一种油楠倍半萜合成酶SgSTPS2及其编码基因和应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种油楠倍半萜合成酶sgstps2及其编码基因和应用。

背景技术

油楠(sindoraglabramerr.exdewit)隶属于苏木科油楠属，原生分布于我国海南省，为热带和南亚热带高大乔木，是国家二级重点保护野生植物。油楠最重要的特征是其树干木质部受损后可分泌出树脂油，其可燃性与柴油相似，故又称“柴油树”，在油用、药用、观赏和材用等方面具有较广阔的开发利用前景。

油楠树脂油成分主要包括倍半萜类，约占70％以上，以及二萜类，约14％以上。油楠油亦含活性成分α-紫穗槐烯、荜澄茄油烯、α-蛇麻烯、环苜蓿烯等，进一步，油楠油亦含有挥发性成分大牻牛儿烯、α-香橙烯、δ-杜松醇、α-檀香醇和α-依兰油烯等代表香气的主要成分，在开发精油方面展现了巨大的开发潜力。倍半萜类化合物是天然药物化学中研究较为活跃的领域之一，具有抗肿瘤、抑菌等活性。然而，关于油楠中萜类合成酶的生物合成基因还未被分离和鉴定。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种新的油楠倍半萜合成酶sgstps2及其编码基因和应用。

本发明的第一个目的是提供一种油楠倍半萜合成酶sgstps2，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明的第二个目的是提供所述的油楠倍半萜合成酶sgstps2的编码基因。

优选，所述的编码基因，其核苷酸序列如seqidno.3所示。

优选，所述的编码基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

与所述的油楠倍半萜合成酶sgstps2氨基酸具有50％以上相似性的序列，或与其具有相同功能的保守性变异多肽、活性片段或活性衍生物，例如，将氨基酸序列经过一个或多个取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列也属于本发明的保护范围。与所述的油楠倍半萜合成酶sgstps2的编码基因的核苷酸序列具有50％以上相似性的序列也属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种含有所述的油楠倍半萜合成酶sgstps2的编码基因的重组表达载体。

所述的表达载体，优选为表达载体pet-30a。

本发明还提供一种含有所述的油楠倍半萜合成酶sgstps2的编码基因的基因工程菌。

所述的基因工程菌，优选为大肠杆菌top10或大肠杆菌bl21(de3)。

本发明的第三个目的是提供所述的油楠倍半萜合成酶sgstps2在制备榄香烯(elemeneisomer)、α-可巴烯(α-copaene)、β-榄香烯(β-elemene)、衣兰烯(ylangene)、β-可巴烯(β-copaene)、异大香叶烯d(isogermacrened)、γ-杜松烯(γ-cadinene)、γ-衣兰油烯(γ-muurolene)、大牛儿烯d(germacrened)、双环牛儿烯(bicyclogermacrene)、紫穗槐烯(γ-amorphene)和/或荜澄茄烯(cadina-1(10),4-diene)中的应用。

优选，所述的应用，是以法呢基焦磷酸(fpp)为底物，经油楠倍半萜合成酶sgstps2催化产生榄香烯(elemeneisomer)、α-可巴烯(α-copaene)、β-榄香烯(β-elemene)、衣兰烯(ylangene)、β-可巴烯(β-copaene)、异大香叶烯d(isogermacrened)、γ-杜松烯(γ-cadinene)、γ-衣兰油烯(γ-muurolene)、大牛儿烯d(germacrened)、双环牛儿烯(bicyclogermacrene)、紫穗槐烯(γ-amorphene)和/或荜澄茄烯(cadina-1(10),4-diene)。

本发明的第四个目的是提供所述的油楠倍半萜合成酶sgstps2在制备芳樟醇(linalool)、牻牛儿基甲醚(geranylmethylether)和/或香叶醇(geraniol)中的应用。

优选，所述的应用，是以牻牛儿基焦磷酸(gpp)为底物，经油楠倍半萜合成酶sgstps2催化产生芳樟醇(linalool)、牻牛儿基甲醚(geranylmethylether)和/或香叶醇(geraniol)。

本发明提供了一种新的倍半萜合成酶——油楠倍半萜合成酶sgstps2及其编码基因，该蛋白在原核表达后可生成活性的倍半萜合成酶，催化法呢基焦磷酸(fpp)或牻牛儿基焦磷酸(gpp)生成多种倍半萜类或单萜类化合物，可用于其大量生产。

