0细胞以10:1混合，以50％peg介导融合，离心后重悬于hat选择性培养基中，接种于含有饲养细胞的96孔板中，置37℃，5％co2培养箱培养，融合后第3、5、7天用hat培养液半量换液，培养两周后换用ht培养液。

观察杂交瘤细胞的生长情况，等克隆长至孔底面积的取培养上清液，用elisa法进行抗体检测，筛选阳性克隆。以有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化培养，直到克隆化细胞抗体阳性率为100％，选出高分泌特异性细胞株，此时可将阳性克隆细胞进一步扩大培养。将杂交瘤细胞经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复苏，定期收集上清，用筛选抗体的方法测定上清中的抗体，直至细胞系能稳定分泌单克隆抗体。

三、单克隆抗体的特异性鉴定

材料：纤维蛋白原及其碎片x、y、d、e和血浆。

方法：采用elisa法检测，以d-二聚体为阳性对照。

结果：显示纤维蛋白原及其碎片x、y、d、e和血浆均为阴性。

说明：本发明的抗d-二聚体单克隆抗体对d-二聚体有高度特异性。

四、单克隆抗体的序列的克隆与测序

采用5’race(rapidamplificationofcdnaends，快速扩增cdna末端)技术，从分泌抗d-二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株中克隆功能性抗体的可变区序列。其步骤可简述为：由一个反义的基因特异性引物来合成cdna第一链，cdna第一链纯化后，利用末端脱氧核苷酸转移酶(terminaldeoxynucleotidytransferase，tdt)在cdna的3’末端加上一个合成的同聚核苷酸锚定序列。利用第二个巢式基因特异性引物和一个与同聚核苷酸尾巴可以退火的锚定引物来扩增cdna。

根据碱基序列与氨基酸编码序列的相应关系，分析pcr产物的阅读框架，确定相应可变区的氨基酸序列，其轻链和重链可变区的序列分别如seqidno.1和seqidno.2所示。完整的抗体轻链和重链如seqidno.3和seqidno.4所示。

实施例2：抗d-二聚体单克隆抗体杂交瘤表达

用cdhybridoma(gibco)培养基将杂交瘤细胞按0.6×10⁶cells/ml的接种密度稀释至3l细胞培养反应器中，初始培养体积为1l；设置搅拌转速为200r/min；ph设置为7.00，deadband设置为0.10，关联碳酸氢钠溶液和co2进行ph调节；溶解氧设置为40％(饱和空气的溶解氧为100％)，培养温度设置为36.5℃。第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补料培养基feedbplus(gibco)的补料体积为初始培养体积的3％。

最大细胞密度达到8×10⁶cells/ml(图1)，培养结束时细胞活率为70％(图2)，最终抗d-二聚体单克隆抗体的表达量达到了406mg/l(图3)。

对培养上清首先进行深层过滤(采用millipore的d0hc和x0hc)去除细胞，澄清收获液采用亲和纯化柱纯化，采用gemabselectedsure填料。采用proteina-hplc方法测定纯化得到的抗体的亲和力，结果如表1所示。

实施例3：抗d-二聚体单克隆抗体序列优化

将抗d-二聚体单克隆抗体的恒定区的序列换成高表达的序列，优化后的完整的单克隆抗体的轻链序列如seqidno.5，重链序列如seqidno.6所示。

实施例4：表达抗d-二聚体单克隆抗体cho细胞的构建

分别构建表达优化前和优化后的抗d-二聚单克隆抗体的重组cho细胞。具体方法如下：

抗体重链和轻链的碱基序列由苏州金唯智生物技术服务有限公司全基因合成，根据dna序列分别设计引物，用聚合酶链式反应扩增抗d-二聚体单抗的轻链和重链。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pcho1.0载体(购自lifetechnologies公司)中，测序验证后确认获得了正确的携带优化前、优化后的抗d-二聚单克隆抗体序列的表达质粒。

通过电转染试剂盒(amaxatmcelllinenucleofectortmkitv)和单孔细胞电转染仪(nucleofectortm2b,lonza)分别将携带编码优化前、优化后的抗d-二聚单克隆抗体的表达质粒分别转入cho-s宿主细胞中。具体地，取质粒、细胞和电转液三者混悬液100μl于电转杯中，进行电转染。之后转移至含有30mlforticho(gibco)培养基的t75方瓶中，将方瓶置于37℃，8％co2培养箱中静置培养。

将转染48小时后的细胞悬液离心重悬至t75方瓶，t75方瓶中装有培养基，培养基为含有10μg/mlpuro、100nmol/lmtx的forticho培养基。将t75方瓶置于37℃，8％co2的培养箱中静置培养。当细胞活率大于85％，细胞密度大于1×10⁶个/ml时，加压筛选完成。

用forticho培养基将细胞密度稀释至5个/ml用于96孔板铺板，200μl/孔，即按照1个细胞/孔进行铺板。在培养第17天时用fortebio抗体浓度定量法检测上清内的抗体表达量，得到表达抗d-二聚单克隆抗体的重组cho细胞。

实施例5：抗d-二聚体抗体的表达

将实施例4中构建得到的分别表达优化前和优化后的抗d-二聚体抗体的重组cho细胞分别在反应器上进行培养。

具体地，用dynamis(gibco)培养基将cho细胞按0.6×10⁶个/ml的接种密度稀释至3l细胞培养反应器中，初始培养体积为1l；设置搅拌转速为250r/min；ph设置为7.00，deadband设置为0.10，关联碳酸氢钠溶液(nahco390.7g/l)和co2进行调节；溶解氧设置为40％(饱和空气的溶解氧为100％)，前期培养温度设置为36.5℃；培养第5天降温至33.0℃；培养第14天收获。第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补料培养基feedcplus(gibco)的补料体积为初始培养体积的4％。

对培养上清首先进行深层过滤(采用millipore的d0hc和x0hc)去除细胞，澄清收获液采用gemabselectedsure填料进行亲和纯化，得到纯化后的抗d-二聚体抗体。用elisa法测定抗d-二聚体抗体的亲和力。

如图4所示，在细胞培养过程中，分别表达优化前和优化后的抗d-二聚体抗体的重组cho细胞的细胞密度无显著的差异。如图5所示，在细胞培养过程中，分别表达优化前和优化后的抗d-二聚体抗体的重组cho细胞的细胞活力无显著差异。如图6所示，细胞培养结束后，两种重组细胞的抗体的表达量存在较大差异，序列优化后的抗体的表达量达到了2011mg/l，显著高于优化前的1305mg/l。

如下表1所示，cho细胞表达的抗d-二聚体抗体的表达量要明显高于杂交瘤细胞，而cho细胞表达的经过序列优化的抗d-二聚体抗体的表达量达到了2011mg/l，比序列优化前提高了54％，而二者的亲和力没有显著的区别。

表1不同条件下的抗体表达量和亲和力

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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