本发明涉及一类用于治疗细菌和/或真菌感染的化合物，尤其涉及十个系列的氟喹诺酮-氮唑杂合衍生物。
背景技术
随着广谱抗生素、激素、免疫抑制剂的广泛应用，aids的蔓延，器官移植和介入技术的推广应用，使真菌、细菌等微生物感染的发病率呈现上升趋势，有关耐药菌株的报道逐渐增多，真菌及细菌感染的治疗面临严峻的挑战。
氮唑类抗真菌药物是目前临床主要的真菌感染治疗药物，该类药物具有代谢稳定，既可口服又可注射，对浅部真菌和深部真菌都有疗效等优点。其中酮康唑等芳乙基环状缩酮类化合物是治疗浅部真菌感染的首选药物，以氟康唑和伊曲康唑为代表的第三代抗真菌药物是治疗深部感染的首选。但是氮唑类抗真菌药物可与人体的多个细胞色素p450蛋白作用，因此具有较严重的不良反应。氟康唑的抗菌谱相对较窄，对曲霉菌等真菌活性很低，且易产生耐药性，伊曲康唑也存在口服生物利用度不稳定等同题。
氟喹诺酮类药物于20世纪80年代起陆续上市,具有抗菌谱广、抗菌活性高、组织穿透性强、生物利用度高、半衰期长、血药浓度高、组织分布广等优点且可单药使用,对革兰阳性菌和革兰阴性菌均显示有良好的抗菌活性,广泛用于泌尿生殖系统、呼吸系统、消化系统感染性疾病的治疗。但是随着抗菌药物的临床不合理应用增多，其耐药问题也日益突出。
针对上述抗真菌和细菌药物的缺陷，科学家们一直在不断寻找新的具有抗真菌和细菌活性的化合物。例如:cn108368053a公开了一类针对革兰氏阴性菌udp-3-o-(r-3-羟基肉豆蔻酰基)-n-乙酰基葡糖胺脱乙酰酶(lpxc)靶标的苯并氮杂环己烯酮化合物，从而规避目前常见的细菌耐药机制。cn108368102a公开了一类二嗪化合物，针对研究较少的抗真菌靶标β真葡聚糖合酶(棘白菌素)进行药物设计，当多烯和唑类抗真菌药物耐药时，能够作为替代药物使用。虽然抗真菌和细菌药物的研发不断有新的成果出现，但是目前的研发方向都是基于单一靶点的研究，尚未见到同时能作用于真菌和细菌靶点的药物的报道。随着蛋白质组学和基因组学等学科的发展，对于药物在体内作用机制的认识已经逐渐从细胞水平深入到分子水平，对于某些疾病，即使靶点选择得非常准确，设计的化合物的活性和选择性也很强，但是最终因为药物在体内受多种因素的影响导致药效不尽如人意。因此，针对疾病成因的多靶点药物的研究逐渐成为热点。多靶点药物最常见的设计方法称为骨架联合方法，该方法使用两个靶向不同靶点的分子作为起始化合物，保留包括药效团在内的主体结构后，对二者进行骨架整合。然而大量实践表明，虽然骨架整合法在理论上具有一定的可行性，但是由于整合后的化合物结构及理化性质与整合前可能差异很大，是否仍能保留对原靶点的亲和力具有不可预期性。
技术实现要素：
本发明将氮唑类抗真菌药物及氟喹诺酮类药物的药效团通过linker杂合，得到一类兼具抗真菌和细菌活性的氟喹诺酮-氮唑杂合化合物，本发明具体技术方案如下：
如式i所示化合物，其消旋体、立体异构体、互变异构体、氮氧化物或它们的药学可接受盐：
其中x选自：c1-c6烷基；c3-c6环烷基；取代或未取代的c6-c10的芳基，所述芳基上的取代基为一个或多个，独立选自：卤素；氨基；羟基；c1-c6烷基；c3-c6环烷基；
z选自：n或c-r1；r1选自h；c1-c6烷氧基或卤素；
q选自ch或n；
r’选自卤素；
y选自：
其中n选自1，2或3；r2选自h，卤素或c1-c6烷基；r”选自氢或c1-c6烷基；标记*的一侧表示与l的连接端；
l表示连接结构。
上述技术方案中，l优选如下基团：
其中，r3、r4独立任选自h，卤素，羟基，氨基或c1-c6烷基；m选自0，1，2或3；标记**的一侧用于表示与y的连接端。
作为优选，上述任意技术方案中，q选自n；r’选自氟；
l选自：
作为优选，上述任意技术方案中，x选自：甲基、乙基、丙基、环丙基、取代或未取代的苯基，所述苯基上的取代基为一个或多个，独立选自：卤素；氨基；羟基或c1-c3烷基；
