IGSF3基因及其shRNA序列及在抗人肺癌中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及igsf3基因及其shrna序列及在抗人肺癌中的应用。

背景技术

肺癌发病率在全球范围内位居前位，根据who全球癌症观察站(globalcancerobservatory,gco)网站提供的数据，2012年肺癌的发病年龄标准化率位于我国癌症第一位，成为社会医疗和经济的一大沉重负担。尤其是近二十年来，吸烟、空气污染和粉尘等个人习惯及环境问题日趋严重，引起了肺癌发病率的迅速增长和疾病谱发生着巨大的改变。

免疫球蛋白超家族(immunoglobulinsuperfamily,igsf)是细胞表面的大蛋白质超家族，参与细胞识别，结合或粘附过程的可溶性蛋白质，其中第三家族成员igsf3编码免疫球蛋白样膜蛋白，编码8个免疫球蛋白结构域，igsf3的mrna在胎盘、肾和肺中高度表达^[1]。

schweitzer等研究者表明igsf3主要调控糖鞘脂信号通路相关基因且是糖尿病细胞运动控制所必需的，igsf3与四种跨膜蛋白cd9、cd81、cd82和cd151存在相互共定位，在细胞运动和损伤修复中发挥着重要的功能^[2]。usardi等研究者报道免疫球蛋白样超家族成员igsf3是一种控制神经元形态的发育调节蛋白，在小脑中，它在分化的颗粒细胞的膜中瞬时发现，并且集中在轴突末端，在发育中的大脑中，igsf3与跨膜蛋白tspan7形成复合物从而促进轴突分支，igsf3有可能是神经元形态发生的新型调节剂并成为控制大脑发育信号通路的中心^[3]。

igsf3因其免疫学功能所以与肿瘤的发生发展有着密切关系，例如，liu等研究者发现，mir-432可以通过靶向igsf3抑制食管鳞状癌细胞的进展，在对40例患者的临床样本进行检测发现mir-432程序低表达状态且与肿瘤淋巴结转移分期相关，过表达mir-432可以靶向igsf3蛋白导致细胞增殖的阻滞，诱导细胞凋亡和抑制细胞的侵袭和迁移能力，这些研究为mir-432成为食管癌的潜在生物标志物和治疗靶点提供了强有力的理论依据^[4]。

小发卡rna(shorthairpinrna,shrna)能够提供高效和特异且持久的基因沉默功能，相当一部分研究者对shrna在肿瘤基因治疗领域的应用非常感兴趣。

参考文献

[1].saupes,roizesg,peterm,boyles,gardinerk,desarioa.molecularcloningofahumancdnaigsf3encodinganimmunoglobulin-likemembraneprotein:expressionandmappingtochromosomeband1p13[j].genomics.1998；52(3):305-11.

[2].schweitzerk,justicemj,bronovai,etal.novelfunctionoftetraspanin-interactingproteinigsf3intheregulationofglycosphingolipidmetabolism[j].thefasebjournal,2017,31(1_supplement):782.18-782.18.

[3].usardia,iyerk,sigoillotsm,dusoncheta,selimif.theimmunoglobulin-likesuperfamilymemberigsf3isadevelopmentallyregulatedproteinthatcontrolsneuronalmorphogenesis[j].developmentalneurobiology.2017；77(1):75-92.

[4].liuj,maoy,lib.po-0987:mir-432inhibitstumorprogressionbytargetingigsf3inesophagealsquamouscellcarcinoma[j].radiotherapyandoncology.2016；119:s479.

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新的抗人肺癌的基因igsf3及其shrna序列，本发明设计的特异性shrna序列可以有效靶向抑制igsf3基因的表达，为未来肺癌基因治疗提供高效和便捷的手段。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

本发明提供一种用于抑制抗人肺癌的基因igsf3的shrna，包括下述(1)第一对干扰序列或(2)第二对干扰序列：

(1)第一对干扰序列：

shigsf3-1-f:gauguuacagggcuucuuauu(seqidno:2)；

shigsf3-1-r:aauaagaagcccuguaacauc(seqidno:3)；

(2)第二对干扰序列：

shigsf3-2-f:gguauucccugaggacuaaag(seqidno:4)；

shigsf3-2-r:cuuuaguccucagggaauacc(seqidno:5)。

进一步的，上述(1)第一对干扰序列或(2)第二对干扰序列中的每对序列可通过4～10bp的核苷酸形成茎环区、以回文形式相连接而形成发夹结构，如loop结构序列为：uucaagaga。

