本发明涉及化学合成领域，具体而言，涉及一种化合物、制备方法及应用。
背景技术：
抗生素的耐药性问题已引起全球的广泛关注，对抗生素耐药的主要原因是细菌遗传特征的突变，抗生素的滥用加速了耐药性的产生，因而细菌产生了越来越强的耐药性，“超级细菌”对人类生命造成巨大危害。因此研发新型抗菌药物，解决耐药性问题刻不容缓。抗菌药物虽然于上世纪四十年代被发现，但其作用机理和耐药机理近年来才得以了解。
脂肪酸生物合成是所有生物体中的必须过程。脂肪酸合成酶作为靶点的提出，为研发新型抗菌药物提供了可靠的理论依据。β-酮脂酰-acp合成酶ⅲ(betaketoyl-acpsynthetaseiii，fabh)控制着脂肪酸生物合成的起始步骤，普遍存在于病原体中，且在人体内无其同源蛋白；再加上革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的fabh在蛋白序列和结构上的高度保守性，使得抑制fabh酶活性的小分子抑制剂有望成为对细菌具选择性且对人体无毒的广谱抗菌药。
席夫碱主要是含有亚胺或甲亚胺特性基团(-rc＝n-)的一类有机化合物，通常是由胺和活性羧基缩合而成。席夫碱类化合物及其金属配合物在医学、催化、分析化学、腐蚀以及光致变色领域的重要应用。在医学领域，席夫碱具有抑菌、杀菌、抗肿瘤、抗病毒的生物活性，其抗菌活性好，抗菌谱广，且不易产生耐药性，有很好的应用价值。由于某些席夫碱具有特殊的生理活性，近年来，越来越引起医药界的重视。据报道，氨基酸类、缩氨脲类、缩胺类、杂环类、腙类席夫碱及其应用的配合物具有抑菌、杀菌、抗肿瘤、抗病毒等独特药用效果。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种化合物，所述的化合物为含有噻唑和吡唑骨架的席夫碱化合物，利用计算机辅助药物设计方法设计出化合物，并通过了分子对接方法检测出其与fabh有较大的结合能，可作为fabh抑制剂，并具有较好的抗菌活性、低毒性和低溶血性等优点。
本发明的第二目的在于提供一种所述的化合物的制备方法，该方法设计合理，合成的化合物稳定。
本发明的第三目的在于提供上述化合物的应用。
为了研发潜在fabh抑制剂，采用discoverystudio(ds)分子模拟计算平台的软件进行基于结构的药物设计(包括分子对接、配体-蛋白质相互作用和全新药物设计)以及基于小分子的药物设计(包括药效团、定量构效关系、admet、数据库筛选)等，通过组合化学原理，将具有抑制fabh活性的席夫碱、噻唑和吡唑结合，构建了用于新药分子合成的小分子化合物数据库，并根据库中化合物与fabh蛋白的作用模式及靶标选择性初步确定目标化合物。
具体的，本发明涉及一种化学式如下所示的化合物：
其中，r1选自ch3、f和cf3的一种；r2选自h、2-cl、3-cl、4-cl、3,4-cl、4-ch3、4-f和4-ar的一种。
本发明的一个方面还涉及上述化合物的制备方法，包括以下步骤：
本发明的一个方面还涉及上述的化合物在制备fabh抑制剂中的应用。
本发明的一个方面还涉及r1为f，r2为3,4-cl或r1为f，r2为4-cl或r1为ch3，r2为3,4-cl或r1为cf3，r2为3,4-cl的上述化合物在制备广谱性抗菌剂中的应用。
根据r1和r2的不同，共有24种化合物(详见表1)。
表1含噻唑和吡唑骨架的席夫碱类化合物与取代基的对应表
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本申请合成了24种新型潜在fabh抑制剂，与fabh均有很好的结合能力，是fabh抑制剂潜在先导化合物。
(2)抗菌活性好的化合物其e.colifabh酶抑制活性也较好。
具体实施方式
一种化学式如下所示的化合物：
其中，r1选自ch3、f和cf3的一种；r2选自h、2-cl、3-cl、4-cl、3,4-cl、4-ch3、4-f和4-ar的一种。
上述化合物为含有噻唑和吡唑骨架的席夫碱类化合物。以组合化学为基础，设计出上述化合物。
在一些实施方式中，r2位置为对位。
在一些实施方式中，r2位置为间位。
在一些实施方式中，r2位置为邻位。
在一些实施方式中，r1为f。
在一些实施方式中，r2为3,4-cl。
在一些实施方式中，所述r1为f，r2为3,4-cl。
在一些实施方式中，所述r1为f，r2为4-cl。
在一些实施方式中，所述r1为ch3，r2为3,4-cl。
在一些实施方式中，所述r1为cf3，r2为3,4-cl。