附图说明

图1是目的基因pcr片段。

图2是目的基因菌落pcr电泳图。

图3是目的蛋白sgstps2的sds-page检测。

图4是sds-page分析目的蛋白sgstps2上清纯化结果。

图5是目的蛋白sgstps2的sds-page和western-blot检测。

图6是gc-ms检测图谱。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

以下实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

实施例1

1、克隆油楠倍半萜合成酶基因sgstps2，构建克隆载体及转化原核细胞

提取油楠茎部组织的rna，采用逆转录酶m-mlv，逆转录反应合成的cdna。以该cdna为模板，正向引物为：5'-atgtcggttgcagctttagc-3'，反向引物为：5'-tcatgcgacaggatttatga-3'，利用takara公司extaqdna聚合酶，进行pcr扩增；pcr条件为：：94℃5min；94℃30s，55℃1min，72℃1min30s，35个循环；72℃延伸10min。pcr产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，图1的m为dnamarkerdl2000，目的基因sgstps2片段大小约为1700bp，符合预期。

采用琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒的方法回收目的基因片段，将目的片段进行ta克隆，连接到载体pmd-18ta克隆载体中，然后将其转化到大肠杆菌top10克隆菌株中，转化条件为：在200μl感受态细胞中加入5μl连接产物，轻轻混匀后冰浴30min；迅速放入42℃水浴中热激90s，立即置于冰上2min；加入800μllb培养基，37℃慢摇培养1h；将菌液6000rpm离心2min，弃600μl上清，悬浮菌体，涂布于含有抗生素(amp)的lb平板上，37℃倒置暗培养12～16h。采用菌落pcr进行阳性克隆筛选，筛选方法为：从转化平板上随机挑取单菌落，置于1.5ml离心管中的液体培养基中培养。将每管进行编号，各管取1μl用作模板进行pcr检测，剩余培养物保存于4℃，检测为阳性的菌落于平板或甘油管保存备用。pcr反应体系为：1μl菌液，正向引物5'-cgccagggttttcccagtcacgac-3'，反向引物5'-agcggataacaatttcacacagga-3'，1xbuffer，0.25mmdntpmixture，0.5μlextaqdna聚合酶，混合后进行pcr扩增。pcr程序为：94℃5min；94℃30s，55℃1min，72℃1min30s，35个循环；72℃延伸10min。菌落pcr结果如图2所示，图2的m为dnamarkerdl2000，4-8号为阳性菌。挑选阳性单克隆菌落，提取质粒后送交测序。经测序分析，克隆得到的倍半萜合成酶基因sgstps2，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其含有1674个碱基，编码的蛋白命名为倍半萜合成酶sgstps2，共557个氨基酸，具体氨基酸序列如seqidno.2所示。并由此得到将倍半萜合成酶基因sgstps2插入到pmd-18克隆载体的重组质粒成功转化至原核细胞大肠杆菌top10的阳性菌，命名为top10-sgstps2。

2、倍半萜合成酶基因sgstps2密码子优化和全基因合成、构建表达载体及转化原核细胞

采用密码子优化软件对sgstps2蛋白氨基酸序列进行优化，优化后其编码基因的碱基序列如seqidno.3所示。采用全基因合成方法合成密码子优化后的倍半萜合成酶基因sgstps2全长序列。通过限制性酶切位点ndei和hindiii对优化的sgstps2基因和质粒pet30a分别进行双酶切，酶切体系为：ndei和hindiii各1μl，基因浓度为0.3μg，质粒浓度为1μg，加入灭菌的双蒸水至30μl，酶切时间为1h。酶切后利用核酸纯化回收试剂盒纯化回收得到经过双酶切的优化的sgstps2基因片段和pet30a载体。将酶切后的优化的sgstps2基因片段连接至酶切后的表达载体pet30a中，连接反应条件为：优化的sgstps2基因和pet30a质粒(摩尔比为3:1)、1x连接buffer，t4dna连接酶，混合后，15℃放置16h完成连接反应，获得重组质粒(优化的sgstps2基因插入到表达载体pet30a后的重组质粒)。然后将其转化到大肠杆菌top10和大肠杆菌bl21(de3)克隆菌株中。挑取抗生素(kan)筛选得到的阳性菌落，提取质粒，通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性，由此得到将优化的倍半萜合成酶基因sgstps2插入到pet30a表达载体的重组质粒成功转化至原核细胞的阳性菌，命名为top10-sgstps2(2)和bl21-sgstps2。将构建好的bl21-sgstps2菌进行大量培养，首先挑取单克隆bl21-sgstps2，接种到4ml的lb培养基中(含50μg/ml的硫酸卡那霉素)，37℃，200rpm，待培养至od600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.1mmiptg，之后分别置于15℃和37℃诱导表达，得到大量表达倍半萜合成酶sgstps2的菌液。