本发明还提供用于表达所述shrna的dna序列，包括下述(3)第一对干扰序列或(4)第二对干扰序列：

(3)第一对干扰序列：

shigsf3-1-f:gatccgatgttacagggcttcttattttcaagagaaataagaagccctgtaacatcttttttg(seqidno:6)；

shigsf3-1-r:aattcaaaaaagatgttacagggcttcttatttctcttgaaaataagaagccctgtaacatcg(seqidno:7)；

(4)第二对干扰序列：

shigsf3-2-f:gatccggtattccctgaggactaaagttcaagagactttagtcctcagggaataccttttttg(seqidno:8)；

shigsf3-2-r:aattcaaaaaaggtattccctgaggactaaagtctcttgaactttagtcctcagggaataccg(seqidno:9)。

本发明还提供上述shrna或上述dna序列在用于制备抗人肺癌疾病药物中的应用。

本发明还提供包含作为活性成分的所述shrna的抗人肺癌组合物。

本发明还提供用于表达所述shrna的重组表达载体。

进一步的，本发明所述的重组表达载体，包含上述(3)第一对干扰序列或(4)第二对干扰序列中所述的dna序列。

本发明还提供包含作为活性成分的所述重组表达载体的抗人肺癌组合物。

本发明还提供导入所述重组表达载体的病毒。

本发明构建用于表达所述shrna的重组表达载体，构建igsf3基因敲减稳转肺癌细胞株，均可通过现有技术常规手段进行。检测igsf3的mrna及蛋白质水平的表达也可通过现有基础常规方法，如qrt-pcr及westernblot等现有技术来实现。

本发明还提供基因igsf3在抗人肺癌中的应用。

本发明的有益效果：本shrna的重组表达载体通过在非小细胞肺癌细胞a549的效果可知，可以有效的敲减igsf3的mrna和蛋白水平且抑制效果好。

附图说明

图1是本发明第一对干扰序列测序结果，结果显示第一对干扰序列已成功插入lv3-gfp载体。

图2是本发明第二对干扰序列测序结果，结果显示第二对干扰序列已成功插入lv3-gfp载体。

图3是本发明非小细胞肺癌细胞a549干扰质粒荧光密度图，结果显示两对干扰序列对细胞株a549的干扰荧光效率高。

图4是本发明非小细胞肺癌细胞a549中igsf3蛋白的mrna水平被两对干扰序列敲减后较对照组结果，qrt-pcr结果显示igsf3的mrna水平被显著抑制。

图5是本发明非小细胞肺癌细胞包括a549中igsf3的蛋白水平被两对干扰序列敲减后较对照组结果，westernblot结果显示igsf3的蛋白水平被显著抑制。

具体实施方式

下面，通过本发明的实施例更为详细地描述本发明，但本发明的范围不会受以下实施例的限制。以下实施例中所用试剂和方法，若无特别说明，均为市售产品或本领域的常规方法。

实施例1

1.干扰质粒制备及测序：

通过ncbi网站寻找igsf3基因蛋白质编码序列(sequencecodingforaminoacidsinprotein,cds)，如seqidno:1所示，设计igsf3基因的两对shrna干扰片段的表达dna序列：

(3)第一对干扰序列：

shigsf3-1-f:gatcctctctgccctcaccaacattcttcaagagagaatgttggtgagggcagagattttttg(seqidno:6)；

shigsf3-1-r:aattcaaaaaatctctgccctcaccaacattctctcttgaagaatgttggtgagggcagagag(seqidno:7)；

(4)第二对干扰序列：

shigsf3-2-f:gatccgtgcctggtagaaactatttcttcaagagagaaatagtttctaccaggcacttttttg(seqidno:8)；

shigsf3-2-r:aattcaaaaaagtgcctggtagaaactatttctctcttgaagaaatagtttctaccaggcacg(seqidno:9)。

并进行干扰质粒克隆(lv3-gfp载体购于上海吉玛有限公司)，将克隆成功的lv3-gfp-shigsf3质粒送至测序公司进行测序，检测插入干扰片段的序列，如图1和图2所示，表明已成功插入干扰片段的序列。