吡唑是一类含有两个处于相邻位置氮原子的五元杂环，其结构有多个可修饰位置(1，3，4，5位)，能较容易地进行吡唑类衍生物多样性的合成。吡唑类衍生物具有广泛的生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗血管生成、消炎、抗抑郁等。吡唑衍生物在抗菌药物开发方面也有着重要的应用。
噻唑是一类典型的杂环有机化合物。噻唑环广泛存在于生物活性化合物中，包括天然产物和合成药物。噻唑及其衍生物具有广泛的应用功能，是一类具有广谱生物活性的杂环化合物，如抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、治疗过敏、降压、抗炎等。
所谓“组合化学”是一种将化学合成、计算机辅助与分子合成设计结成一体的技术。可以在短时间内将不同结构的基础模块以共价键系统地、反复地进行连接，从而产生大批相关的化合物，然后进行性能筛选，选出具有目标性能或活性的化合物。免除了化合物的单独合成及结构性能测定，简化了发现具有目标性能化合物的过程。
计算机辅助药物设计是(computer-aideddrugdesign)是以计算机化学为基础，通过计算机的模拟、计算和预算药物与受体生物大分子之间的关系，设计和优化先导化合物的方法。其优点是可以提高药物研发的成功率，降低研发成本，缩短研发周期，是目前创新研究药物的核心技术之一。基于配体结构的药物设计(structure-baseddrugdesign，sbdd)是计算机辅助药物设计(computer-aideddrugdesign，cadd)的重要分支，尤其是基于药物作用的受体生物大分子三维结构的药物设计，在活性先导化合物的发现和优化研究中具有更为重要的地位。
基于席夫碱类衍生物具有包括抗菌活性在内的广泛的药理活性以及fabh抑制活性的了解，选择席夫碱作为抗菌药物的小分子母核；然后根据组合化学原理，将具有药理学性质的吡唑、噻唑类小分子引入到席夫碱母核中，设计出24个不同取代基的含噻唑和吡唑骨架的席夫碱类衍生物。
将筛选得到的24种化合物进行分子模拟对接实验，通过化合物和fabh结合时所释放的能量大小，比较化合物与靶点蛋白分子之间结合紧密程度。结果显示，这24种化合物均能和fabh自发结合且结合程度也比较紧密。其中结合程度最大的为13号，即r1为f，r2为3,4-cl；然后是12号，即r1为f，r2为4-cl；再次为5号，即r1为ch3，r2为3,4-cl；接着为18号，即r1为cf3，r2为2-cl等。
上述化合物对fabh均有较好的结合能力，是fabh抑制剂潜在先导化合物。对革兰氏阴性菌的抑制效果优于革兰氏阳性菌，说明革兰氏阴性菌对此类化合物敏感。其中的4个化合物(5,12,13,21)具有广谱性抑制作用，并得出结论：在r1位置处引入氟取代基可以增强抑菌效果，r2位置处引入吸电子取代基可增强抗菌活性，r2位置对抗菌效果影响的顺序为：对位>间位>邻位，且r2位置处引入双取代基团可以增强抗菌活性。抗菌活性好的化合物其e.colifabh酶抑制活性也较好。
上述化合物的结构表征如下：
(e)-4-phenyl-2-(2-((1-phenyl-3-(p-tolyl)-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(1)
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(e)-4-(2-chlorophenyl)-2-(2-((1-phenyl-3-(p-tolyl)-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(2)
brownpowder,yield:90％.m.p:205-206℃,1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:2.41(s,3h)；7.32-7.3(m,2h)；7.39-7.45(m,2h)；7.51-7.54(m,1h)；7.55-7.60(m,2h)；7.84-7.88(m,1h)；7.92(d,j＝5.6,2h)；8.02(d,j＝5.2,2h)；8.10(d,j＝5.2,2h)；8.20(s,1h)；8.98(s,1h)；12.00(s,1h).esi-ms:469.99(c26h20cln5s,[m+h]+).anal.calcdfor:c26h20cln5s:c,66.45；h,4.29；n,14.90；found:c,66.40；h,4.32；n,14.88.
