一种2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶、其编码基因及其表达和应用的制作方法

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶、其编码基因及其表达和应用。

背景技术

近些年来，随着技术的进步和人民生活水平的提高，染料的应用越来越广泛，尤其是对于无毒环保染料的需求越来越大，这对染料工业的发展提出了更高的要求。目前的染料按其来源，主要可分为两大类：天然染料及合成染料。天然染料应用较早，且大多无毒环保，但存在着在自然界中含量有限、提取工艺复杂、生产成本高等局限性。合成染料与天然染料相比具有色泽鲜艳、不受原料来源限制、生产成本低等优点，但缺点在于合成染料大多结构复杂，生物毒性高，在自然界中很难降解或降解成本很高，对生态环境破坏较大。天然染料与合成染料的上述缺点严重制约了染料工业的迅速发展及其应用领域的进一步拓展。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶、其编码基因及其表达和应用。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案：一种2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶stbi，其氨基酸序列如seqidno.2所示，编码439个氨基酸。

本发明还提供一种2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因，所述基因编码氨基酸序列如seqidno.2所示的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶。

优选的，所述2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因的碱基序列如seqidno.1所示，命名为基因stbi，基因全长1381bp。

本发明还提供一种2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因stbi的制备方法：以纯化的玉蜀黍赤霉(fusariumgraminearumph-1)atccmya-4620的基因组dna作为模板，使用引物a1：5’-cgggatccctcagcgcctgtacaaagacac-3’和引a2：5’-cggaattcctagtcatcctgtaagctgatggtc-3’通过聚合酶链式反应扩增得到2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因stbi。

优选的，所述纯化的玉蜀黍赤霉(fusariumgraminearumph-1)的方法为：用真菌基因组dna提取试剂盒纯化菌株编号atccmya-4620的玉蜀黍赤霉fusariumgraminearumph-1的基因组dna。

相应的，本发明还提供包含所述2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因stbi的重组载体、重组菌株以及表达所述2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶的方法。

本发明提供了包含所述2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因stbi的重组载体，制备方法包括以下步骤：将碱基序列如seqidno.1所示的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因stbi插入到质粒pyes2上的bamhi和ecori限制性酶切位点之间，得到重组质粒pyes2-stbi，再将重组重组质粒pyes2-stbi转入。

本发明还提供一种包含所述2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因stbi的重组菌，优选的重组菌为工程菌s(saccharomycescerevisiae)，该菌于2018年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，保藏编号：gdmccno：60415。

本发明还提供一种包含所述2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因stbi的重组菌株，优选的重组菌为工程菌s(saccharomycescerevisiae)的菌株。

本发明还提供一种包含所述2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因stbi的重组菌的制备方法，将重组质粒pyes2-stbi转化进入酿酒酵母工程菌invsc1中，得到的重组菌，命名为工程菌s(saccharomycescerevisiae)。

本发明还提供一种表达2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶stbi的方法，所述方法为：将包含2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因stbi的重组菌在培养基上发酵，使2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶表达，发酵结束后回收并纯化所表达的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶。

优选的，所述包含包含2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因stbi的重组菌为工程菌s(saccharomycescerevisiae)。

优选的，所述培养发酵方法包含以下步骤：

(1)吸取重组菌，即工程菌s(saccharomycescerevisiae)的种子培养液加入到培养基之中，于25-30℃，摇床发酵培养；

(2)发酵过程中，检测600nm波长下发酵液的吸光度，待发酵液600nm波长下吸光度达到0.4-1.0时，添加终浓度为1％的酵母浸膏和2％的蛋白胨至发酵液中，并将发酵液置于25-30℃，摇床中发酵培养。

优选的，所述培养基为sc培养基，所述sc培养基组分包括：占sc培养基质量的选择性氨基酸混合物(-ura)0.062％、无氨基酸酵母氮源基础6.4％、葡萄糖2％，所述sc培养基的ph5.5。

优选的，加入添加终浓度为1％的酵母浸膏和2％的蛋白胨后，摇床发酵培养12-120小时。

优选的，待发酵液600nm波长下吸光度达到0.8时，添加终浓度为1％的酵母浸膏和2％的蛋白胨至发酵液中。

优选的，发酵培养的温度为28℃。

优选的，加入添加终浓度为1％的酵母浸膏和2％的蛋白胨后，发酵培养的时间为72小时。

优选的，发酵过程中摇床的频率为200rpm。

优选的，制备工程菌s(saccharomycescerevisiae)的种子培养液的方法为：从保存有工程菌s的固体培养基上挑取单个菌落于5ml的sc培养基之中，于28℃，200rpm摇床中培养24小时，即得工程菌s的种子培养液。

本发明还提供一种2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶stbi在制备2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸中的应用。

本发明还提供一种包含2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因stbi的重组菌在制备2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸中的应用。

本发明还提供一种工程菌s(saccharomycescerevisiae)在制备2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸中的应用。

