一种检测常见益生菌丰度的试剂盒的制作方法

本发明涉及一种检测常见益生菌丰度的试剂盒。
背景技术：
：肠道菌群大约包括两千多种菌。肠道菌群构成与生活习惯，饮食和宿主的基因密切相关，个体间存在着较大的差异。厚壁菌门，拟杆菌门，放线菌门，这三个门在人体肠道菌群中占支配地位，厌氧菌如拟杆菌属、真杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、消化链球菌属等占了肠道菌群的主要部分，而兼性厌氧菌如乳酸杆菌属、肠球菌属、链球菌属、肠杆菌属等只占了很小的一部分。肠道菌群与宿主构成动态平衡的微生态系统，参与多种生理活动：参与营养物质消化吸收，酵解纤维素、低聚糖等产生可吸收的短链脂肪酸等；参与营养物质合成，合成维生素b族，维生素k、叶酸等；参与免疫调节，肠道菌群在机体免疫发育过程中发挥着重要作用，保持机体免疫功能处于一个适度的活跃状态；参与神经调控，肠道菌群代谢产物中含有γ氨基丁酸与五羟色胺等神经递质，通过肠脑轴调控神经系统功能；参与生长发育与衰老，肠道菌群随着年龄的增长而发生着动态变化；构成肠道黏膜的保护屏障，肠道菌群维持肠道微生态平衡，形成生物屏障，抵御致病菌的侵袭。通过检测肠道菌群的组成情况，可以对个体肠道菌群的评估、干预提供可靠的判断依据。目前检测肠道菌群方法主要包括16srrna测序及荧光定量pcr鉴定。16s测序通过16s通用引物扩增后通过二代测序方法鉴定肠道菌群的丰度，优点是通量较大，准确性高，缺点是操作时间长、建库流程复杂、周期较长、成本较高。荧光定量pcr肠道菌群丰度，通过设计特异性的引物对特定的dna序列进行扩增，灵敏度、特异性高，缺点是通量较小，且引物特异性需要得到保障，优点是成本较低，实验周期较短、且成本较低。肠道菌群组成复杂，且很多菌株极其接近，直接使用荧光pcr对肠道菌群进行扩增，往往存在特异性差，扩增效率低下，现有技术中缺乏可以应对这种复杂样本的引物。如何高通量低成本地检测常见肠道菌群丰度，是一项具有挑战性的工作。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高通量、低成本的常见肠道菌群丰度检测试剂盒。本发明所采取的技术方案是：一种检测肠道常见益生菌丰度的引物组，包括如下序列：faecalibacterium:上游序列：ggtcttcggattgtaaactcctg(seqidno：1)下游序列：gtaattccggacaacgcttgtg(seqidno：2)lactobacillus:上游序列：gtggaactccatgtgtagcgg(seqidno：3)下游序列：ggcggaaaccctccaacac(seqidno：4)bifidobacterium:上游序列：cgggtgagtaatgcgtgacc(seqidno：5)下游序列：tgataggacgcgacccca(seqidno：6)akkermansiamuciniphila:上游序列：cggcacatgatactgcgagac(seqidno：7)下游序列：tcagttaatgtccaggaacccg(seqidno：8)总菌:上游序列：cctacgggaggcagcag(seqidno：9)下游序列：attaccgcggctgctgg。(seqidno：10)一种检测肠道常见益生菌丰度的试剂盒，包括pcr反应体系，其引物组如上所示。作为上述试剂盒的进一步改进，pcr反应体系为qpcr反应体系。作为上述试剂盒的进一步改进，qpcr反应体系的组成为：成分体积(μl)荧光染料5正向引物(2.5μm)0.5反向引物(2.5μm)0.5模板dna(2ng/μl)1udg酶0.01水补足至10μl。作为上述试剂盒的进一步改进，荧光染料为lightcycler480sybrgreenimaster。作为上述试剂盒的进一步改进，pcr的程序包括：作为上述试剂盒的进一步改进，72℃时收集荧光。一种测定肠道常见益生菌丰度的方法，包括：1)提取粪便微生物基因组dna作为模板dna；2)使用权利要求1所述的引物组对模板dna进行扩增；3)根据扩增结果确定肠道常见益生菌丰度。作为上述方法的进一步改进，qpcr反应体系的组成为：成分体积(μl)荧光染料5正向引物(2.5μm)0.5反向引物(2.5μm)0.5模板dna(2ng/μl)1udg酶0.01水补足至10μl。作为上述方法的进一步改进，荧光染料为lightcycler480sybrgreenimaster。作为上述方法的进一步改进，pcr的程序包括：本发明的有益效果是：本发明的引物，扩增特异性好，扩增效率高，可以从复杂的肠道微生物菌群总dna中特异性扩增出相应的益生菌，其结果与成熟的方法相同。本发明的试剂盒，可以实现对常见益生菌的快速、直观的检测，缩短了检测周期，降低了检测成本。附图说明图1是faecalibacterium及其阴性对照的qpcr曲线；图2是lactobacillus及其阴性对照的qpcr曲线；图3是akkermansiamuciniphila及其阴性对照的qpcr曲线；图4是bifidobacterium及其阴性对照的qpcr曲线；图5是总菌及其阴性对照的qpcr曲线；图6是不同扩增产物的凝胶电泳结果；图7分别是faecalibacterium和lactobacillus扩增产物的熔解曲线；图8分别是akkermansiamuciniphila、bifidobacterium和总菌扩增产物的熔解曲线；图9是对照组扩增产物的凝胶电泳结果。具体实施方式发明人通过一系列研究，创造性针对常见肠道菌群16s或其它特异基因设计了一系列引物，并改进实验条件，对pcr扩增步骤进行分步优化，实现对常见肠道菌群的准确检测，检测结果快速、直观、方便进对个体肠道菌群的评估。下面结合实施例，对本发明的技术进行进一步的说明。引物设计难点在于找到细菌基因中具有特异性的序列，细菌的种属复杂，各个种属之间存在着或远或近的亲缘关系，譬如同一个科或属的细菌序列存在着极大的同源性，因此设计的引物往往存在着非特异性的扩增，不能达到特异扩增目标产物的效果。