(e)-4-(3-chlorophenyl)-2-(2-((1-phenyl-3-(p-tolyl)-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(3)
yellowpowder,yield:87％.m.p:205-206℃,1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:2.42(s,3h)；7.31-7.35(m,4h)；7.39-7.43(m,2h)；7.50-7.54(m,2h)；7.75(d,j＝5.6,1h)；7.81-7.84(m,3h)；7.93(d,j＝4.8,2h)；8.10-8.12(m,1h)；8.89-8.91(m,1h).esi-ms:469.99(c26h20cln5s,[m+h]+).anal.calcdforc26h20cln5s:c,68.32；h,4.13；n,15.93；found:c,68.29；h,4.15；n,15.91.
(e)-4-(4-chlorophenyl)-2-(2-((1-phenyl-3-(p-tolyl)-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(4)
brownpowder,yield:85％.m.p:205-206℃,1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:2.41(s,3h)；7.34-7.39(m,4h)；7.47(d,j＝5.6,2h)；7.54-7.56(m,2h)；7.69(d,j＝5.6,2h)；7.86-7.88(m,2h)；7.99-8.01(m,2h)；8.17(s,1h)；8.88(s,1h).esi-ms:469.99(c26h20cln5s,[m+h]+).anal.calcdforc26h20cln5s:c,66.45；h,4.29；n,14.90；found:c,66.41；h,4.30；n,14.91.
(e)-4-(3,4-dichlorophenyl)-2-(2-((1-phenyl-3-(p-tolyl)-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(5)
brownpowder,yield:88％.m.p:205-206℃,1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:2.40(s,3h)；7.34-7.39(m,3h)；7.53-7.56(m,3h)；7.66-7.69(m,3h)；7.83(d,j＝5.6,2h)；7.99(d,j＝5.6,2h)；8.07(s,1h)；8.13-8.16(m,1h)；8.88-8.93(m,1h).esi-ms:504.43(c26h19cl2n5s,[m+h]+).anal.calcdforc26h19cl2n5s:c,61.91；h,3.80；n,13.88；found:c,61.93；h,3.82；n,13.85.
(e)-2-(2-((1-phenyl-3-(p-tolyl)-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)-4-(p-tolyl)thiazole(6)
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(e)-4-(4-fluorophenyl)-2-(2-((1-phenyl-3-(p-tolyl)-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(7)
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(e)-4-([1,1’-biphenyl]-4-yl)-2-(2-((1-phenyl-3-(p-tolyl)-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(8)
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(e)-2-(2-((3-(4-fluorophenyl)-1-phenyl-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)-4-phenylthiazole(9)
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(e)-4-(2-chlorophenyl)-2-(2-((3-(4-fluorophenyl)-1-phenyl-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(10)
brownpowder,yield:87％.m.p:205-206℃,1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:7.30-7.35(m,2h)；7.36-7.39(m,2h)；7.50-7.52(m,1h)；7.54-7.56(m,2h)；7.82-7.87(m,1h)；7.88(d,j＝5.6,2h)；7.96(d,j＝5.2,2h)；8.05(d,j＝5.2,2h)；8.15(s,1h)；8.94(s,1h)；11.89(s,1h).esi-ms:473.95(c25h17clfn5s,[m+h]+).anal.calcdfor:c25h17clfn5s:c,63.36；h,3.62；n,14.78；found:c,63.33；h,3.65；n,14.80.
