α-半乳糖苷酶及其复合酶在半乳甘露聚糖降解中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域中，涉及一种α-半乳糖苷酶及其与β-甘露聚糖酶复配在半乳甘露聚糖降解中的应用。

背景技术

α-半乳糖苷酶(ec3.2.1.23)广泛存在于植物、微生物及动物中，能催化α-半乳糖苷键的水解。可作用于蜜二糖、棉籽糖、水苏糖等低聚糖，还能水解含有α-半乳糖苷键的多聚糖。

β-甘露聚糖酶(ec3.2.1.78)是一种内切糖苷水解酶，其通过随机切割甘露聚糖主链上的糖苷键来将甘露聚糖降解为低聚甘露糖和甘露糖，是最主要的甘露聚糖水解酶。

甘露聚糖是除了木聚糖外，自然界分布最为广泛的一类半纤维素。天然的甘露聚糖可分为：聚甘露糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖四类。其中，聚甘露糖是线状多糖，由甘露糖间形成1,4-β-d-甘露糖糖苷键相连。如果半乳糖存在于聚甘露糖分子中，并通过α-1,6-糖苷键与主链中的甘露糖残基相连，则构成了半乳甘露聚糖。半乳甘露聚糖的完全水解需要依靠内切β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶α-半乳糖苷酶的协同作用。

近年来，甘露寡糖被发现具有保护肠道和提高机体免疫力等作用，被广泛应用于饲料和保健品等行业。α-半乳糖苷酶与β-甘露聚糖酶联合作用可以提高β-甘露聚糖酶对槐豆胶、瓜豆胶等半乳甘露聚糖的降解，增加甘露寡糖的产量，因此在甘露聚糖降解中具有重要的意义。同时不同聚合度的甘露寡糖有可能具有不同的生理功能，因此特定聚合度寡糖的生产在科研中具有重要意义，在医药保健品行业中具有潜在的应用价值。

技术实现要素：

本发明发现了一种具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白质，并将其应用于与β-甘露聚糖酶协同对半乳甘露聚糖的降解。

为实现此目的，本发明提供以下技术方案：

一种α-半乳糖苷酶，氨基酸序列如序列seqidno：1所示。

一种α-半乳糖苷酶，核苷酸序列如序列seqidno：2所示。

一种包所述α-半乳糖苷酶的核苷酸序列的重组载体。

一种重组大肠杆菌，其包含α-半乳糖苷酶的编码基因或者其重组载体。

一种α-半乳糖苷酶的制造方法，包括重组大肠杆菌的培养，α-半乳糖苷酶的生成步骤，以及纯化上述生成的α-半乳糖苷酶的步骤。

一种半乳甘露聚糖降解制剂，包括α-半乳糖苷酶，和氨基酸序列为seqidno：3所示碱性β-甘露聚糖酶。

氨基酸序列如seqidno：1所示的α-半乳糖苷酶和氨基酸序列为seqidno：3所示碱性β-甘露聚糖酶复配酶在半乳甘露聚糖降解、制备甘露二糖、制备甘露三糖中的应用。

本发明克隆了来自嗜碱芽孢杆菌n16-5的α-半乳糖苷酶基因，将其在大肠杆菌中进行异源表达，并将异源表达的α-半乳糖苷酶进行纯化，如图1所示。本发明发现的α-半乳糖苷酶的氨基酸序列如序列1所示，其编码基因的核苷酸序列如序列2所示。纯化获得的α-半乳糖苷酶具有水解半乳甘露聚糖的能力，对槐豆胶和瓜尔豆胶的酶活分别为1.7u/mg和2.0u/mg。

将本发明获得的α-半乳糖苷酶与β-甘露聚糖酶联合作用，可增加β-甘露聚糖酶对半乳甘露聚糖的降解能力，两者对槐豆胶和瓜尔豆胶的协同度分别为1.13和2.21。

将本发明获得的α-半乳糖苷酶与β-甘露聚糖酶联合作用，在反应中显著降低降解产物的聚合度，并提高甘露二糖和甘露三糖的比例，如图2，图3所示。

将本发明获得的α-半乳糖苷酶与β-甘露聚糖酶联合作用，显著提高甘露二糖和甘露三糖的转化率，以槐豆胶为底物甘露二糖和甘露三糖转化生成率分别达到14％和10.8％；以瓜尔豆胶为底物甘露二糖和甘露三糖转化生成率分别达到9.4％和5.3％。