z选自：n或c-r1；r1选自h；甲氧基、乙氧基或卤素。
本发明还提供如具体实施方式中tm1～tm10及部分中间体所示的化合物，其消旋体、立体异构体、互变异构体、氮氧化物或它们的药学可接受盐。
本发明还请求保护一种药物组合物，包括上述任意化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、氮氧化物或它们的药学可接受盐。
作为优选，本发明的任意化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、氮氧化物或它们的药学可接受盐，可以制成药学可接受的任意剂型，即本发明的药物组合物还可以包括药学可接受的载体和/或助剂。
作为优选，可以根据需要将一种或多种其他活性成分与本发明的任意化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、氮氧化物或它们的药学可接受盐制成复方药物。
本发明还请求保护上述任意化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、氮氧化物或它们的药学可接受盐在制备治疗真菌感染和/或细菌感染所致疾病的药物中的用途。
本发明所述真菌感染包括但不限于烟曲霉菌、热带假丝酵母菌、白色念珠菌及近平滑念珠菌感染；尤其优选烟曲霉菌感染。本发明所述细菌感染包括但不限于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、副溶血弧菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、不动杆菌、耐药柠檬酸杆菌、耐药金黄色葡萄球菌及耐药肺炎克雷伯氏菌感染。
术语定义和解释：
除非另有说明，本申请说明书和权利要求书中记载的基团和术语定义，包括其作为实例的定义、示例性的定义、优选的定义、表格中记载的定义、实施例中具体化合物的定义等，可以彼此之间任意组合和结合。这样的组合和结合后的基团定义及化合物结构，应当属于本申请说明书记载的范围内。
除非另有说明，当本文中使用“本发明化合物”或“本发明的化合物”时，至少旨在涵盖式i所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、氮氧化物或它们的药学可接受盐。
术语“卤素”指f、cl、br和i。换言之，f、cl、br和i在本说明书中可描述为“卤素”。
术语“c1-c6”应理解为优选表示具有1-6个碳原子的直链或支链饱和一价烃基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基等或它们的异构体。
术语“c6-c10芳基”应理解为优选表示具有6-10个碳原子的芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃，特别是具有6个碳原子的环(“c6芳基”)，例如苯基；或联苯基，或者是具有9个碳原子的环(“c9芳基”)，例如茚满基或茚基，或者是具有10个碳原子的环(“c10芳基”)，例如四氢化萘基、二氢萘基或萘基。
本发明所提及的化合物药学上可接受的盐可以是酸性盐，也可以是碱性盐。例如无机酸盐、有机酸盐、有机碱盐或无机碱盐。
本发明化合物优选以未修饰的形式或与本领域制剂中常规使用的辅助剂通过常规技术手段得到例如液体制剂(例如喷射剂、乳剂、混悬剂、溶液剂、可乳化的浓缩物、溶液浓缩物)、半固体制剂(例如霜剂、软膏剂、贴剂、凝胶剂、脂质体制剂)和固体制剂(例如散剂、颗粒剂、片剂等)。