(e)-4-(3-chlorophenyl)-2-(2-((3-(4-fluorophenyl)-1-phenyl-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(11)
yellowpowder,yield:95％.m.p:205-206℃,1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:7.35-7.39(m,4h)；7.42-7.46(m,2h)；7.54-7.56(m,2h)；7.81(d,j＝5.6,1h)；7.86-7.89(m,3h)；7.98(d,j＝4.8,2h)；8.12-8.15(m,1h)；8.92-8.95(m,1h).esi-ms:473.95(c25h17clfn5s,[m+h]+).anal.calcdforc25h17clfn5s:c,63.36；h,3.62；n,14.78；found:c,63.33；h,3.65；n,14.80.
(e)-4-(4-chlorophenyl)-2-(2-((3-(4-fluorophenyl)-1-phenyl-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(12)
brownpowder,yield:87％.m.p:205-206℃,1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:7.37(s,4h)；7.46(d,j＝5.2,2h)；7.54-7.56(m,2h)；7.86(d,j＝4.8,4h)；7.98(d,j＝5.2,2h)；8.15(s,1h)；8.91(s,1h).esi-ms:473.95(c25h17clfn5s,[m+h]+).anal.calcdforc25h17clfn5s:c,63.36；h,3.62；n,14.78；found:c,63.40；h,3.59；n,14.80.
(e)-4-(3,4-dichlorophenyl)-2-(2-((3-(4-fluorophenyl)-1-phenyl-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(13)
brownpowder,yield:88％.m.p:205-206℃,1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:7.35-7.39(m,3h)；7.53-7.56(m,3h)；7.67(d,j＝5.6,1h)；7.82-7.84(m,1h)；7.85-7.88(m,2h)；7.98(d,j＝5.2,2h)；8.07(d,j＝1.6,1h)；8.15(s,1h)；8.92(s,1h).esi-ms:508.40(c25h16cl2fn5s,[m+h]+).anal.calcdforc25h16cl2fn5s:c,59.06；h,3.17；n,13.78；found:c,59.08；h,3.15；n,13.80.
(e)-2-(2-((3-(4-fluorophenyl)-1-phenyl-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)-4-(p-tolyl)thiazole(14)
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(e)-4-(4-fluorophenyl)-2-(2-((3-(4-fluorophenyl)-1-phenyl-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(15)
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(e)-4-(2-chlorophenyl)-2-(2-((3-(4-fluorophenyl)-1-phenyl-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(16)
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(e)-4-phenyl-2-(2-((1-phenyl-3-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(17)
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(e)-4-(2-chlorophenyl)-2-(2-((1-phenyl-3-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(18)
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(e)-4-(3-chlorophenyl)-2-(2-((1-phenyl-3-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(19)
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(e)-4-(4-chlorophenyl)-2-(2-((1-phenyl-3-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(20)
brownpowder,yield:85％.m.p:205-206℃,1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:7.39-7.42(m,2h)；7.47(d,j＝5.6,2h)；7.56-7.58(m,2h)；7.86-7.90(m,4h)；7.99-8.01(m,2h)；8.07(d,j＝5.6,2h)；8.20(s,1h)；8.97(s,1h).esi-ms:523.96(c26h17clf3n5s,[m+h]+).anal.calcdforc26h17clf3n5s:c,59.60；h,3.27；n,13.37；found:c,59.55；h,3.30；n,13.40.