附图说明

图1纯化的α-半乳糖苷酶的电泳图；

图中，m、分子量标准；1、纯化后的α-半乳糖苷酶。

图2为α-半乳糖苷酶与β-甘露聚糖酶联合作用降解槐豆胶底物生成产物的薄层层析分析。

图中m1、半乳糖；m2、从上到下为甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖；1、槐豆胶；2、槐豆胶经过甘露聚糖酶mana酶切的产物；3、槐豆胶经过α-半乳糖苷酶gal27a酶切的产物；4、槐豆胶经过甘露聚糖酶mana和α-半乳糖苷酶gal27a共同酶切的产物。

图3为α-半乳糖苷酶与β-甘露聚糖酶联合作用降解瓜尔豆胶底物生成产物的薄层层析分析。

图中m1、半乳糖；m2、从上到下为甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖；1、瓜尔豆胶；2、瓜尔豆胶经过甘露聚糖酶mana酶切的产物；3、瓜尔豆胶经过α-半乳糖苷酶gal27a酶切的产物；4、瓜尔豆胶经过甘露聚糖酶mana和α-半乳糖苷酶gal27a共同酶切的产物。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。

下述实例中的pet28a质粒、大肠杆菌dh5α、大肠杆菌bl21(de3)均为市售。

下述实例中的lb培养基的溶剂为水，各组分及其浓度分别为：0.5％(质量百分比浓度)酵母提取物，1％(质量百分比浓度)蛋白胨，1％(质量百分比浓度)氯化钠。iptg终浓度为50μg/ml。

实施例1

α-半乳糖苷酶gal27a的制备

1.α-半乳糖苷酶基因gal27a的克隆

根据α-半乳糖苷酶基因gal27a的序列设计上游引物gal27a-f：5’-gcggatccatgactttaaaaccaa-3’和下游引物gal27a-r：5’-ggcgtcgacctactctttattttttgac-3’，以嗜碱芽孢杆菌杆菌n16-5(cgmccno.0369)的基因组为模板，利用pcr技术进行序列扩增，获得目的基因。

2.重组质粒及重组菌的制备

将pet28a质粒的bamhi和sali识别序列间的dna片段替换为序列1所示的基因，得到重组质粒，将该重组质粒命名pet28a-gal27a。

pet28a-gal27a能表达序列1所示的蛋白质，将该蛋白质命名为gal27a，gal27a的表达由t7启动子启动。

将重组质粒pet28a-gal27a转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素的lb平板，筛选得到含有重组质粒的菌株，挑取单克隆培养于含有卡那霉素的液体lb培养基中，收集菌体，提取质粒，双酶切验证，验证后的阳性重组质粒进行测序，测序结果与原序列比对。

比对正确的阳性重组质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)的感受态中，筛选得到阳性克隆，挑取得到单克隆培养于含有卡那霉素的液体培养基中，重组菌保存于甘油中，-80℃保存。

3.α-半乳糖苷酶gal27a的表达和纯化

上述重组菌株从-80℃中取出后，先接种于含有卡那霉素的液体lb培养基中进行活化，经活化后转接至摇瓶，于37℃、220rpm培养至od600达到0.6，加入iptg诱导剂，于30℃、220rpm培养6h，然后离心收集菌体，柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(该缓冲液为由20mm的柠檬酸水溶液和20mm的磷酸氢二钠水溶液制备)清洗三次后，用一定体积的柠檬酸缓冲液吹悬菌体，在冰上进行超声破碎，超声后离心，收集上清。

收集到的上清利用ni柱亲和层析的方法纯化收集液，利用80mm咪唑洗脱杂蛋白，利用500mm咪唑水溶液洗脱目的蛋白。

将纯化的gal27a进行sds-聚丙烯酰胺电泳，如图1所示。

实施例2

α-半乳糖苷酶gal27a的酶活测定

以对硝基酚-α-吡喃半乳糖为底物，检测gal27a溶液中α-半乳糖苷酶gal27a酶活。α-半乳糖苷酶酶活定义：每分钟内底物降解释放1μmol对硝基酚所需要的酶量为一个酶活单位(u)。