2.慢病毒干扰细胞荧光观察：

将构建好的lv3-gfp-shigsf3的干扰质粒进行慢病毒包装，随后将病毒上清加入a549细胞培养上清，使用1μg/ml嘌呤霉素进行筛选，随后进行激光共聚焦荧光观察病毒侵染密度，结果显示干扰对照lv3-gfp质粒(购于上海吉玛公司)和两个干扰shigsf3质粒的荧光密度均广泛表达(图3)，证明病毒已侵染细胞成功。

3.蛋白免疫印迹实验(westernblot)

(1)样品制备：预先在蛋白裂解液中加入蛋白酶抑制剂，加入pbs洗涤过的细胞培养皿中，刮下细胞。充分裂解后，在低温离心机中12,000×g离心15min，将上清液移入预先准备好的1.5ml离心管中，丢弃沉在底部的细胞碎片。用bca法测定蛋白浓度，制作蛋白样品。

(2)蛋白电泳及转膜：将蛋白样品加入8％的sds-page胶60mv恒压30-40min，90-120mv恒压40-80min。将跑好的胶进行湿转，条件为300ma，120min。将转印结束的pvdf膜放入提前配好的牛奶中封闭2-4h。放入冰箱用一抗孵育过夜。洗膜后常温下放入二抗孵育2-4h，洗膜后进行曝光。

(3)结果分析：如图4所示，在肺癌a549细胞中，两对igsf3干扰序列均可以将igsf3蛋白进行敲减。

4.实时荧光定量pcr实验(quantitativereal-timepcr,qrt-pcr)

(1)总蛋白提取及定量

(1)总rna提取：取出6cm培养皿弃掉培养基，使用pbs轻轻洗细胞两遍，加入1ml的rna提取试剂trizol将细胞吹打下来，吸取到1.5mlep管中。加入200μl酚氯仿剧烈震荡10s后，冰上放置5min，4℃条件12,000×g离心15min，取上层液体300μl到新的1.5mlep管中，注意不要吸到下层，加入300μl的异丙醇轻轻混匀，冰上放置5min，4℃条件12,000×g离心5min后，弃掉上清，使用预冷的75％乙醇洗涤rna，弃掉上清，室温晾干rna，使用无rna酶ddh2o进行rna溶解，随后进行rna浓度测定。

(2)rna逆转录及上级检测：按照诺唯赞逆转录试剂盒使用梯度pcr仪进行rna逆转录成cdna，使用上海翊圣生物有限公司sybrgreenmix进行实时荧光定量pcr检测。

(3)结果分析：如图5所示，在肺癌a549细胞中，两对igsf3干扰序列均可以将igsf3的mrna水平进行敲减，igsf3敲减组下降至对照组的20％左右。

序列表

<110>江苏省人民医院

<120>igsf3基因及其shrna序列及在抗人肺癌中的应用

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3585

<212>dna

<213>人(human)

<400>1

atgaagtgctttttcccggtgctgagctgtctggctgtgctgggtgtggtgtcagcacag60

cggcaggtcaccgttcaggaaggacccttgtaccgcacggagggctcccacatcactatc120

tggtgcaatgtgagtggctaccagggaccttctgagcagaatttccagtggtccatttac180

ctgccttcgtcgccagagcgagaggtgcagatcgtcagcaccatggactcttccttcccc240

tatgccatctacacccagcgcgtccgcggagggaagatcttcatagaaagagtccagggg300

aactcaaccctattgcacatcacagatcttcaggcccgggatgccggggagtatgaatgc360

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gtgatcccagactccctgcagaccactgccatgccccagactctgcacagagtggagcag480

gacccgctggagctcacttgtgaggtggcctcagagaccattcagcacagccacctgtct540

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aacagctcgctcatcgccaccatgggtcctaacgctgtgcctgtcctcaacagcgaattt1020