(e)-4-(3,4-dichlorophenyl)-2-(2-((1-phenyl-3-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(21)
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(e)-2-(2-((1-phenyl-3-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)-4-(p-tolyl)thiazole(22)
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(e)-4-(4-fluorophenyl)-2-(2-((1-phenyl-3-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(23)
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(e)-4-([1,1’-biphenyl]-4-yl)-2-(2-((1-phenyl-3-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1h-pyrazol-4-yl)methylene)hydrazinyl)thiazole(24)
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本发明的另一方面涉及上述化合物的制备方法，包括以下步骤：
在一些实施方式中，式i在弱碱条件下进行，所述弱碱为乙酸钠、乙酸钾的一种。
将盐酸苯肼即化合物2混合于弱碱溶液中，逐滴加入苯乙酮衍生物即化合物1，室温下反应后过滤，滤渣晾干后得化合物3，马上进行式ii反应。
通过式i反应，完成r1和席夫碱的结合。
在一些实施方式中，式ii在dmf和pocl3的混合溶液中进行。
在一些实施方式中，所述pocl3和dmf的体积比为1：2.8～3.2。
pocl3的纯度在99％以上。dmf即n，n-二甲基甲酰胺，纯度在99.5％以上。在一些实施例中，所述pocl3和dmf的体积比还可以为1：3.0等(此范围内结果基本一致)。
在一些实施方式中，式ii的反应条件为：57℃～59℃回流后，0℃～1℃下过滤得化合物4。
在冰浴条件下，将pocl3滴入到dmf中进行混合，化合物3先溶于dmf中，再滴加入pocl3和dmf的混合液中，57℃～59℃回流反应后，加冰抽滤，得到化合物4。在一些实施例中，所述回流的温度还可以为58℃等(此范围内结果基本一致)。
通过式ii反应，将吡唑骨架引物化合物中。
在一些实施方式中，式iii反应的溶剂为乙醇。
在一些实施方式中，所述反应在79℃～81℃下回流进行。
在一些实施方式中，所述回流后，盐酸滴定至ph4～5，过滤得化合物5。
将化合物4与氨基硫脲在溶剂中混合，加入乙酸，79℃～81℃下回流反应后，盐酸滴定ph值4～5，用玻璃漏斗过滤得到化合物5。在一些实施例中，所述回流的温度还可以为80℃等(此范围内结果基本一致)。在一些实施例中，所述盐酸滴定ph值还可以为4.1、4.2、4.3、4.5、4.6、4.8、4.9等(此范围内结果基本一致)。
式iii反应中，将氨基硫脲引入到化合物中，为下一步生成噻唑做准备。
在一些实施方式中，式iv反应的溶剂为乙醇。
将化合物5和2-溴代苯乙酮衍生物即化合物6在溶剂中混合反应，析出的固体为最终化合物。
式iv反应中，通过2-溴代苯乙酮衍生物成功将噻唑和r2引入到化合物中，至此完成带取代基的含噻唑和吡唑骨架的席夫碱类衍生物的合成。
在一些实施方式中，上述的化合物在制备fabh抑制剂中的应用。
在一些实施方式中，r1为f，r2为3,4-cl或r1为f，r2为4-cl或r1为ch3，r2为3,4-cl或r1为cf3，r2为3,4-cl的上述化合物在制备广谱性抗菌剂中的应用。
广谱抗菌剂的菌为大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