(1)对硝基酚标准曲线的绘制：

将139mg对硝基酚溶于1ml甲醇溶液中，加水定容至100ml配制成终浓度为10mm的溶液。分别吸取对硝基酚溶液不同的体积，用ph为6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容至不同浓度，分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35和0.4mm的标准梯度溶液。405nm波长条件下测定各标准梯度溶液的吸光值。以吸光值为横坐标，对硝基苯酚浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

(2)酶活测定

对硝基酚-α-d-吡喃半乳糖溶于20mm柠檬酸-磷酸氢二钠(ph6)缓冲液，得到对硝基酚-α-d-吡喃半乳糖浓度为20mm的对硝基酚-α-d-吡喃半乳糖溶液。

将50μl对硝基酚-α-d-吡喃半乳糖溶液和50μlph为7.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液于37℃预热3min，然后加入步骤2所得的纯化后酶液充分混合，于30℃恒温水浴10min，得到混合液；向混合液中加入100μl碳酸钠水溶液(碳酸钠的浓度为1m)，振荡均匀，终止反应，测定吸光度od405值。通过与对硝基酚曲线对照，计算酶解反应产生的对硝基酚的量。

实验结果表明，在ph7、37℃条件下gal27a对对硝基酚-α-d-吡喃半乳糖的α-半乳糖苷酶酶活为1.08u/mg。

实施例3

α-半乳糖苷酶gal27a与β-甘露聚糖酶mana协同作用降解半乳甘露聚糖

1.槐豆胶和瓜尔豆胶底物的制备

0.5％槐豆胶(瓜尔豆胶)：取0.5g槐豆胶(瓜尔豆胶)于100ml缓冲液中，沸水浴加热10min，冷却后12000rpm离心5min，取上清，存于4℃备用。

2.还原糖标曲的绘制

将180mg还原糖溶于10ml的柠檬酸-磷酸氢二钠的缓冲液中，配制成终浓度为10mm的溶液。分别吸取对硝基酚溶液不同的体积，用ph为6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容至不同浓度，分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.4、1.8、2.0和2.4mm的标准梯度溶液，终体积是1ml。分别加入1ml的dns试剂，沸水浴5min后迅速冷却反应液，540nm处测定吸光值。以吸光值为横坐标，还原糖浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

3.实验设置3个实验组，即实验1、实验2、实验3，每组三个平行试验，具体操作步骤如下：

实验组1的操作步骤如下：取800μl0.5％槐豆胶底物，于37℃条件下，预热3min，加入0.05u/mlgal27a酶液100μl，和100μl的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，反应15min。

实验组2的操作步骤如下：将实验组1中的gal27a酶液替换成0.25u/mlmana酶液，其他步骤不变。

实验组3的操作步骤如下：取800ul0.5％槐豆胶底物，于37℃条件下，预热3min，加入0.05u/mlgal27a酶液100μl，和0.25u/mlmana酶液100μl，反应15min。

计算协同率，协同率＝a/(aa+ac)

a–实验组中gal27a和mana协同加入底物溶液中反应后的还原糖生成量，单位mm；

ac–实验组中gal27a单独加入底物溶液中反应后的还原糖生成量，单位mm；

aa–实验组中mana单独加入底物溶液中反应后的还原糖生成量，单位mm；

实验结果表明，gal27a和mana共同反应处理槐豆胶协同率为1.13。

4.按照上述方法，将步骤3的底物0.5％槐豆胶替换成0.5％瓜尔豆胶，测定0.05u/mlgal27a和0.25u/mlmana对0.5％瓜尔豆胶底物的协同作用。

实验结果表明，gal27a和mana共同作用时的协同度是2.21。

5.实验设置3个实验组，即实验1、实验2、实验3，每组三个平行试验，具体操作步骤如下：

实验组1的操作步骤如下：取800μl0.5％槐豆胶底物，于37℃条件下，预热3min，加入含有0.2ugal27a的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液200μl，反应1小时

实验组2的操作步骤如下：将实验组1中的gal27a替换成10umana，其他步骤不变。

实验组3的操作步骤如下：取800ul0.5％槐豆胶底物，于37℃条件下，预热3min，加入含有0.2ugal27a和10umana柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液200μl，反应1小时。