3、油楠倍半萜合成酶sgstps2的原核表达、蛋白纯化和蛋白质检

取诱导后大量表达倍半萜合成酶sgstps2的培养液，12000rpm离心5min，去除上清液，加入pbs液重悬沉淀，最后加入sds-page上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳。电泳前10min时，100v稳压电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后200v稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶用考马斯亮兰染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。结果见图3，图3的m为蛋白marker，lane0为对照，lane1为15℃诱导16h，lane2为37℃诱导16h，箭头所指为目的蛋白sgstps2。

按上述方法，放大培养3l的表达菌，生长至od600＝0.8时，加终浓度0.1mmiptg，15℃诱导16h后收集菌体。全菌采用50mmtris(ph8.0)，300mmnacl，50mmimidazole含1％tritonx-100，1mmdtt，1mmpmsf超声裂解，同时以50mmtris(ph8.0)，300mmnacl，50mmimidazole缓冲液平衡ni-ida亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行sds-page分析检测。分析结果见图4，图4的m为蛋白marker，lane1为全菌破菌离心后上清，lane2为上清同ni-ida孵育后流出液，lane3-4为100mmimidazole的洗脱组分，lane5-11为300mmimidazole的洗脱组分，箭头所指为目的蛋白。

经ni-ida亲和层析纯化，收集纯度浓度较好的lane9-10，并将其透析到1×pbs，10％glycerol，ph7.4透析结束后用0.22μm膜过滤，并分装冻于-80℃。蛋白溶度用bsa做标准品，采用bradford法测定蛋白浓度。油楠倍半萜合成酶sgstps2的蛋白western-blot检测实验操作流程参考《蛋白质电泳实验技术》郭尧君著，结果请见图5，左图中lanem1为sds-page蛋白marker，lane1为bsa蛋白，lane2为sgstps2蛋白；右图中lanem2为western-blotmarker，抗体为anti-his。

4、sgstps2的生化功能

以法呢基焦磷酸(fpp)或牻牛儿基焦磷酸(gpp)为底物，酶促反应体系为：25mmtris-hci(ph7.4)，5mm二硫苏糖醇(dtt)，100mm氯化钾，5mm氯化镁，10％甘油，底物浓度为50μm，加入50μg纯化后的油楠倍半萜合成酶sgstps2蛋白，置于37℃反应1h。反应结束后，用固相微萃取spme纤维pdms100μm顶空萃取挥发物质30min，250℃解吸3min进样。采用gc-ms联用仪(agilentgc-ms7890b-5977a)对催化产物进行检测。气相色谱柱为hp-5ms(30m×0.25mm)，载气高纯he流速为1.0ml/min，升温程序为：50℃保持1min，以5℃/min速度升温至80℃，保持1min，再以10℃/min速度升温至220℃，保持10min，进样口温度为250℃，离子源ei70ev温度为230℃，接口温度为250℃，采集质量范围为30-200amu，数据经nist14质谱谱库检索，并与标准谱图对照，鉴定各组分峰。样品总离子流图见图6，以fpp为底物时，在保留时间为15.26、15.84、16.04、16.47、16.61、16.81、16.94、17.06、17.34、17.51、17.54和17.79处分别出现峰，经nist14数据检索谱库检索比对，结果显示分别对应的化合物为榄香烯(elemeneisomer)、α-可巴烯(α-copaene)、β-榄香烯(β-elemene)、衣兰烯(ylangene)、β-可巴烯(β-copaene)、异大香叶烯d(isogermacrened)、γ-杜松烯(γ-cadinene)、γ-衣兰油烯(γ-muurolene)、大牛儿烯d(germacrened)、双环牛儿烯(bicyclogermacrene)、紫穗槐烯(γ-amorphene)、荜澄茄烯(cadina-1(10),4-diene)，如图6所示。以gpp为底物时，在保留时间为10.98、13.41和13.87处出现峰，经nist14数据检索谱库检索比对，结果显示分别对应的化合物为芳樟醇(linalool)、牻牛儿基甲醚(geranylmethylether)、香叶醇(geraniol)，如图6所示。由此表明油楠倍半萜合成酶sgstps2为多功能酶，可催化fpp合成12种倍半萜类化合物，并可催化gpp合成3种单萜类化合物。

序列表

<110>中国林业科学研究院热带林业研究所

<120>一种油楠倍半萜合成酶sgstps2及其编码基因和应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1674

<212>dna

<213>油楠(sindoraglabramerr．exdewit)

<400>1

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<213>油楠(sindoraglabramerr．exdewit)

<400>2

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530535540

lyslysasnileglualaleuleuileasnprovalala

545550555

<210>3

<211>1674

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atgagcgttgcggcactggcaattccgaccagtaccccgtcttctgatgttccgcgtcgt60

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