术语药学上可接受的载体和/或助剂包括但不限于：糖类，例如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；淀粉类，例如玉米淀粉、木薯淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和甲基纤维素；磷酸钙类，例如磷酸二钙和磷酸三钙；硫酸钠；硫酸钙；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯醇；硬脂酸；硬脂酸碱土金属盐，例如硬脂酸镁和硬脂酸钙；植物油类，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油和玉米油；非离子、阳离子和负离子表面活性剂；聚乙二醇；脂肪醇类；和谷物水解固形物以及其它无毒的可相容的填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧剂、润滑剂、着色剂等在药物制剂中常用辅料。
具体实施方式
实施例一、tm1系列化合物的合成
通用路线如下：
于250ml圆底烧瓶中加入2',4'-二氟-2-[1-(1h-1,2,4-三唑基)]苯乙酮(1.115g,5mmol)及10ml甲醇，室温搅拌，在冰浴条件下分批加入kbh4(0.405g,7.5mmol)，加毕，撤去冰浴，20-40℃搅拌，tlc检测反应进程。反应完成后，旋蒸除去溶剂，加水15ml，浓盐酸调ph＝1～3，室温搅拌1h，10％k2co3调ph＝8～9，静置，抽滤，水洗(10ml×3)，得到白色固体im1。
于100ml圆底烧瓶中加入im1(0.672g,3mmol)、丁二酸酐(0.603g,6mmol)，丙酮6ml，et3n0.15ml,搅拌下升温至回流，tlc监测反应进程。反应完成后，向反应液中加水10ml，搅拌下析晶，过滤收集固体，乙醇重结晶，得到白色固体im1-2。
于100ml圆底烧瓶依次加入im1-2(1.0mmol)、hbtu(1.2mmol)、沙星(1.1mmol)及干燥的dcm10ml，室温搅拌，在冰浴条件下加入dipea或et3n(2.0mmol)，撤去冰浴继续室温反应，tlc监测反应进程。反应完成后，停止搅拌。抽滤，滤饼用dcm(10ml×3)洗涤；收集滤液，依次以饱和nahco3溶液(15ml×2)、1.5n稀盐酸水溶液(15ml×2)、饱和nacl溶液(15ml×2)洗涤，静置分层，无水na2so4干燥，减压蒸干，柱层析纯化(dcm/ch3oh＝80/1)，收集洗脱液，减压蒸干；真空干燥，得到tm1，相关实验结果见表1。
表1tm1系列化合物的合成结果及表征
实施例二、tm2系列化合物的合成
通用路线如下：
于250ml三口瓶加入nah(0.813g,20mmol)、thf15ml，室温搅拌；用恒压滴液漏斗缓慢滴加im1(2.245g,10mmol)溶于thf10ml的溶液，加毕移入80℃油浴反应30min；缓慢滴加2-溴乙酸甲酯(1.735g,15mmol)溶于thf10ml的溶液。tlc监测反应进程。停止搅拌，将反应混合物减压浓缩，倒入冷水(30ml)中，二氯甲烷萃取(2×20ml)。合并有机萃取液，饱和食盐水(2×20ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，柱层析纯化(pe/ea＝1/2)，收集洗脱液，减压蒸干，真空干燥，得纯品im2-2。
于100ml圆底烧瓶依次加入im2-2(1.930g,6.5mmol)、甲醇9ml及水5ml的混合溶剂，电磁搅拌，加入lioh·h2o(0.819g,19.5mmol)，继续搅拌，tlc监测反应进程。反应完成后，减压蒸除甲醇，冷却，ph值调到2～3，析出淡黄色固体，抽滤，滤饼水洗(2×10ml)，收集滤饼，得到淡黄色固体im2-3。