gctcaccgggaagccaggggacagcttaaggtggccaaagagagcgacagtgtctttgtg1080

ctgaagatctaccacctccgccaggaagatagcgggaaatacaactgccgggtgactgag1140

cgagagaaaaccgtgaccggggaattcattgataaggagagcaagcgtcccaagaacatc1200

cccatcatagtcctccccctcaagagcagcatctccgtggaggtggccagcaatgccagc1260

gtcatccttgagggcgaggacctgcgcttctcctgcagtgtccgcacggcaggcaggccg1320

cagggtcgcttctctgtcatctggcagcttgtggacaggcagaaccgccgcagcaatatc1380

atgtggctagaccgggatggcaccgtgcagccaggctcgtcctactgggagcgcagcagc1440

tttgggggcgtccagatggagcaggtgcagcccaactcgttcagcctgggcatcttcaac1500

agcaggaaggaggacgagggccagtatgaatgccatgtgactgaatgggtgcgggcagtg1560

gatggcgagtggcagattgttggggagcgccgggccagcactcccatctccatcacagct1620

cttgaaatgggcttcgcagtcacagccatctcccggacaccgggggtgacctacagcgac1680

tcctttgacttgcagtgtatcatcaaaccccactaccctgcctgggtccccgtgtcggtg1740

acatggcggttccagccggtgggcacggtggagttccatgacttggtgaccttcacccgg1800

gacggaggggtccagtggggggacaggtcctccagcttccgaacccgaactgccatcgag1860

aaggctgagtccagcaacaacgtccgcctaagcatcagccgagccagtgacacggaagca1920

ggcaagtaccagtgtgtggcagagctgtggcggaagaactacaacaacacctggacgcga1980

ctggcggagaggacctccaacctgctggagatcagggtgctgcagccagtgacaaagctg2040

caggtgagcaaatcgaagaggaccctcaccctggtggaaaacaagcccattcagttgaac2100

tgctcagtcaagtctcagactagccagaactcccactttgcggtgctctggtatgtccac2160

aagccctcggatgccgatggcaagcttatcctgaagaccacccacaactccgcctttgaa2220

tacggtacttacgccgaggaggagggcctgagagccaggctccagtttgagaggcatgtg2280

tcggggggcctgttcagcctcaccgtccagagagccgaggtcagcgacagcggcagctac2340

tactgccacgtggaggagtggctgctgagccccaactacgcctggtacaagctggcagag2400

gaggtttctgggcgcacagaagtcactgtgaaacagccagacagccgcctgaggctcagc2460

caagcccaggggaacctgtcggttctggagacccggcaggtacagctggagtgtgtggtt2520

ctcaaccgcaccagcataacctcccagctcatggtggaatggtttgtatggaagcccaac2580

caccctgagcgggagactgtggcccgcttgagccgtgacgccaccttccactatggagag2640

caggcagccaagaacaatctgaaggggcggctgcatttggagagtccttcccccggcgtg2700

taccgtctcttcatccagaacgtggctgtgcaggacagcgggacctacagctgccatgtg2760

gaggagtggctgcccagccccagtggcatgtggtataagcgggcagaggacaccgctggg2820

cagacagctctgacagtcatgcgaccagatgcttccctgcaggtggacacagtggtcccc2880

aatgccacggtctctgagaaggcagctttccagctggactgtagcatcgtgtcccgctcc2940

agccaggactcccgcttcgctgtggcctggtattccctgaggactaaagctggggggaaa3000

aggagcagccctggcctggaagaacaggaagaggaaagggaggaggaggaggaggaggac3060

gacgacgacgacgacgacccaacagagcggacggccctgctgagcgtgggcccagatgct3120

gtctttggcccagagggcagtccttgggagggcaggcttcgcttccagaggctctccccg3180

gtgctctaccggctcacagtgctgcaggcaagcccccaagatacaggcaattactcctgc3240

catgtggaggagtggctgcccagccctcagaaggaatggtaccggctgacggaggaggag3300

tcagcccccatcggcatccgtgttctagatacaagtcccaccctccagtccatcatctgc3360

tccaacgacgcactcttctacttcgtcttcttctaccctttccccatctttggcattctt3420

atcatcaccatccttctggtgcgtttcaagagccggaactccagcaagaactctgatggg3480

aagaatggggtgcctctgctgtggatcaaagagccacacctcaactactcccctacttgc3540

ctggagccccctgttctcagtatccatccaggggccatagactaa3585

<210>2

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gauguuacagggcuucuuauu21

<210>3

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aauaagaagcccuguaacauc21

<210>4

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gguauucccugaggacuaaag21

<210>5

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cuuuaguccucagggaauacc21

<210>6

<211>63

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gatccgatgttacagggcttcttattttcaagagaaataagaagccctgtaacatctttt60

ttg63

<210>7

<211>63

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

aattcaaaaaagatgttacagggcttcttatttctcttgaaaataagaagccctgtaaca60

tcg63

<210>8

<211>63

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gatccggtattccctgaggactaaagttcaagagactttagtcctcagggaatacctttt60

ttg63

<210>9

<211>63

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

aattcaaaaaaggtattccctgaggactaaagtctcttgaactttagtcctcagggaata60

ccg63