抗人血清白蛋白单域抗体的制备及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，尤其涉及到一种抗人血清白蛋白单域抗体的制备及其应用。

背景技术：

药代动力学是蛋白质类药物的一个关键参数。通常情况下更长的血清半衰期意味着多肽和蛋白质类药物能够使用更低的剂量并实现更好的治疗效果。目前已有多种技术方法被用来实现此类药物的半衰期延长，包括蛋白质的聚乙二醇化，与igg-fc片段融合，以及与人血清白蛋白融合表达。人血清白蛋白(hsa)由于其半衰期长(19天的血清半衰期)，稳定性好，无免疫原性等特点，已被成功的用于多种融合构建中，包括factorviii，factorix等。然而，共价形式的人血清白蛋白融合蛋白由于其分子量较大，表达水平低，纯化工作困难等原因一定程度上限制了其广泛应用。另一方面，结合人血清白蛋白的单域抗体(vhh抗体)片段可以通过与血清白蛋白的结合，利用游离型和结合型抗体在血浆内形成平衡的特点，实现缓释和长效的作用。而其在增加治疗相关蛋白和多肽的半衰期的应用已通过很多研究及临床试验得到证实。

单域抗体最早是将骆驼及羊驼体内天然存在的缺失轻链的重链抗体可变区序列分离而得的抗体片段。它只包含一个重链可变区序列，是具有完整抗原结合功能的最小抗体片段。自上世纪80年代被发现以来，基于软骨鱼类以及人类重链的单域抗体也被陆续开发，并在诊断试剂和治疗型抗体等领域得到了越来越广泛的应用。比利时的埃博灵克斯公司最早将单域抗体用于治疗型抗体开发，其中有多款产品是用以抗人血清白蛋白为长效因子而构建的融合蛋白。通过这种设计在保持了小分子量、结构简单的分子构型的同时实现了长效性的功能，为治疗型单域抗体的开发提供了必要的基础。

尽管已有埃博灵克斯公司开发的此类单域抗体应用于长效性蛋白药物开发，但对此类抗体的差异性开发包括针对不同结合表位或是不同亲和力的抗体的获得都会对以此为基础的长效性平台系统开发提供更多的选择。此外，由于开发方案的不同，可能通过不同的免疫动物和优化的筛选方法得到性质更为改善的单域抗体，以更好地实现预期的功能。本发明通过周期性的免疫骆驼，促进其产生针对靶抗原的特异性抗体，同时利用噬菌体展示技术和多轮液相淘选，最终得到具有良好特异性、较高亲和力和稳定性的抗人血清白蛋白的单域抗体，该单域抗体能有效延长生物药物的半衰期，有利于生物药在治疗中的有益效果。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种具有良好特异性、较高亲和力和稳定性的抗人血清白蛋白单域抗体，该单域抗体能有效延长生物药物的半衰期，有利于生物药在治疗中的有益效果。

本发明的第一方面，提供了一种抗人血清白蛋白的单域抗体，所述单域抗体的重链可变区包含三个互补决定区，分别为cdr1、cdr2、cdr3，其中：cdr1的氨基酸序列为seqidno：1所示的序列，cdr2的氨基酸序列为seqidno：2所示的序列，cdr3的氨基酸序列为seqidno：3所示的序列。

进一步的，本发明所述单域抗体具有选自seqidno：4或seqidno：5的氨基酸序列。

本发明第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子能编码本发明第一方面所述氨基酸序列为seqidno：4或seqidno：5的单域抗体。

进一步的，所述核酸分子具有选自seqidno：6或seqidno：7的核苷酸序列。

本发明第三方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白为使用本发明第一方面中任一所述的氨基酸序列与一个或一个以上具有治疗功能的多肽分子或片段融合在一起制备所得。

进一步的，所述融合蛋白由各功能多肽直接融合；或通过接头肽连接的含1个或者1个以上治疗功能多肽分子的融合蛋白。

本发明第四方面，提供了一种多特异性或多功能分子，所述的多特异性或多功能分子包含本发明第一方面中任一所述的单域抗体。

本发明第五方面，提供了一种载体，所述载体包含本发明第二方面所述的核酸分子。

进一步的，所述载体选自原核或真核表达载体，优选选自pet22或ppic9k。

本发明第六方面，提供了一种蛋白质或多肽，所述蛋白质或多肽是由本发明第五方面所述的载体通过表达系统进行表达得到；所述表达系统为细菌、酵母菌、丝状真菌、真核哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或无细胞表达系统。

本发明第七方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞能够表达上述的单域抗体、核酸分子、融合蛋白、多特异或多功能分子、载体或蛋白质或多肽。