本发明人通过自有技术，从大量的数据中分析并设计、筛选出特异性最好及扩增效率最高的引物，这些引物具有特异性高，没有非特异性扩增的特点，pcr操作本身是较为成熟的，条件根据引物本身的条件而变化。下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。实施例1：引物序列：faecalibacterium:上游序列：ggtcttcggattgtaaactcctg下游序列：gtaattccggacaacgcttgtglactobacillus:上游序列：gtggaactccatgtgtagcgg下游序列：ggcggaaaccctccaacacbifidobacterium:上游序列：cgggtgagtaatgcgtgacc下游序列：tgataggacgcgaccccaakkermansiamuciniphila:上游序列：cggcacatgatactgcgagac下游序列：tcagttaatgtccaggaacccg总菌:上游序列：cctacgggaggcagcag下游序列：attaccgcggctgctgg。qpcr反应体系的组成为：成分体积(μl)荧光染料5正向引物(2.5μm)0.5反向引物(2.5μm)0.5模板dna(2ng/μl)1udg酶0.01水补足至10μl荧光染料为lightcycler480sybrgreenimaster。粪便微生物基因组dna处理和常见肠道菌定量流程提取粪便微生物基因组dna并调整其浓度为2ng/μl；按照qpcr反应体系组成，在光学96孔pcr板中配制qpcr反应体系。每个样本5对引物，每对引物2个反应孔，共10个反应孔。每个pcr板做5个阴性对照(每对引物一个阴性对照)；在荧光定量pcr仪上进行pcr，pcr的程序包括：72℃收集荧光qpcr结束，将baseline置于扩增曲线对数增长期前期，得到各个孔的ct值，去掉数据不可用的孔(ct值大于30，扩增效率低等)，求出同一样本的相同引物做的重复孔的ct值的平均值，用总菌引物得到的平均ct值减去待测菌引物的平均ct值，得到δct值，2δct(2的δct次方)即为待测菌占总菌的比例。标准品浓度梯度：标准品浓度梯度ng/μl，总菌标准品为四种标准品混合按照1:1:1:1混合。引物扩增效果的验证扩增结束后，按如下程序测定其熔解曲线，实验结果：图1～5分别是faecalibacterium、lactobacillus、akkermansiamuciniphila、bifidobacterium和总菌及其阴性对照的qpcr曲线。从图中可以看出，引物具有很好的扩增效率。将标准品梯度稀释，稀释成为1ng/μl，0.1ng/μl,0.01ng/μl,0.001ng/μl，后进行qpcr观察其线性程度，如下表，可见梯度稀释后引物ct值的线性度很好，证明引物在各个浓度条件下均具有良好的扩增效果。pcr产物进行凝胶电泳结果如图6所示，其中fae代表faecalibacterium，lac代表lactobacillus，akk代表akkermansiamuciniphila，bif代表bifidobacterium。从图中可以看出，扩增产物条带单一、清晰，说明扩增产物具有很高的纯度，所使用的引物具有很好的特异性。扩增产物的熔解曲线如图7和图8所示。从图中可以看出，faecalibacterium、lactobacillus、akkermansiamuciniphila、bifidobacterium和总菌的溶解曲线峰都非常单一，引物特异性好。对比例：发明人根据常规方法，针对上述菌群的16srna保守序列设计引物并进行扩增，所使用的引物序列如下：faecalibacterium:上游序列：agatggcctcgcgtccga(seqidno：11)下游序列：ccgaagaccttcttcctcc(seqidno：12)lactobacillus:上游序列：agcagtagggaatcttcca(seqidno：13)下游序列：caccgctacacatggag(seqidno：14)bifidobacterium:上游序列：gggtggtaatgccggatg(seqidno：15)下游序列：taagccatggactttcacacc(seqidno：16)akkermansiamuciniphila:上游序列：gtcatgtgggagcaaattaaaaag(seqidno：17)下游序列：gtatcatgtgccgtccgcg(seqidno：18)扩增产物的凝胶电泳结果如图9所示。从图中可以清楚地看出扩增结果中具有明显的非特异性条件，说明常规方法设计得到的引物特异差，扩增结果不可靠，无法用于常见益生菌的丰度检测。sequencelisting<110>人和未来生物科技（长沙）有限公司<120>一种检测常见益生菌丰度的试剂盒<130><160>18<170>patentinversion3.5<210>1<211>23<212>dna<213>人工引物<400>1ggtcttcggattgtaaactcctg23<210>2<211>22<212>dna<213>人工引物<400>2gtaattccggacaacgcttgtg22<210>3<211>21<212>dna<213>人工引物<400>3gtggaactccatgtgtagcgg21<210>4<211>19<212>dna<213>人工引物<400>4ggcggaaaccctccaacac19<210>5<211>20<212>dna<213>人工引物<400>5cgggtgagtaatgcgtgacc20<210>6<211>18<212>dna<213>人工引物<400>6tgataggacgcgacccca18<210>7<211>21<212>dna<213>人工引物<400>7cggcacatgatactgcgagac21<210>8<211>22<212>dna<213>人工引物<400>8tcagttaatgtccaggaacccg22<210>9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