一种黑暗及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种植物叶片相关特性具有诱导的启动子及工程载体，具体涉及一种黑暗及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用。

背景技术

衰老是植物叶片发育最后一个阶段，在此过程中会发生一系列的生理生化反应，包括叶绿素降解、细胞结构坍塌、营养物质再利用等；植物在生长过程中会面临来自环境的生物或非生物胁迫，如病虫害、长时间弱光/黑暗、干旱、异常温度等，植物在遭受这些胁迫后，会加速叶片衰老进程，营养物质从衰老组织重新分配到果实或幼嫩器官，一定程度上增强了植物适应性，因此，叶片衰老对植物而言又具有积极意义；但是，不正常的叶片衰老(早衰或晚衰)影响作物产量及品质；早衰使植物不能更充分的完成光合作用，有机物积累收到限制；可能造成作物的减产降质；理解并实现人工可控的叶片衰老过程在农业生产中具有重要意义；

叶片衰老是一个受内因和外因共同作用的结果，其中弱光或者黑暗能够加速叶片衰老进程，也是重要的影响因素之一；已有研究表明，在光影响的植物衰老过程中，光受体phyb-pif途径参与其中，另外植物激素如茉莉酸也参与了弱光/黑暗诱导的叶片衰老过程；在实际农业生产中，作物株距或行距较小，作物叶片间相互遮挡，容易产生避荫性效应，叶片早衰脱落，影响产量、品质。因此，使植物能够有效抵抗弱光/黑暗造成的早衰，是农业生产中提高产量、品质的有效手段之一。

技术实现要素：

根据以上现有技术的不足，本发明提供一种黑暗及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用，使植物具有抵抗黑暗及衰老的特性。

申请人发现了一个转录水平同时被黑暗和衰老上调表达的基因slc1(at1g14200),该基因功能尚未被研究；通过pcr手段克隆到该基因的461bp启动子，对该启动子进行了表达分析，通过qrt-pcr,gus及luc鉴定，发现该启动子可以被黑暗和衰老同时特异诱导的；因此，申请人制备了以该启动子序列为基础骨架的工程载体；利用该工程载体，将细胞分裂素合成关键酶编码基因ipt1(at1g68460)重组到该载体中，形成了slc1启动子驱动的ipt1基因表达；由于slc1启动子特异的被黑暗和衰老诱导，因此，ipt1基因能够在黑暗和叶片衰老时期特异表达，已有报道，不同作物中ipt过表达可以延缓叶片衰老；因此，在拟南芥中实现了特异抵抗黑暗及年龄诱导的衰老过程。

如上文所述，本发明所述的一种黑暗及衰老特异诱导启动子，其特征在于：所述启动子如seqidno:1的核苷酸序列所示。

优选的，所述启动子含有一段5’utr序列，位于序列的333位～461位。在后续启动子应用中，为了保证slc1启动子的驱动效果，在工程载体构建中包含这段5’utr序列

优选的，所述启动子具有真核生物启动子核心元件tata-box和caat-box，分别位于序列的300位～303位和326位～329位。

启动子的制备过程如下：提取野生型拟南芥col基因组dna，利用slc1启动子特异引物(proslc1f:gaatttaatcaaacaccttct；proslc1r:cacgctagtacccaaaac)进行pcr扩增；扩增程序：step1:95℃3min；step2:95℃30s,57℃30s,72℃30s，32个循环；step3:72℃10min。反应结束后，回收pcr片段并连接t载体，程序按照试剂公司说明进行；连接产物转化大肠杆菌dh5a，提取克隆并测序，得到slc1启动子，即本发明所述的启动子。