于100ml圆底烧瓶依次加入im2-3(1.0mmol)、hbtu(1.2mmol)、沙星(1.0mmol)及干燥的dcm15ml，搅拌，冰浴冷却，加入dipea或et3n(2.0mmol)，撤去冰浴继续室温反应。tlc监测反应进程，当产物点基本没变化时，停止搅拌。抽滤，滤饼用dcm(10ml×3)洗涤；收集滤液，依次以饱和nahco3溶液(15ml×2)、1.5n稀盐酸水溶液(15ml×2)、饱和nacl溶液(15ml×2)洗涤，无水na2so4干燥，减压蒸干，柱层析纯化(dcm/ch3oh＝120/1)，收集洗脱液，减压蒸干，真空干燥，得纯品tm2，相关实验结果见表2。
表2tm2系列化合物合成结果及表征
实施例三、tm3系列化合物的合成
通用路线如下：
于100ml圆底烧瓶中加入沙星(2mmol)、dcm5ml及碱(nahco3或et3n，3mmol)，冰浴搅拌，滴加1mmol的固体光气(btc)的dcm溶液5ml，室温搅拌，tlc监测反应进程。反应结束后，加入15ml饱和食盐水，调ph值4～5，分液，饱和食盐水洗涤(10ml×3)。分液，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂得到中间体im3-1～im3-8。
于100ml圆底烧瓶中加入im1(1.2mmol)、dcm10ml、et3n(1.5mmol)及dmap(0.05mmol)，冰浴搅拌，加入im3-x(x＝1～8)(1mmol)，升温到室温，继续搅拌，tlc监测反应进程。反应结束后，加入15mldcm，并用酸性饱和食盐水液洗(25ml×3)，无水na2so4干燥，减压蒸干，柱层析纯化(dcm/ch3oh＝150/1)，收集洗脱液，减压蒸干，得到纯品tm3。利用上述方法，合成了tm3系列8个目标化合物，相关实验结果见表3。
表3tm3系列化合物合成结果及表征
实施例四、tm4系列化合物的合成
通用路线如下：
100ml圆底烧瓶中依次加入im1(0.5mmol)、碱(1mmol)和6mldcm，搅拌20min后，滴加氯乙酰氯(0.75mmol)的溶液，-5℃持续反应，tlc跟踪监测至反应结束。减压旋蒸除去溶剂，加水15ml，ea萃取(15ml×3)，收集有机相，饱和食盐水洗(15ml×3)，无水na2so4干燥，减压蒸干，柱层析纯化(pe/ea＝1/1)，收集洗脱液，减压蒸干，室温敞放一天，真空干燥，得到中间体im4-2，备用。
100ml圆底烧瓶中依次加入沙星(1mmol)、et3n(1.5mmol)和5mldmf，搅拌20min后加入im4-2(1.2mmol)，移至60℃油浴搅拌反应，tlc监测至反应结束。加入30ml冰水及15mldcm，调节ph＝3左右，分液，饱和食盐水洗(20ml×5)，无水na2so4干燥，减压蒸干，柱层析纯化(dcm/ch3oh＝150/1)，收集洗脱液，减压蒸干，真空干燥，得到纯品tm4，相关实验结果见表4。
表4tm4系列化合物合成结果及表征
实施例五、tm5系列化合物的合成
通用路线如下：
于100ml圆底烧瓶内加入im1(0.5mmol)、5mldcm、碱1.0mmol，反应瓶移至低温反应器中0℃反应，滴加3-氯丙酰氯(1.0mmol)，加入dmap(0.1mmol)，tlc监测。反应结束后旋蒸除去溶剂，加水10ml，ea萃取(5ml×3)，饱和食盐水洗涤(10ml×3)，无水na2so4干燥，减压蒸干，得到im5-2，直接用于下步反应。
于100ml反应瓶中加入im5-2(0.6mmol)、4mldmf，搅拌溶解后，加入沙星(0.5mmol)、碱(1.5mmol)，65-100℃下搅拌反应，tlc监测反应进程。反应结束后，加水20ml，加入dcm30ml，调其ph到2-3，分液，有机相洗涤4次(15ml水+2ml1.5nhcl)，无水na2so4干燥，旋蒸，柱层析纯化(dcm/ch3oh＝130/1)，收集洗脱液，减压蒸干，真空干燥，得到tm5，相关实验结果见表5。
表5tm5合成结果及表征
实施例六、tm6系列化合物的合成
通用路线如下：