药品试剂均为分析纯，购于阿拉丁公司。
实施例
将5.3g盐酸苯肼和5g乙酸钠在50ml水溶剂中搅拌半小时，再逐滴加入5ml苯乙酮衍生物，在室温下搅拌3小时，用玻璃漏斗过滤，滤渣晾干马上投入下个反应。
将10mlpocl3滴入30mldmf中(冰浴)，将上步反应产物溶于dmf中，再滴加入dmf和pocl3的混合液中，移入58℃回流，反应5小时后，倒入常温中用水稀释，加冰，进行抽滤，滤渣过夜烘干。
将上步反应产物与氨基硫脲溶解在50ml乙醇中，加入1ml的乙酸，80℃下回流反应2小时，倒入常温中用水稀释，盐酸滴定ph值至4～5，用玻璃漏斗过滤。
将上步反应产物与2-溴代苯乙酮衍生物在50ml乙醇中室温反应2小时，反应析出的固体为最终产物。
实验例1
化合物和靶点蛋白的结合能力。
经计算机辅助设计出24种含噻唑和吡唑骨架的席夫碱类化合物，再通过分子对接虚拟筛选验证化合物和fabh的结合力。
在分子模拟对接的结果中，结合能δg即cdockerenergy反映的是化合物与靶点蛋白分子之间结合紧密程度的一个数值。δg表示两者结合时所释放的能量大小，正值表示两者的结合需要吸收能量，负值表示两者结合时释放能量。需要吸收能量的结合需要外界有能量注入才会启动两者的结合，而释放能量的结合是自发进行的。而能量的绝对值越大，就表明结合释放的能量较多，结合自发的程度越高，也就意味着结合过程也越容易。反过来，能量的绝对值越大，将两者分开所需要的能量越大，也就意味着化合物和靶点蛋白越难分开。通过批量运算的方法模拟对接，预测的24个含不同取代基的席夫碱类衍生物与fabh的结合能见表2。
表224个化合物与fabh结合的分子模拟参数
dccp即二氯-1,2-二硫环戊烯酮，为阳性对照。
从表中可以看出，24个化合物与fabh的结合能δg均为绝对值较大的负值，这表明两者的结合不仅自发进行，而且结合程度也是比较紧密的，说明它们有通过与fabh蛋白分子结合产生抗菌活性的潜力。其中结合程度最大的为13号，即r1为氟原子，r2为3,4-cl；然后是12号，即r1为氟原子，r2为4-cl；再次为5号，即r1为ch3，r2为3,4-cl；接着为18号，即r1为cf3，r2为2-cl等。
实验例2
抗菌活性检测。
用96孔反应板上进行的ttc二倍稀释法检测。
(1)准备测试菌悬液
用mh液体培养基于台式恒温振荡器中37℃常规培养四种测试用细菌(金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌和铜绿假单胞菌)过夜，用mh培养液体培养基稀释1000倍，使菌液浓度约为1×104-1×105cfu/ml；加入ttc溶液混匀，使终浓度为25mg/l。
(2)待检化合物母液和阳性对照药物配制与保存：将合成的潜在fabh抑制剂溶于dmso中，配制成1mg/ml的母液，-20℃保存。
(3)二倍稀释法稀释待检化合物：抗性活性检测前，将冻存的待检化合物和阳性对照母液置35℃温箱融化；然后先将用dmso将母液稀释4倍，使其浓度成为250μg/ml；再在96孔板上应用二倍稀释法稀释成如下一系列浓度：250μg/ml，125μg/ml，62.5μg/ml，31.25μg/ml，15.63μg/ml，7.81μg/ml，3.91μg/ml，1.95μg/ml。每系列3孔，每孔100μl。
(4)测定最小抑菌浓度mic
在上述已稀释好药液的96孔板上，另各设3个孔卡那霉素和3个孔二氯-1,2-二硫环戊烯酮(ddcp)作为阳性对照，每孔加药液100μl；再设3个只加溶剂dmso的空白对照。向除了空白对照孔的各孔中加入100μl测试菌悬液，混匀。此外还设置了只加菌不加药物的3个孔。此时，待检物又被菌液稀释了1倍，终浓度变为125μg/ml，62.5μg/ml，31.25μg/ml，15.63μg/ml，7.81μg/ml，3.91μg/ml、1.95μg/ml、0.98μg/ml、0.49μg/ml。将96孔板置37℃培养箱中培养12-24h。