进一步的，宿主细胞优选选自大肠杆菌工程菌株bl-21或毕赤酵母gs115菌株。

本发明第八方面，提供了一种偶联物，所述偶联物含有本发明第一方面任一所述的单域抗体，以及其他生物活性物质；所述的单域抗体直接或通过连接片段与其他生物活性物质偶联。

本发明第九方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有上述的单域抗体、核酸分子、融合蛋白、多特异性或多功能分子、载体、蛋白质或多肽、宿主细胞或偶联物，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂，以及任选的其他生物活性物质。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过筛选得到具有良好特异性、较高亲和力和稳定性的单域抗体，能特异性的识别人血清白蛋白，延长生物药物半衰期，有利于生物药在治疗中的有益效果。

附图说明

图1为实施例4中iptg诱导表达前后的样品的sds-page分析图，“1”为蛋白分子量标记，“2”为iptg诱导表达前的样品，“3”为iptg诱导表达后的样品，“4”为镍柱洗脱后的纯化蛋白样品。

图2为实施例5中单域抗体nb4与人血清白蛋白结合的biacore传感图以及拟合曲线。

图3为实施例6中多肽-单域抗体nb4融合蛋白纯化前后的样品的sds-page分析图，“1”为蛋白分子量标记，“2”为镍柱纯化后的融合蛋白样品。

图4为实施例7中多肽-单域抗体nb4融合蛋白与两种血清白蛋白的亲和力检测结果。

具体实施方式

以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本领域的技术人员可以明白，根据本申请公开的内容结合本领域技术常识，本申请公开的核苷酸序列和氨基酸序列可以按照本领域常用的其他方法合成，例如通过化学合成的方法得到本申请公开的序列。而且，本领域技术人员可以将本申请获得的新的核苷酸序列构建到任何合适的载体、宿主细胞中。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明作出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。

下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。

实施例1：抗人血清白蛋白单域抗体文库的构建

将人血清白蛋白与弗氏佐剂混合后免疫两只新疆双峰骆驼，每周一次共免疫七次。免疫结束后提取骆驼外周血细胞分离淋巴细胞干冰冷冻送至南京杰克赛斯生物科技有限公司进行单域抗体片段的提取分离。单域抗体片段提取分离的步骤为：提取总rna，逆转录合成cdna后利用巢式pcr扩增单域抗体片段，限制性内切酶酶切后连接进入噬菌体展示载体，电转进入感受态细胞。成功构建了两个独立的抗人血清白蛋白的单域抗体噬菌体展示文库。通过梯度稀释文库涂于平板上计算单克隆数以测定库容，所得两个文库的大小均为约10⁸。从每个文库中随机挑取24颗单克隆进行菌落pcr检测，所建文库空载率均小于5％。

实施例2：抗人血清白蛋白的单域抗体筛选过程

将人血清白蛋白偶联在酶标板上包被过夜，封闭液封闭后加入噬菌体文库，pbst多次洗涤后用tea洗脱液将与人血清白蛋白特异结合的噬菌体解离，并用来感染对数生长期的大肠杆菌细胞，扩大培养噬菌体用于下一轮筛选。每个文库经过三轮bio-panning后均获得大于500倍的富集，达到了利用噬菌体展示技术筛取抗体库中结合人血清白蛋白特异性抗体的目的。

实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法(elisa)筛选特异性单个阳性克隆

从两文库中随机选取600个单菌落接种培养，生长至对数期后，iptg诱导表达，离心收集菌体后利用渗透冲击法从周质中获得粗提抗体，加入已包被人血清白蛋白的酶标板中孵育，pbst洗板后分别以mouseanti-hatag抗体为一抗，羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体(goatanti-mousealkalinephosphataseconjugate)为二抗结合，加入碱性磷酸酶显色并读取吸光度值，将od值大于对照孔3倍以上的样品孔判定为阳性对照孔。将所有阳性克隆培养，提取质粒并进行测序，获得多个单域抗体序列，其中一条命名为nb4，其氨基酸序列如序列表中seqid：4所示。采用单域抗体人源化通用框架移植法，对nb4单域抗体进行人源化，获得多个nb4单域抗体的人源化变体，其中一株命名为nb4-m2，其氨基酸序列如序列表中seqid：5所示。

实施例4：单域抗体在宿主菌大肠杆菌中的表达和纯化

(1)单域抗体的表达：根据前面获得的2株单域抗体nb4和nb4-m2的氨基酸序列，经大肠杆菌密码子优化后合成重组蛋白基因片段并连入pet-22表达载体，将该重组质粒转化至bl-21感受态菌株(bio-rad)表达带c-端6xhistag的重组蛋白。将转化后的bl-21阳性克隆菌株接种到lb培养基培养至od600达到0.7左右，随后加入iptg(终浓度1mm)于28℃、220rpm进行诱导表达过夜。离心(8000×g，15min，4℃)收集菌体。随后使用渗透压法处理细胞以提取周质蛋白，获得抗体粗提液，保存于4℃。