于100ml圆底烧瓶内加入im1(0.113g,0.5mmol)、dcm4ml、碱(1.0mmol)，反应瓶移至低温反应器中0℃反应，滴加4-氯丁酰氯(0.141g,1.0mmol)，搅拌，tlc监测。反应结束后旋蒸除去溶剂，加入水10ml，ea萃取(5ml×3)，饱和食盐水洗涤(10ml×3)，无水na2so4干燥，减压蒸干，得到im6-2。
于100ml圆底烧瓶中依次加入im6-2(1.2mmol)、沙星(1mmol)和4mldmf、et3n(1.2mmol)，70-95℃搅拌反应，tlc监测至反应结束。加入30ml冰水、25mldcm，调节ph＝3左右，分液，饱和食盐水洗(20ml×5)，无水na2so4干燥，减压蒸干，柱层析纯化(dcm/ch3oh＝150/1)，收集洗脱液，减压蒸干得到tm6，相关实验结果见表6。
表6tm6合成结果及表征
实施例七、tm7系列化合物的合成
通用路线如下：
100ml圆底烧瓶中依次加入ph3p(1mmol)、3ml甲苯和2-溴乙酸甲酯(1.2mmol)，室温搅拌10min，移入到60-80℃油浴中加热反应，6h后将温度升到120℃回流，回流3h，室温冷却，析出白色固体，抽滤，滤饼用乙醚洗(2ml×5),得到白色固体im7-1。
100ml三口瓶中依次加入dmf1.5ml、nah(0.03g,0.75mmol)室温搅拌0.5h，氮气保护下再滴加im7-1(0.311g,0.75mmol)的dmf溶液(3ml)，室温搅拌2h，滴加1ml2',4'-二氟-2-[1-(1h-1,2,4-三唑基)]苯乙酮(0.113g,0.5mmol)的dmf溶液，室温搅拌，tlc监测。反应结束后，加水搅拌，抽滤除去一部分三苯基氧磷，滤液用ea萃取直至水相中无产物，合并有机相，水洗(20ml×2)，饱和食盐水洗(20ml×3)，无水na2so4干燥，减压蒸干，柱层析纯化，得到纯品im7-2。
于100ml圆底烧瓶依次加入im7-2(2.1g,7.5mmol)、10ml甲醇及5ml水的混合溶剂，加入lioh·h2o(1.26g,30mmol)，冰浴搅拌，tlc监测反应进程。反应完后，减压蒸馏除去甲醇，ph值调到2～3，ea(10ml×3)萃取，合并有机相，无水na2so4干燥，减压蒸干，得到im7-3。
于100ml圆底烧瓶依次加入im7-3(0.294g,1.1mmol)、hbtu(0.455g,1.2mmol)、沙星(1.0mmol)及干燥的dcm8ml，室温搅拌，加入dipea或et3n(2.0mmol)，继续室温反应，tlc监测反应进程，当产物点基本没变化时，停止搅拌。抽滤，滤饼用dcm(5ml×3)洗涤，滤液依次以饱和nahco3溶液(10ml×2)、1.0nhcl水溶液(15ml×2)、饱和nacl溶液(15ml×2)洗涤，无水na2so4干燥，减压蒸干，柱层析纯化，减压蒸干，得到纯品tm7。利用上述方法，合成了tm7系列8个目标化合物，相关实验结果见表7。
表7tm7合成结果及表征
实施例八、tm8系列化合物的合成
通用路线如下：
于100ml圆底烧瓶中依次加入im1(10mmol)、乙腈15ml、4,6-二氯嘧啶(12mmol)、k2co3(23mmol)，90℃油浴中搅拌反应，tlc监测反应。反应结束，旋蒸除去溶剂，加入30mldcm和15ml水，电磁搅拌，静置，分液，水相用dcm反萃(10ml×2)，合并有机相，饱和食盐水洗(30ml×3)，无水na2so4干燥，减压蒸干，柱层析纯化(pe/ea＝6/1)，收集洗脱液，减压蒸干，得到im8-2。
于100ml圆底烧瓶中依次加入im8-2(1.1mmol)、沙星(1mmol)、dmf3.0ml、k2co3(1.5mmol)，90℃油浴中电磁搅拌，tlc监测。反应结束，加入冰水30ml和dcm15ml，调节ph＝4左右，分液，饱和食盐水洗(20ml×5)，无水na2so4干燥，减压蒸干，柱层析纯化(dcm/ch3oh＝120/1)，收集洗脱液，减压蒸干，真空干燥，得到tm8，相关实验结果见表8。