优选的，所述制备2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的应用方法，包括以下步骤：

(1)包含2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因stbi的重组菌在培养基上发酵，使2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶表达；

(2)回收并纯化2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸。

优选的，回收并纯化2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的方法包括以下步骤：(1)用氯仿萃取发酵后除去重组菌细胞的发酵液，得到包含2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的粗提物；(2)将包含2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的粗提物干燥至恒重；(3)干燥后的粗提物过硅胶柱，用氯仿洗脱并收集馏分；(4)将氯仿馏分干燥，将干燥得到的固体依次用甲醇、乙酸乙酯、正己烷采用洗涤、离心、弃上清液的方法除去有机杂质得到纯净的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸。

应用制备得到的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸具有疏水疏油的特性，其用于制备的染料，色牢度较好，不易因为与水、油的接触而掉色。

更优选的，所述步骤(4)中洗涤、离心、弃上清液的离心的方法为21000×g离心10分钟。

优选的，发酵后除去重组菌细胞的发酵液的方法是：850×g离心5分钟。

优选的，优选的回收纯化过程中干燥的温度范围为37～45℃。

本发明的有益效果在于：本发明利用纯化的玉蜀黍赤霉(fusariumgraminearumph-1)atccmya-4620的基因组dna扩展得到2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因stbi，并将其转入工程菌，得到的包含2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因stbi的重组菌发酵能够合成2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧，2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸具有疏水疏油性质，是一种黄色素，用于制备的染料，色牢度较好，不易因为与水、油的接触而掉色。

附图说明

图1为化合物2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的结构图。

图2为本发明利用工程菌s合成的黄色素天然染料2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的dmso溶液；左侧为dmso溶剂空白对照图。

图3为2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的紫外吸收谱。

图4为2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的质谱检测图[m-h]-。

图5为实施例2结果图。

图6为实施例3结果图。

图7为实施例4结果图。

图8为实施例5结果图。

图9为实施例6结果图。

图10为实施例7结果图。

图11为实施例8结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行具体说明，但不限于此。

实施例1

2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的制备方法。

(一)实验材料

玉蜀黍赤霉(fusariumgraminearumph-1)购自美国标准生物品收藏中心(atcc)，其编号为atccmya-4620；真菌基因组dna提取试剂盒及pyes2质粒载体购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；限制性核酸内切酶bamhi和ecori购自宝生物工程(大连)有限公司；引物a1和a2订购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

(二)工程菌s(saccharomycescerevisiae)的制备。

(1)用真菌基因组dna提取试剂盒纯化菌株编号atccmya-4620的玉蜀黍赤霉fusariumgraminearumph-1的基因组dna；

(2)以纯化的玉蜀黍赤霉基因组dna作为模板，使用引物a1：5’-cgggatccctcagcgcctgtacaaagacac-3’和引物a2：5’-cggaattcctagtcatcctgtaagctgatggtc-3’通过聚合酶链式反应扩增得到2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因stbi，扩增得到的stbi基因序列为：seqidno.1；

(3)扩增得到2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因stbi翻译后得到的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶，命名为stbi，其序列为seqidno.2；

(4)扩增得到2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因stbi通过限制性核酸内切酶bamhi和ecori连接到pyes2质粒载体中，即得到重组质粒pyes2-stbi；

(5)参照《分子生物学实验指导》(第二版)介绍的方法，将得到的重组质粒pyes2-stbi转化进入酿酒酵母工程菌invsc1中，得到工程菌为s(saccharomycescerevisiae)。

(三)2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的制备。

a.从保存有工程菌s的固体培养基上挑取单个菌落于5ml的sc培养基之中，于28℃，200rpm摇床中培养24小时，即得工程菌s的种子培养液；所述sc培养基中各组分用量占sc培养基质量用量的百分比分别为：选择性氨基酸混合物(-ura)0.062％；无氨基酸酵母氮源基础6.4％；葡萄糖2％；ph5.5；

b.吸取工程菌s的种子培养液加入到sc培养基之中，于28℃，摇床发酵培养，用分光光度计与600nm波长下检测所述发酵液的吸光度，待发酵液600nm波长下吸光度达到0.8时，添加终浓度为1％的酵母浸膏和2％的蛋白胨至发酵液中，将发酵液置于28℃，200rpm摇床中发酵培养72小时；

c.取200ml上述发酵液于离心机中850×g离心5分钟去除工程菌s的细胞；将去除细胞后的发酵液用200ml的氯仿萃取，此过程重复2次用于完全提取发酵液中的粗提物；将粗提物通过硅胶(200-300目)柱层析，收取100％氯仿洗脱的组分，并通过旋转蒸发干燥该组分；将干燥的组分用10ml甲醇振荡悬浮，然后21000×g离心10分钟，弃上清，此过程重复2次用于去除有机物杂质；之后采用同样的方法用乙酸乙酯和正己烷分别清洗2次该组分，从而得到纯净化合物。