(2)单域抗体的纯化：将周质蛋白粗提液用0.22μm滤膜过滤，上样进入pbs缓冲液平衡的镍柱(实验室填装)，pbs+5％洗脱缓冲液(300mm咪唑)洗柱，并收集洗脱峰。在iptg诱导表达前后的样品中加入上样缓冲液，于沸水浴处理5min，通过sds-page检测目的重组蛋白的表达。图1是iptg诱导表达前后的样品的sds-page分析图，其中“1”为蛋白分子量标记，“2”为iptg诱导表达前的样品，“3”为iptg诱导表达后的样品，“4”为镍柱洗脱后的纯化蛋白。结果显示：单域抗体经过该纯化后，经sec确认纯度达到90％以上。

实施例5：人血清白蛋白-单域抗体的亲和力测定

本发明所涉及的单域抗体nb4与其抗原人血清白蛋白的亲和力数值由基于表面等离子共振(surfaceplasmonresonance,spr)的生物大分子相互作用biacore方法来测定，具体的实验流程为：使用s系列cm5芯片(ge)将配体(hsa)稀释于不同ph值的醋酸钠缓冲液中，依次流过芯片表面，根据配体预富集的结果，选择合适的偶联条件。采用氨基偶联的方法使用edc/nhs活化芯片表面，将用适当的偶联缓冲液稀释的配体偶联于芯片表面，然后通过乙醇胺封闭。将单域抗体nb4作为分析物稀释至不同浓度，并依次流过空白参比通道和活化通道，产生的信号值则反映了分析物与配体间的特异性结合。分析物进样240s，随后hbs-ep+buffer进样120s，使分析物从配体上部分解离。然后用再生溶液对分析物进行再生。不同浓度的分析物重复进样、解离、再生。由biacoret200记录的数据采用biacoret200evaluationsoftware进行分析得出亲和力数据。图2给出了单域抗体nb4与人血清白蛋白结合的biacore传感图以及拟合曲线数据，解离平衡常数测定为：kd＝2.446x10^-10m，结果表明单域抗体nb4与人血清白蛋白具有很强的结合。

实施例6：多肽-单域抗体nb4融合蛋白的表达和纯化

将其它多肽分子与单域抗体nb4通过(g4s)3柔性连接子与活性多肽相连成融合蛋白，并在c端加6x组氨酸标签，合成融合蛋白基因片段，亚克隆至ppic9k表达载体，并将重组质粒电转化进入毕赤酵母gs115菌株中进行重组蛋白的表达，具体的方法是：将包含外源基因的ppic9k载体用saci限制性内切酶进行线性化，与毕赤酵母gs115感受态细胞混合后使用电转仪进行电转化，将转化后细胞涂md平板，30℃培养3天，挑多个单克隆于3mlypd培养基中，待od2-6时，离心，弃上清后加入3mlbmmy，并加1％的甲醇进行诱导，每24h加1％的甲醇，共诱导72h，收集发酵液上清进行sds-page分析。对有表达的酵母菌株用g418抗生素进行高拷贝筛选。将md平板上的菌落用无菌水洗下来，转移至g418浓度分别为0.5，1.0，2.0，4.0mg/ml的ypd板上，30℃培养3天，挑最高浓度平板上的菌落进行表达鉴定，选取表达量最高的菌株进行放大培养表达。使用与实施例4中相同的镍柱纯化方法纯化融合蛋白，将纯化前后的样品中加入上样缓冲液，于沸水浴处理5min，通过sds-page检测目的蛋白的表达和纯化效果。图3是纯化前后的样品的sds-page分析图，其中“1”为蛋白分子量标记，“2”为镍柱纯化后的融合蛋白样品，经sec确认纯度达到90％以上。结果显示：包含单域抗体nb4的融合蛋白可以由酵母表达系统实现高表达，并由亲和层析方法进行简单有效的纯化。

实施例7：多肽-单域抗体nb4融合蛋白与血清蛋白亲和力检测

检测了多肽-单域抗体nb4融合蛋白与两种动物血清白蛋白的结合情况，使用在biacore8k仪器上的表面等离振子共振，进行多肽-单域抗体nb4融合蛋白与人血清白蛋白和小鼠血清白蛋白(msa)的动力学分析。将多肽-单域抗体nb4融合蛋白固定到cm5芯片表面，待芯片表面稳定之后，将梯度稀释的分析物以一定流速流经固定了配体的芯片表面，不同浓度的分析物重复进样、解离、再生。多肽-单域抗体nb4融合蛋白与两种血清白蛋白的亲和力检测结果见图4。结果显示，多肽-单域抗体nb4融合蛋白保留了与hsa的特异性结合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>瑞阳（苏州）生物科技有限公司

<120>抗人血清白蛋白单域抗体的制备及其应用

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