表8tm8合成结果及表征
实施例九、tm9及tm10系列化合物的合成
通用路线如下：
于100ml圆底烧瓶依次加入im1(2.25g,10mmol)、20ml乙醇及2.5ml水，9～11℃搅拌20min，再加入naoh(1.20g,30mmol)、tbab(0.31g,0.1mmol)，将反应瓶移入30℃水浴中加热，滴加(s)-环氧氯丙烷或(r)-环氧氯丙烷(9.21g,100mmol)，将反应温度升至50℃反应，tlc监测反应进程。反应完后，减压蒸馏除去乙醇，加入水15ml，ea(25ml×2)萃取，饱和食盐水洗涤(20ml×3)，无水na2so4干燥，减压蒸干，得到黄色油状物，柱层析，得到微黄色油状物im9-2(源于s-环氧氯丙烷)或im10-2(源于r-环氧氯丙烷)。
于100ml圆底烧瓶中依次加入im9-2(或im10-2)1mmol、无水乙醇3ml、沙星(1.1mmol)和nahco3(1.5mmol)，85℃油浴搅拌反应，tlc监测至反应结束。旋蒸除去溶剂，加水15ml、dcm25ml，搅拌，ph调到5～6，静置，分液，饱和食盐水洗涤(20ml×3)，无水na2so4干燥，减压蒸干，得到粗品，柱层析得到纯品tm9或tm10系列目标化合物，真空干燥后低温保存，相关实验结果见表9。
表9tm9和tm10合成及表征结果
实施例十、真菌、细菌及耐药菌抑制活性测试
(一)、通用样品、培养基与试剂
1、氟喹诺酮原药、对照及其衍生物样品
加替沙星(gat)、伊诺沙星(enx)、洛美沙星(lom)、巴洛沙星(bal)(上海达瑞精细化工有限公司,ar)；环丙沙星(cip)、诺氟沙星(nor)、沙拉沙星(sar)、克林沙星(clx)(郑州克尔泰生化科技有限公司，>95％)；氟康唑(fuz)(天津药业集团)；氟喹诺酮氮唑杂合分子均自制。
2、培养基与试剂
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，琼脂粉1％，去离子水。调节ph至7.0～7.2，分装于500ml锥形瓶，121℃，20分钟高压蒸汽灭菌备用；
普通液体培养基：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，去离子水。调节ph至7.0～7.2，分装于500ml锥形瓶，121℃，20分钟高压蒸汽灭菌备用；
0.9％生理盐水、1mna2hpo4溶液、1mnah2po4溶液，配好后均121℃，30分钟高压蒸汽灭菌备用。
(二)、体外真菌抑制活性测试
1、试验菌株
烟曲霉菌；热带假丝酵母菌；白色念珠菌；白色念珠菌atcc90023；近平滑念珠菌atcc22019(上述菌株由四川省医学科学院临床实验室，四川省人民医院提供)。
2、最小抑菌浓度(mic)测定方法
2.1待测液的配制
根据待测物的效价或是含量及所需要的体积，计算出待测物所需的量，并准确称取所需的各种抗菌待测物，用适宜的溶剂及稀释剂将待测物稀释至所需的浓度(样品质量为3.2mg，先配成母液3.2mg/ml＝3200μg/ml，再吸取320μl储备液，用肉汤稀释至1024μg/ml，为待测液a)。
2.2菌悬液的制备
接种保存的菌株于普通液体培养基中，置于37℃恒温摇床活化培养17小时。活化后用脑心浸液肉汤培养基(bhi)分别稀释成105cfu/ml的菌悬液备用。
2.3加样和培养
无菌条件下，在每一排的第一孔加配好的待测液(浓度为1024μg/ml)100μl，然后对待测物进行二倍稀释，即第一孔中加入待测液后用移液枪充分吹打(至少三次以上)使待测物与肉汤充分混匀，然后吸取100μl加入第二孔，再充分吹打使之与肉汤充分混匀，照此重复直至第十孔，吸取100μl弃去；此时每孔待测物浓度从左到右依次为512,256,128,64,32,16,8,4,2,1μg/ml。最后2孔不含待测物，分别作为细菌生长对照和阴性对照。再在1-11孔中加入稀释好的菌液100μl，此时每孔待测物浓度即最终待测物浓度从左到右依次为256,128,64,32,16,8,4,2,1,0.5μg/ml；最后一孔不加菌液，为阴性对照。将接种好的96孔板放入37℃恒温培养箱培养24h。