(四)化合物的鉴定

1、进行uv波普扫描检测。uv吸收响应如图3所示，特征紫外吸收波长为242nm，280nm，376nm，387nm。

2、进行液相色谱、质谱检测。

用甲醇溶解化合物；用高效液相色谱于380nm波长下检测，高效液相色谱洗脱方法为梯度洗脱35min，30-90％(乙腈：水)，目标峰在20.13min被检测到，如图5(ⅱ)所示。

质谱图[m-h]^-如图4所示，可知其分子量为280。

3、进行核磁共振(nmr)鉴定。碳谱和氢谱如表1、表2所示。

表1制备的化合物在dmso-d6中的13cnmr数据(100mhz)

表2制备的化合物在dmso-d6中的¹hnmr数据(400mhz)

根据核磁共振(nmr)碳谱和氢谱确定此纯净化合物的结构为：

为2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸。

(4)化合物溶解度的测试

在25℃下，分别称取100ml溶液：乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、正己烷、氯仿、甘油、油脂和dmso放入烧杯中。分别称取20g的黄色素固体粉末，并分别加入盛有溶液乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、正己烷、氯仿、甘油、油脂和dmso的烧杯中。逐步加入黄色素固体粉末的溶质，不断搅拌，充分溶解。保证溶液过饱和，过滤取出未溶解的固体黄色素，并在55℃烘干24小时，保证溶剂完全挥发。分别称量未溶解的固体总质量，通过公式(20g-未溶解色素质量＝已溶解色素质量)，求出100ml溶剂中已经溶解的固体质量，即为该温度下该固体的溶解度。在dmso的溶液及空白对照如图2所示。

溶解度表(25℃，单位：g/100ml溶剂)

实施例2

2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成stbi基因酶的验证。

1、将没有插入酶基因stbi的空白质粒pyes2转入酿酒酵母工程菌invsc1，如实施例1相同的方法培养72小时，取发酵液备用。

2、取实施例1的工程菌s(saccharomycescerevisiae)的发酵液和上述发酵液，进行液相检测，380nm波长，洗脱方法为梯度洗脱35min，30-90％(乙腈：水)。

结果如图4所示，没有插入酶基因stbi的空白质粒pyes2转入酿酒酵母工程菌invsc1的发酵液如(i)所示，表明未检测到2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸；带有重组质粒pyes2-stbi质粒的酿酒酵母工程菌invsc1，即工程菌s(saccharomycescerevisiae)的发酵液如(ii)所示，表明检测到2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸；证明stbi基因酶是合成2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的关键酶。

实施例3

如实施例1的方法制备的工程菌s(saccharomycescerevisiae)，如实施例1的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的制备方法，将工程菌s(saccharomycescerevisiae)分别发酵培养12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时，结果从重组工程菌s的1l培养物中分别分离得到0.31g～1.98g的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸，如图6所示。

实施例4

如实施例1的方法制备的工程菌s(saccharomycescerevisiae)，如实施例1的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的制备方法，将工程菌s(saccharomycescerevisiae)发酵培养。区别在于发酵液600nm波长下吸光度达到0.4时，添加终浓度为1％的酵母浸膏和2％的蛋白胨。

发酵培养12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时，结果从重组工程菌s的1l培养物中分别分离得到0.11g～1.29g的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸，如图7所示。

实施例5

如实施例1的方法制备的工程菌s(saccharomycescerevisiae)，如实施例1的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的制备方法，将工程菌s(saccharomycescerevisiae)发酵培养。区别在于发酵液600nm波长下吸光度达到0.6时，添加终浓度为1％的酵母浸膏和2％的蛋白胨。

发酵培养12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时，结果从重组工程菌s的1l培养物中分别分离得到0.26g～1.52g的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸，如图8所示。

实施例6

如实施例1的方法制备的工程菌s(saccharomycescerevisiae)，如实施例1的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的制备方法，将工程菌s(saccharomycescerevisiae)发酵培养。区别在于发酵液600nm波长下吸光度达到1.0时，添加终浓度为1％的酵母浸膏和2％的蛋白胨。

发酵培养12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时，结果从重组工程菌s的1l培养物中分别分离得到0.32g～1.79g的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸，如图9所示。

实施例7

如实施例1的方法制备的工程菌s(saccharomycescerevisiae)，如实施例1的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的制备方法，将工程菌s(saccharomycescerevisiae)发酵培养。区别在于培养温度为25℃。

发酵培养12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时，结果从重组工程菌s的1l培养物中分别分离得到0.27g～1.61g的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸，如图10所示。

实施例8

如实施例1的方法制备的工程菌s(saccharomycescerevisiae)，如实施例1的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的制备方法，将工程菌s(saccharomycescerevisiae)发酵培养。区别在于培养温度为30℃。

发酵培养12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时，结果从重组工程菌s的1l培养物中分别分离得到0.35g～1.87g的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸，如图11所示。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

sequencelisting

<110>广州中医药大学

<120>一种2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶、其编码基因及其表达和应用

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