本发明所述的启动子在启动拟南芥ipt1基因表达中的应用。

本发明所述的一种黑暗及衰老特异诱导工程载体，其特征在于：该载体具有权利要求1所述的启动子序列，其核苷酸序列如seqidno:2所示。

工程载体的制备过程如下：以野生型拟南芥col基因组dna为模板，利用slc1启动子通用载体扩增引物proslc1-996f:acatgattacgaattcgaatttaatcaaacaccttct；proslc1-996r:cgatcaatcaggatcccacgctagtacccaaaac)，进行pcr扩增，扩增程序：step1:95℃3min；step2:95℃30s,58℃40s,72℃30s，33个循环；step3:72℃10min。片段回收后，通过infusion重组方法连接入载体p996；体系及方法为：slc1启动子片段2μl；bamh1和ecori双酶切后的p996载体2μl；infusion酶1μl；50℃条件下反应15分钟，将连接产物转化入大肠杆菌dh5a中，测序选择阳性克隆并提取质粒，命名为proslc1载体，即本发明所述的工程载体。

该工程载体具有以下特征：

(1)slc1启动子自身含有一段5’utr序列，可提高转录效率；

(2)该工程载体在使用过程中，只需要用bamh1单酶切载体；所有要连入的候选基因在设计引物时只需要加入固定接头：f向引物加接头acgaattccaggatcc+基因特异引物f向；r向引物加接头cgatcaatcaggatcc+基因特异引物r向，利用infusion重组技术连入proslc1工程载体即可使用，方便快捷，利于在实际操作中程序化连入其它相关基因；

(3)在多克隆位点后，连接有nos终止子，该终止子具有广谱性，可广泛用于不同物种中；

(4)该工程载体植物抗性标记为抗除草剂基因，可通过简单高效的筛选方法获得阳性材料。

本发明所述的载体在在调控拟南芥ipt1基因表达中的应用。

优选的，将拟南芥ipt1基因全长cds克隆到载体的bamh1位点处，获得重组载体，将该重组载体转化到农杆菌gv3301中，利用浸花的方法获得转基因拟南芥，该转基因拟南芥具有抗黑暗及抗衰老的特性。

本发明中，ipt1基因是细胞素合成关键酶合成基因，已有报道，该基因在植物中过量表达能明显抑制叶片衰老过程，但该基因不是特异在黑暗中表达的，基于此，申请人构建了slc1启动子驱动ipt1基因表达载体，实现了ipt1基因在黑暗条件下及叶片衰老时期特异高表达，一方面抑制了叶片在黑暗条件加速衰老的进程；另外，又抑制了植物因年龄造成的衰老进程，即可以实现抵御黑暗促进衰老的过程又使植物正常条件下延缓衰老。

本发明的优点在于：可广泛用于植物ipt1基因表达抑制的相关理论以及植物抵御黑暗、抑制衰老等应用研究。

附图说明

图1为实施例2中拟南芥叶片在不同黑暗时长内slc1基因表达指数图；

图2为实施例2中拟南芥叶片在不同衰老时长内slc1基因表达指数图；

图3为实施例3中对拟南芥叶片分别进行光处理和黑暗处理后gus染色对比图；

图4为实施例3中对拟南芥叶片在不同衰老时长后gus染色对比图；

图5为实施例3中拟南芥叶片在不同黑暗时长内利用多功能酶标仪测定luc活性指数图；

图6为实施例3中拟南芥叶片在不同衰老时长内利用多功能酶标仪测定luc活性指数图；

图7为实施例4中工程载体图谱；

图8为实施例5中col及proslc1::ipt1转基因材料在相同黑暗处理后的离体叶片表型图；

图9为实施例5中col及proslc1::ipt1转基因材料在相同黑暗处理后的叶绿素含量测定对比图；

图10为实施例5中col及proslc1::ipt1转基因材料在相同黑暗处理后的电导率测定对比图；

图11为实施例5中col及proslc1::ipt1转基因植株黑暗处理6天后表型图；

图12为实施例5中col及proslc1::ipt1转基因植株正常生长48天后表型图；

图13为实施例5中col及proslc1::ipt1转基因材料在黑暗处理6天后的叶绿素含量测定对比图；

图14为实施例5中col及proslc1::ipt1转基因材料在正常生长48天后的叶绿素含量测定对比图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1：