2.4结果判定
培养完成后，将96孔板从恒温箱中取出，观察孔内细菌生长情况。在判定结果之前，要确定生长对照孔的细菌正常生长、阴性对照孔无细菌生长时结果才有意义。将肉眼观察没有细菌生长的孔中的药物浓度作为该药物对该细菌的mic。如果出现跳孔现象，则需重复试验进行验证。
3、mic值结果及讨论
新型氟喹诺酮氮唑杂合分子对烟曲霉菌、热带假丝酵母菌、白色念珠菌、白色念珠菌atcc90023及近平滑念珠菌atcc22019的mic值测定结果见表10。
表10待测物对5株真菌的mic值测定(单位为μg/ml)
通过表10可知，本发明tm1-tm10系列的化合物对真菌具有显著抑制活性，尤其是对烟曲霉菌的抑菌活性显著优于阳性对照药物。
(三)、体外细菌抑制活性测试
挑选部分氟喹诺酮-氮唑杂合分子，采用nccls推荐的微量肉汤稀释法，测定它们对金黄色葡萄球菌atcc6538、大肠杆菌atcc25922、副溶血弧菌atcc17802、铜绿假单胞菌atcc27853、沙门氏菌atcc13076、不动杆菌atcc19606的抑制情况，获得相应的mic值，并与氟喹诺酮(阳性对照)进行比较。
1、试验菌株
金黄色葡萄球菌atcc6538、大肠杆菌atcc25922、副溶血弧菌atcc17802、铜绿假单胞菌atcc27853、沙门氏菌atcc13076、不动杆菌atcc19606(菌株均由重庆市进出口检验检疫局提供)
2、最小抑菌浓度(mic)测定
(1)待测液的配制
根据待测物的效价或是含量及所需要的体积，计算出待测物所需的量，并准确称取所需的各种抗菌待测物，用适宜的溶剂及稀释剂将待测物稀释至所需的浓度(样品质量为1mg，先配成母液1mg/0.195ml＝5.12mg/ml＝5120μg/ml，再吸取100μl储备液，用肉汤稀释至512μg/ml，为待测液a)。
(2)菌悬液的制备
接种保存的菌株于普通液体培养基中，置于37℃恒温摇床活化培养17小时。活化后用脑心浸液肉汤培(bhi)养基分别稀释成105cfu/ml的菌悬液备用。
(3)加样与培养
无菌条件下，在96孔板每个孔加入空白肉汤100μl。在每一排的第一孔加配好的待测液(浓度为512μg/ml)100μl，然后对待测物进行二倍稀释，即第一孔中加入待测液后用移液枪充分吹打(至少三次以上)使待测物与肉汤充分混匀，然后吸取100μl加入第二孔，再充分吹打使之与肉汤充分混匀，照此重复直至第十孔，吸取100μl弃去；此时每孔待测物浓度从左到右依次为256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5μg/ml，最后2孔不含待测物，一个作为细菌生长对照，一个作为阴性对照。再在1-11孔中加入稀释好的菌液100μl，此时每孔待测物浓度即最终待测物浓度从左到右依次为128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0μg/ml；最后一孔不加菌液，为阴性对照。将接种好的96孔板放入37℃恒温培养箱培养培养16-20h。
(4)结果判定
培养完成后，将96孔板从恒温箱中取出，观察孔内细菌生长情况。在判定结果之前，要确定生长对照孔的细菌正常生长、阴性对照孔无细菌生长时结果才有意义。将肉眼观察没有细菌生长的孔中的药物浓度作为该药物对该细菌的mic。如果出现跳孔现象，则需重复试验进行验证。
表11待测物对六种细菌的mic值(单位为μg/ml)
通过表11可知，本发明tm1-tm10的部分化合物对所测六株细菌具有较强的抑制作用。
