GrB重组单链抗体的构建及功能验证的方法与流程

本发明属于生物制药、肿瘤医学领域，主要涉及grb重组单链抗体的构建及功能验证的方法。

背景技术

颗粒酶(granzyme，gr)是杀伤性t淋巴细胞和自然杀伤(nk)细胞的颗粒中丝氨酸蛋白酶家族的总称。人的颗粒酶共有a、b、c三种类型，grb最初以酶原的形式合成储存于ctl的颗粒中。ctl识别靶细胞时，grb的n端酸性二肽被切除，成为活性形式。活性型grb可通过穿孔素或受体进入靶细胞，切割含asp-x，gln-x位点的多种结构和功能蛋白，引起细胞凋亡。

本发明以减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009作为治疗载体，综合应用了减毒鼠伤寒沙门氏菌胞内侵袭的特性和特异性聚集在实体瘤中的性质，进一步扩大了本发明中肿瘤杀伤的特异性。

现今，在临床上对于癌症的治疗，提出了抗体药物偶联物(antibodydrugconjugates，adc)的一类新颖的治疗药物，本发明应用这一概念，结合实验前期基础，为adc药物治疗的发展提供了一定的实验数据基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种真核质粒表达过程的减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的质粒转染技术。

本发明第二个目的是成功构建一株重组减毒鼠伤寒沙门氏菌pcdna3.3c-grb-gala-vnp20009，具有特异性杀伤肿瘤细胞的效果。

grb重组单链抗体的构建方法，包括如下步骤：

(1)获取grb-gala片段：以pet302-grb-gala为模板，以seqidno.3和seqidno.4序列为引物，pcr扩增获得seqidno.1所示的grb-gala片段；

(2)构建pcdna3.3c-grb-gala重组质粒：将步骤(1)中获得的grb-gala片段，通过酶切酶连的方法连接到pcdna3.3c其序列为：seqidno.2的质粒中，重组质粒命名为pcdna3.3c-grb-gala；

(3)构建pcdna3.3c-grb-gala重组菌株：将步骤(1)中pcdna3.3c-grb-gala重组质粒转入e.colitop10中，获得重组菌株；

(4)构建pcdna3.3c-grb-gala重组减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009：从步骤(3)中获得的重组菌株中获得重组质粒后，通过电转化的方法置于鼠伤寒沙门氏菌vnp20009中，电转条件：1800v、25uf、200ω、4.7ms，将重组后的鼠伤寒沙门氏菌命名为pcdna3.3c-grb-gala-gala-vnp20009。

所述的方法构建的一株重组减毒鼠伤寒沙门氏菌pcdna3.3c-grb-gala-vnp20009。

所构建抗体功能验证方法包括如下步骤：

(1)将步骤1获得的这种重组减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009，按照细胞与细菌100:1的比例，与b16f10细胞混合培养2小时后，换取含有青链霉素的新鲜培养基继续培养24h。

(2)将步骤(1)中培养的细胞，分别做拍照观察及采用mtt比色法计算该蛋白对细胞的特异性的杀伤作用。

上述步骤采用的是真核质粒转染、表达的技术。

本发明的有益技术效果：

(1)本发明采用减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009介导真核质粒转染细胞，实现真核表达，为后续采用细菌治疗手段提供实验依据；

(2)本发明利用单链抗体的靶向特异性和减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009在实体瘤中特异聚集的性质，结合人源毒素grb的细胞杀伤作用，属于抗体药物偶联物这种新型治疗药物，能更好的实现特异性杀伤细胞效果。

附图说明

图1-grb-galapcr验证结果；其中a：marker-dl2000，b：

pcdna3.3c-grb-gala质粒，c：grb-gala片段；

图2grb蛋白对细胞杀伤能力的显微示意图；

图3grb蛋白对细胞杀伤能力mtt检测结果。pcdna3.3c。

具体实施方式

对本发明将通过以下实施例作进一步的说明。

本发明原始质粒均来源于biovectornctt公司。

本发明中e.colitop10和减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009均购自biovectornctt公司。

所用限制性内切酶均购自neb公司。

所用t4dna连接酶均购自takara公司。

所用dna连接酶均购自takara公司。

lb固体培养基和液体培养基均购自索莱宝公司。

实施例1

以pet302-grb-gala为模板，以seqidno.3和seqidno.4序列为引物，pcr扩增获得seqidno.1所示的grb-gala片段。

实施例2

已获得的grb-gala片段和质粒pcdna3.3c，经agei和bsiwi双酶切，酶切产物纯化后，采用t4连接酶连接到pcdna3.3c(seqidno.2)质粒中，重组质粒命名为pcdna3.3c-grb-gala。见说明书附图1。

实施例3

将-80℃保存的减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009划线接种于无抗性的lb平板，37℃培养过夜；挑取单个菌落于5mllb中，37℃振荡培养12h；按1：100比例接种于100mllb中振荡培养至细菌od＝0.4左右；冰浴20min后，4℃3000rpm离心10min；菌体沉淀用1/10体积预冷的无菌去离子水洗涤两次，4℃3000rpm离心10min；菌体沉淀再次用1/100体积预冷的10％甘油洗涤菌体，4℃3000rpm离心10min；将菌体沉淀重悬于1/100体积预冷的10％甘油中，制成vnp20009感受态分装后-80留存备用。

实施例4

将已获得的重组质粒pcdna3.3c-grb-gala电转进入减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009中，采用0.1cm电转杯，条件设置为：1.8kv、200ω、25uf，电转4.7ms；通过氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，获得重组减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009，命名为pcdna3.3c-grb-gala-vnp2000。

实施例5

将b16f10细胞按照10000/孔，接种于96孔板(采用不含青霉素和链霉素的培养基)，将重组减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009按照b16f10细胞：重组细菌＝100：1的比例接种于96孔板中，总体积200μl，培养2h后，更换为含有青霉素和链霉素的培养基混合培养24h，采用mtt比色法检测这种蛋白对细胞的特异性杀伤作用。

序列表

<110>南昌大学

<120>grb重组单链抗体的构建及功能验证的方法

<130>2018

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>5

<211>726

<212>dna

<213>人工序列(无)

<400>5

atcatcgggggacatgaggccaagccccactcccgcccctacatggcttatcttatgatc60

tgggatcagaagtctctgaagaggtgcggtggcttcctgatacaagacgacttcgtgctg120

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