一种黑暗及衰老特异诱导启动子，所述启动子如seqidno:1的核苷酸序列所示。

所述启动子含有一段5’utr序列，位于序列的333位～461位。在后续启动子应用中，为了保证slc1启动子的驱动效果，在工程载体构建中包含这段5’utr序列

所述启动子具有真核生物启动子核心元件tata-box和caat-box，分别位于序列的300位～303位和326位～329位。

启动子的制备过程如下：提取野生型拟南芥col基因组dna，利用slc1启动子特异引物(proslc1f:gaatttaatcaaacaccttct；proslc1r:cacgctagtacccaaaac)进行pcr扩增；扩增程序：step1:95℃3min；step2:95℃30s,57℃30s,72℃30s，32个循环；step3:72℃10min。反应结束后，回收pcr片段并连接t载体，程序按照试剂公司说明进行；连接产物转化大肠杆菌dh5a，提取克隆并测序，得到slc1启动子，即本发明所述的启动子。

实施例2：

qrt-pcr鉴定slc1启动子可被黑暗和衰老所诱导：

为了明确slc1启动子表达特征，申请人利用qrt-pcr技术检测了slc1基因在转录水平的表达情况，实验中，将生长28天的野生型拟南芥col第6片莲座叶进行12小时的黑暗处理，分别在0，3，6，12小时取材料并提取rna，反转录为cdna后，以此为模板，利用引物：slc1-qrtf:cactcaaagtgtgtggagga，slc1-qrtr:ctgtcgccggcgttaatggag进行qrt-pcr分析；结果表明，如图1所示，slc1基因转录水平可以被黑暗所诱导，说明slc1启动子具有被黑暗诱导的特性；另外，我们检测了slc1转录水平随叶片衰老进程的变化情况，分别提取生长14天，28天，42天，56天第6叶位的莲座叶rna，反转录为cdna，进行qrt-pcr分析，结果表明，如图2所示，slc1基因转录水平可以随着叶片衰老进程的进行而逐步提高，因此，slc1基因启动子同时又是被叶片衰老所诱导的。

实施例3：

组织化学染色(gus染色)及荧光素酶法(luc)鉴定slc1启动子可以被黑暗和衰老所诱导：

(1)组织化学染色(gus):设计克隆slc1启动子并带有接头的特异性引物(proslc1-gusf:gcaggcatgcaagcttgaatttaatcaaacaccttct；proslc1-gusr:ctcagatctaccatggcacgctagtacccaaaaca)，提取野生型col拟南芥基因组dna，以此为模板进行扩增，扩增程序：step1:95℃3min；step2:95℃30s,56℃30s,72℃30s，32个循环；step3:72℃10min。

将扩增产物回收纯化后，利用infusion重组技术连接进入pcambia3301-gus载体，方法及体系为：slc1启动子片段2μl,pcambia3301-gus(hindiii与ncoi双酶切后)2μl，infusion酶1μl；50℃反应15min，连接产物转化大肠杆菌dh5a，测序提取阳性菌液质粒，命名为proslc1-gus，将此载体转化进入农杆菌gv3101中，并利用浸花法获得转基因拟南芥材料，对获得的转基因材料进行不同处理的gus染色，方法为(1)生长28天转基因材料第5片叶片分别在光下处理12小时和黑暗中处理12小时并染色，结果如图3所示；(2)转基因材料在生长21天(未见衰老)和35天及48天(已有衰老特征)进行gus染色，结果如图4所示。

(2)荧光素酶检测：设计克隆slc1启动子并带有接头的特异性引物(proslc1-lucf:atgattacgaattcgagctcgaatttaatcaaacaccttct；proslc1-lucr:atgggtacatactagtcacgctagtacccaaaaca)，以野生型col拟南芥基因组dna为模板进行扩增，扩增程序与(1)相同；将扩增产物回收纯化后，利用infusion重组技术连接进入pcambia3301-luc载体，方法及体系为：slc1启动子片段2μl,pcambia3301-luc(saci与spei双酶切后)2μl，infusion酶1μl；进行重组反应；反应产物转化大肠杆菌dh5a并测序；提取测序正确的阳性质粒并命名为proslc1-luc；将此载体转化进入农杆菌gv3101中，并利用浸花法获得转基因拟南芥材料，对获得的转基因材料进行不同处理的luc活性检测；方法为(1)将转基因材料置于黑暗中24小时，分别在0,0.5,1,3,6,8,12,24小时时，利用多功能酶标仪测定luc活性，结果如图5所示；(2)对生长14,28,35,48天的转基因材料第5片莲座叶进行luc活性检测，结果如图6所示。