(四)、体外耐药菌抑制活性测试
采用nccls推荐的微量肉汤稀释法，先测定待测物对敏感细菌大肠杆菌、铜绿假单胞菌pa01、金黄色葡萄球菌atcc25129、金黄色葡萄球菌atcc33591的mic，获得所有目标分子的抗菌活性。挑选出mic≤4μg/ml的化合物进行耐药菌的mic值测定。
1试验菌株
敏感菌：大肠杆菌；铜绿假单胞菌pa01；金黄色葡萄球菌atcc25129；金黄色葡萄球菌atcc33591(此菌株由西南大学药学院徐兴然老师实验室提供)。
耐药菌：耐药金黄色葡萄球菌(菌株编号为806s和817s)；耐药肺炎克雷伯氏菌(菌株编号为747k和810k)；耐药柠檬酸菌(菌株编号为822n)(此菌株由第三军医大学提供)。
2最小抑菌浓度(mic)测定
(1)待测液的配制：根据待测物的效价或是含量及所需要的体积，计算出待测物所需的量，并准确称取所需的各种抗菌待测物，用适宜的溶剂及稀释剂将待测物稀释至所需的浓度(样品质量为3.2mg，先配成母液3.2mg/1ml＝3.2mg/ml＝3200μg/ml，再吸取50μl储备液，用无菌水稀释至500μl浓度为32μg/ml，为待测液a)。
(2)菌悬液的制备：接种保存的菌株于普通液体培养基中，置于37℃恒温摇床活化培养17小时。活化后用脑心浸液肉汤培养基(bhi)分别稀释成105cfu/ml的菌悬液备用。
(3)加样与培养：在96孔板每一列的第一孔加入空白肉汤80μl，其余孔加入空白肉汤50μl。在每一列的第一孔加配好的待测液(浓度为32μg/ml)20μl，然后对待测物进行二倍稀释。即，第一孔中加入待测液后用移液枪充分吹打(至少三次以上)使待测物与肉汤充分混匀，然后吸取50μl加入第二孔，再充分吹打使之与肉汤充分混匀，照此重复直至第八孔，吸取50μl弃去；此时每孔待测物浓度从左到右依次为64,32,16,8,4,2,1,0.5μg/ml，每一块板的最后两列为作为对照，两列都不含待测物，一列作为细菌生长对照加入菌液，另一列作为阴性对照不加菌液。再在1-8孔中加入稀释好的菌液50μl，此时每孔待测物浓度即最终待测物浓度从左到右依次为32,16,8,4,2,1,0.5,0.25μg/ml。将接种好的96孔板放入37℃恒温培养箱培养培养20-24h，然后观察和记录结果。
(4)结果判定：培养完成后，将96孔板从恒温箱中取出，观察孔内细菌生长情况。在判定结果之前，要确定生长对照孔的细菌正常生长、阴性对照孔无细菌生长时结果才有意义。将肉眼观察没有细菌生长的孔中的药物浓度作为该药物对该细菌的mic。每种待测物对每个菌株同时做2个平行试验，如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。
3结果
3.1对某些敏感菌株的mic值测定
目标分子对大肠杆菌、铜绿假单胞菌pa01、金黄色葡萄球菌atcc25129、金黄色葡萄球菌atcc33591的mic值测定，在西南大学药学院徐兴然老师实验室完成，测试结果如下表12。
表12待测物对敏感细菌的mic值(μg/ml)
通过表12可知，本发明tm1-tm10系列的化合物对敏感细菌具有抑制活性，部分化合物的抑菌活性显著优于阳性对照药物。
3.2对部分耐药菌株的mic值测定
从表12中挑选mic≤4μg/ml的化合物，进行耐药柠檬酸杆菌(822n)、耐药金黄色葡萄球菌(806s和817s)和耐药肺炎克雷伯氏菌(747k和810k)的mic值测定，结果见表13。
表13待测物对耐药柠檬酸杆菌、金黄色葡萄球菌及肺炎克雷伯氏菌的mic值(μg/ml)
通过表13可知，本发明tm1-tm10系列的化合物对耐药柠檬酸杆菌、耐药金黄色葡萄球菌及耐药肺炎克雷伯氏菌具有抑制活性，尤其是对耐药柠檬酸杆菌的抑菌活性显著优于阳性对照药物。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。