(5)结果判断：37℃培养箱中培养12-24h后，观察孔内悬液颜色，判断是否有抑菌作用。判断原则是：红色，说明细菌未被抑制；无色，说明细菌被抑制。而能够产生抑菌作用的最小药液浓度即为最小抑菌浓度。
实验结果见表3。
表324个化合物的抗菌活性(mic)
其中，采用ddcp和卡那霉素作为阳性对照。
从表3中可看出，所有化合物对革兰氏阴性菌的抑制效果均优于革兰氏阳性菌，说明革兰氏阴性菌对此类化合物敏感。
通过引入不同位置的取代基，评估其抗菌活性。在r2位置处引入不同位置的取代基，从抗菌数据得出对位>间位>邻位(4＞3＞2,12＞11＞10,20＞19＞18)。
通过引入不同数量的取代基，评估其抗菌活性。有两个氯取代基的化合物13比有一个氯取代基的化合物12抗菌效果好，表明在r2位置处引入双取代基团可以增强抗菌活性。
实验例3
e.colifabh酶抑制活性实验。
方法原理是fabh是催化乙酰coa和holo-acp反应的限速反应酶，因此需要表达fabh和holo-acp。
一、fabh酶、acp和acps基因克隆与表达质粒的构建
用总dna提取纯化试剂盒，按照试剂盒说明书的要求，提取大肠杆菌的总dna；以总dna为模板，根据大肠杆菌fabh的基因序列设计引物，fabh扩增基因；用pmd19-t克隆载体进行ta克隆并转化大肠杆菌dh5α，筛选阳性克隆。提取质粒，利用fabh引物中设计的酶切位点，使用相应的限制性内切酶，将fabh基因片段从pmd19-t载体上克隆至表达载体pet28b上，构建重组表达质粒。
根据大肠杆菌酰基载体蛋白(acp)和酰基载体蛋白酶(acps)的基因序列设计引物，fabh分别扩增acp和acpsdna片段。回收上述两种dna片段，经taqdna聚合酶催化末端加尾后，分别连接至pmd19-t载体并转化大肠杆菌dh5α菌株，筛选阳性克隆，抽提质粒。根据引物中设计的限制性内切酶位点，使用相应的限制性内切酶，将acp和acps基因片段从pmd19-t载体上克隆至表达载体pet28b上，构建acp表达质粒pet-acp-acps。
二、fabh的表达及纯化
用携带fabh基因的重组表达质粒转化大肠杆菌株bl21(de3)，挑选单菌落，在含有相应抗生素的lb培养液中37℃振荡过夜培养。转接1％的过夜培养液于新鲜的lb(含卡那霉素50mg/ml)中，37℃振荡培养4h后，添加ipttg，继续诱导4h，收集菌体。之后蛋白质纯化的各步操作均在4℃进行。使用裂解缓冲液(50mmol/lnah2po4，300mmol/lnacl和10mmol/l咪唑，ph8.0)悬浮菌体，超声波破碎细胞，在15000g的离心力条件下4℃离心20分钟，收集上清，上清液与1ml琼脂糖4℃混合1h，过柱收集流出液，接着用预冷的洗涤缓冲液(50mmol/lnah2po4，300mmol/lnacl和200mmol/limidazole，ph8.0)洗涤层析柱，再用预冷的洗脱缓冲液(50mmol/lnah2po4，300mmol/lnacl和200mmol/limidazole，ph8.0)洗脱并收集洗脱液，将收集的蛋白质液装入透析袋中，置于1000ml透析液(50mmol/lnah2po4，300mmol/lnacl，ph8.0，1mmol/lβ-硫基乙醇)，4℃透析过夜。收集透析袋内溶液，sds-page法鉴定分子量及纯度后置于-80℃冰箱中保存。
三、acp的表达与纯化
细菌细胞中新生的acp蛋白是apo-acp，需要在acps的催化下，方能转变为holo-acp。菌株bl21(de3)/pet-acp-acps中，由于质粒pet-acp-acps携带有acps基因，在细胞中表达acps，能转化较多的apo-acp。因此，holo-acp的产量较高。大肠杆菌acp是一种酸性可溶蛋白，根据这一特性釆用强阴离子交换树脂(unosphereq)，以licl梯度洗脱方法纯化了bl21(de3)/pet-acp-acps的holo-acp。
fabh抑制活性实验
检测用化合物配制：配置母液化合物(10mg/ml)，先用500μldmem加10μl母液配置出最高浓度，后续5倍梯度稀释(100μl前一浓度的药液加400μldmem)，得到200μg/ml、40μg/ml、8μg/ml和1.6μg/ml的待测化合物。