使用薄层层析法分析产物成分，如图2所示。使用离子色谱法分析甘露二糖和甘露三糖的含量，分别为0.56g/l和43.3g/l，计算转化率为14％和10.8％。

6.按照上述方法，将步骤5的底物0.5％槐豆胶替换成0.5％瓜尔豆胶，分析产物成分，如图3所示。使用离子色谱法分析甘露二糖和甘露三糖的含量，分别为0.37g/l和0.21g/l，计算转化率为9.4％和5.3％。

序列1：α-半乳糖苷酶氨基酸序列

mtlkpkryaeglaktppmgwnsfntfgcepteelikqsadvmvksglleagyryiniddgwmaderdsagnlvpdpqkfpngmkpvtdyihekgllagtylgcgqktygekpgslgyeerdaqliadqgfdllkydyrelpgdpigrgvkedyvtmrnalmktgrdmvfsicehgkshpetwaqeighmwrttpdikdsfdedinwgwsinhiidethalhhyagpggwndpdmlvvginglndwlgpgctyneykshfslwcllaaplligcdirkmseetktillnkemiainqdplgiqghllkkehgidywvkplanndiaigllnrfnepkeavlslsdlledgnylmkdvwtnerkelqsewisktlkshecavfrlmsknke

序列2为α-半乳糖苷酶核苷酸序列

atgactttaaaaccaaaacgatatgctgaaggattggctaaaactcccccgatgggatggaactcatttaatactttcgggtgtgaaccaacggaagagttgataaaacagagtgcagatgtcatggtaaaatcaggtcttttagaagcaggataccgctatatcaacattgatgacgggtggatggcagacgagagagatagtgctggtaatctagttcctgatcctcaaaaatttccgaacggcatgaaacccgtcactgattatatccatgaaaaaggacttttagcaggcacctatttaggctgtggccaaaaaacatacggagaaaaaccaggaagcttaggatatgaagaaagagatgcacaattaattgctgaccaagggtttgatttactgaagtatgattaccgtgaactcccaggtgatccaataggaagaggggtgaaagaagattacgtgacgatgaggaacgccttgatgaaaactggtagagacatggtcttcagtatttgtgaacatgggaagtcacatccagaaacgtgggctcaggaaattggtcatatgtggcgtacaaccccagatattaaagacagctttgatgaggatataaactggggctggtcaattaatcatattatagatgagacccatgcacttcatcactacgcagggccaggtggttggaacgatccagatatgttagtcgtggggattaatggattaaacgattggcttggacccggctgtacgtataatgaatataaatcacattttagcttgtggtgtctcctcgcagcccctctccttattggttgtgatattcgaaaaatgagtgaggaaaccaaaacgattttactaaataaagagatgattgccattaatcaagatccattaggtatacaaggtcatcttcttaaaaaagaacatgggattgattattgggtaaaacctcttgcgaataatgacatagctattggcttgctaaatcgctttaatgagcctaaagaggctgttcttagcctgagtgatctcctcgaagacggcaactatttaatgaaagatgtatggacaaatgaacggaaggagctacagtcagaatggataagtaaaacattgaagagccatgaatgtgcggtttttaggcttatgtcaaaaaataaagag

mana氨基酸序列

mkkklsqiyhliictliisvgimgittspseassgfyvdgntlydangqpfvmkginhghawykdtastaipaiaeqgantirivlsdggqwekddidtvrevielaeqnkmvavvevhdatgrdsrsdldravdywiemkdaligkedtviinianewygswdgaawadgyidvipklrdaglthtlmvdaagwgqypqsihdygqdvfnadplkntifsihmyeyaggdantvrsnidrvidqdlalvigefghrhtdgdvdedtilsyseetgtgwlawswkgnsaewdyldlsedwagnhltdwgnrivhganglqetskpstvftddnggapeppttttlydfegstqgwhgsnvmggpwsvtewgasgnyslkgdvnlssnsshelyseqsrnlhgysqlnatvrhanwgnpgngmnarlyvktgsdytwysgpftrinssnsgttlsfdlnnienshhvreigvqfsaadnssgqtalyvdnvtlr

mana基因序列

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序列表

<110>天津科技大学

<120>α-半乳糖苷酶及其复合酶在半乳甘露聚糖降解中的应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>389

<212>prt

<213>α-半乳糖苷酶氨基酸序列(unknown)

<400>1

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151015

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<213>α-半乳糖苷酶核苷酸序列(unknown)

<400>2

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<213>mana氨基酸序列(unknown)

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