通过组织化学及荧光素酶活性检测，进一步鉴定了slc1启动子是特异性的被黑暗和衰老所诱导。

实施例4：

一种黑暗及衰老特异诱导工程载体，该载体具有所述的启动子序列，其核苷酸序列如seqidno:2所示，该载体图谱如图7所示。

工程载体的制备过程如下：以野生型拟南芥col基因组dna为模板，利用slc1启动子通用载体扩增引物proslc1-996f:acatgattacgaattcgaatttaatcaaacaccttct；proslc1-996r:cgatcaatcaggatcccacgctagtacccaaaac)，进行pcr扩增，扩增程序：step1:95℃3min；step2:95℃30s,58℃40s,72℃30s，33个循环；step3:72℃10min。片段回收后，通过infusion重组方法连接入载体p996；体系及方法为：slc1启动子片段2μl；bamh1和ecori双酶切后的p996载体2μl；infusion酶1μl；50℃条件下反应15分钟，将连接产物转化入大肠杆菌dh5a中，测序选择阳性克隆并提取质粒，命名为proslc1载体，即图4中的jrh0996-slc1载体。

该工程载体具有以下特征：

(1)slc1启动子自身含有一段5’utr序列，可提高转录效率；

(2)该工程载体在使用过程中，只需要用bamh1单酶切载体；所有要连入的候选基因在设计引物时只需要加入固定接头：f向引物加接头acgaattccaggatcc+基因特异引物f向；r向引物加接头cgatcaatcaggatcc+基因特异引物r向，利用infusion重组技术连入proslc1工程载体即可使用，方便快捷，利于在实际操作中程序化连入其它相关基因；

(3)在多克隆位点后，连接有nos终止子，该终止子具有广谱性，可广泛用于不同物种中；

(4)该工程载体植物抗性标记为抗除草剂基因，可通过简单高效的筛选方法获得阳性材料。

实施例5：

slc1启动子及工程载体的应用：

将拟南芥ipt1(at1g68460)基因全长cds克隆到proslc1工程载体的bamh1位点处，获得重组载体proslc1::ipt1，将该载体转化到农杆菌gv3301中，利用浸花的方法获得转基因拟南芥，观察黑暗处理条件下转基因材料与野生型叶片衰老进程变化。

如图8～图10所示，col及proslc1::ipt1转基因材料正常条件下(持续光照)生长28天，取第6片莲座叶整齐放在两层滤纸上，滤纸被处理液(0.5xms,3mmmes,ph5.8)完全浸湿,将其放入培养皿中，黑暗处理7天，表型观察并测定叶绿素及细胞膜电导率；结果表明proslc1::ipt1转基因材料在黑暗条件下较col明显晚衰；

如图11和图13所示，将col及proslc1::ipt1转基因材料在正常条件下生长32天，同时将其放入黑暗中6天，整体活体材料与离体叶片表现类似，proslc1::ipt1材料明显抵御了黑暗造成了早衰；选取第5片莲座叶进行叶绿素测定，proslc1::ipt1材料叶绿素含量明显高于对照；如图12和图14所示，将col及proslc1::ipt1转基因材料在正常条件下生长56天，直接观察叶片衰老表型，结果表明proslc1::ipt1材料明显延缓了叶片衰老，取第6片莲座叶进行叶绿素含量测定，结果表明proslc1::ipt1材料叶绿素含量明显高于对照。

序列表

<110>中国农业科学院烟草研究所

<120>一种黑暗及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用

<141>2018-09-03

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>461

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gaatttaatcaaacaccttctgtgcaggaataatctctgggggttttatcaacactccaa60

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<210>2

<211>9149

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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