(2)在无菌离心管中，加入20μl含有0.5mmdtt，0.25mmmgcl2，2.5μmholo-acp的20mmna2hpo4/nah2po4溶液，再加入1nmfabh。
(3)温育1分钟后，加入2μl含有25μm乙酰-coa(acetyl-coa)和0.75μci[3h]acetyl-coa混合液，并且加入各个浓度待测化合物，反应25分钟。每个处理设置3个重复，并且设置ddcp阳性对照和空白对照。加入20μl用冰预冷的50％tca停止反应，在培养5分钟，离心得到片状蛋白。用10％冰预冷的tca清洗后，用5μl0.5mnaoh再悬浮。用液体闪烁仪测量最终产物中的3h信号，得到比活度。
(4)ic50值的计算：抑制率＝(比活度空白-比活度样品)/比活度空白。将设定的几个浓度及其对应的抑制率平均值导入origin软件，制作拟合曲线，找到抑制率为0.5时所对应的浓度即为ic50值。
实验结果见表4。
表424个化合物e.colifabh酶抑制活性实验(ic50)
从表4中可看出，得到的数据与之前所得的抗菌活性数据也具有基本一致的趋势，抗菌活性好的化合物其e.colifabh酶抑制活性也较好，抗菌活性较好的化合物的ic50值为1.25±0.23-26.88±0.13μm；与a组和c组相比，b组(化合物9-16)在r1位置处引入氟取代基表现出较好的大肠杆菌fabh的抑制活性，这表明r1位置处引入氟取代基(卤素基团)有利于增强大肠杆菌fabh抑制活性；通过数据得出在苯环的对位位置引入双吸电子基团可以增强大肠杆菌fabh抑制活性(12>11>10,12>15>14)。
因为此类化合物的fabh的抑制与抑菌活性有一定的正相关性，可以推测化合物的抑菌能力与其对fabh酶抑制有关，有必要进行进一步的验证实验和安全性检测。
实验例4
细胞毒性检测和溶血实验。
参考wangsf的文章(wangsfyiny,qiaof,etal.synthesis,moleculardockingandbiologicalevaluationofmetronidazolederivativescontainingpiperazineskeletonaspotentialantibacterialagents.[j].bioorganic&medicinalchemistry,2014,22(21):5727-5737.)，用mtt比色法评价化合物对人肾上皮细胞293t的细胞毒作用。用cc50值(使50％细胞死亡时的药物浓度)反映细胞毒作用的强弱。cc50的计算方法为改良寇式法：lgcc50＝xm-i(p-(3-pm-pn)/4)。xm＝lg最大浓度；i＝lg(最大浓度/相邻浓度)；p＝od值之和；pm:最大od值；pn:最小od值。计算出的cc50值越大说明使50％细胞死亡时的药物浓度越高，也就是说毒性越小。
进行体外试管溶血实验。离心后观察细胞悬液颜色，细胞悬液呈淡黄色不透明状，则该试验结果为不溶血；悬液呈透明红色，试管底部只有少量或无细胞残留物，则可判断为溶血；溶液中有絮状物产生且摇之不散，则判断该溶液发生细胞凝聚。
实验结果见下表。
表5席夫碱类衍生物的细胞毒性与溶血实验
从表5中可看出所有化合物的细胞毒性都很低，且呈现低溶血效应，其中化合物13的cc50为167.36±0.29μm，与阳性对照ddcp(cc50＝165.56±0.13μm)相似，说明是其可作为安全的fabh抑制剂。
综上，含吡唑和噻唑骨架的席夫碱类衍生物对革兰氏阴性菌有选择性抑制作用，多数化合物有一定的e.colifabh酶抑制活性，其中化合物13在抗菌能力和酶抑制能力上表现最为突出(mic＝0.49、0.98、1.95和1.95μg/ml，ic50＝0.54±0.24μm)，与阳性对照相比，可以作为先导化合物，具有良好的研究前景。所有化合物均具有低毒性和低溶血性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。