橡胶树谷氧还蛋白HbGRX在橡胶树抗死皮品种选育领域中的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程
技术领域：
，具体涉及一种橡胶树谷氧还蛋白hbgrx，并进一步公开其在橡胶树抗死皮品种选育及橡胶树死皮防控领域中的应用。
背景技术：
：植物在生长发育过程中会受到诸如病原攻击、光氧化、重金属、干旱、极端温度等多种生物及非生物胁迫现象，这些胁迫会在一定程度上刺激植物体内产生活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)，而过多的活性氧积累则会引起蛋白质、dna和脂类的氧化损伤，并进而引起细胞死亡(apelandhirt，2004)。为了应对这类氧化胁迫现象，植物自身会进化出一套复杂的抗氧化系统来消除ros带来的损伤，实现自身的保护和修复。谷氧还蛋白即是植物自身产生的用于自身抗氧化胁迫的一类还原酶。谷氧还蛋白(glutaredoxin,grx)属于硫氧还蛋白超家族，是在生物体中广泛存在的依赖于谷胱甘肽(gsh)的小分子氧化还原酶类，广泛存在于各种原核和真核生物体内。作为一种巯基转移酶，它能够催化巯基-二硫键交换反应或者还原蛋白质谷胱甘肽二硫化物，以维持胞内的氧化还原态势，并在活性氧清除和生物大分子氧化损伤修复中发挥着重要作用(rouhieretal.,2004；meyeretal.,2012；stroherandmillar,2012)。根据氨基酸序列和活性位点的不同，grxs通常可以分为三个主要类型，即cpyc型、cgfs型以及cc型(rouhieretal.2004)。其中，cpyc型和cgfs型grxs通常存在于所有原核和真核生物中，而cc型grxs则是陆生植物所特有的产物(lemaire2004；rouhieretal.2006；xingetal.2006)。研究显示，植物grxs具有多种功能，能够参与植物发育、生物及非生物胁迫应答、铁硫簇的装配与转运等过程(xingetal.2005；ndamukongetal.2007；bandyopadhyayetal.2008；sundarametal.2009；wuetal.2012；li,etal.2014；huetal.2015；knuestingetal.2015；yangetal.2015；yuetal.2017；ningetal.2018；黄淦等，2017；郭玉双等，2017)。拟南芥(arabidopsisthaliana)中grxs家族成员共有31个(rouhieretal.,2006)，其中一些基因的功能已被鉴定，它们在植物发育、胁迫应答及激素信号调节等方面发挥重要作用。据报道，拟南芥grxc7/roxy1基因能够调节花瓣的发育，其突变体表现出花瓣和花原基异常的表型(xingetal.,2005)；拟南芥grxc8/roxy2与grxc7功能冗余，通过与tga因子相互作用调节花药的发育(murmuetal.,2010)。而水稻(oryzasativa)基因组中至今共发现了48个编码grx蛋白的基因，表达分析也暗示了grx基因在水稻生长发育、植物激素应答、生物及非生物胁迫中扮演重要角色(gargetal.,2010)，而过量表达水稻osgrx20基因能显著增强其对白叶枯病的抗性及对甲基紫精和盐胁迫的耐性(ningetal.2018)。此外，在木本植物杨树(populustrichocarpa)和木薯(manihotesculenta)基因组中也分别发现了36个和38个grx基因(rouhieretal.,2006；杨义伶，2016)，而有关橡胶树中grx基因的功能研究则从未见报道。橡胶树是重要的热带经济作物，是天然橡胶(顺式聚异戊二烯)的主要生产载体，在国民经济和国防建设中发挥重要作用，具有重要的经济价值。橡胶树死皮(tappingpaneldryness,tpd)是指乳管细胞丧失部分或全部产胶能力的现象，其症状为割线排胶减少甚至会导致完全停排。橡胶树死皮现象严重影响了包括我国在内的全球橡胶树的单位面积产量。据估计，我国橡胶树死皮发生率平均在20％以上，部分胶园甚至高达40％，由死皮导致的干胶损失可达到12-14％左右，每年因此减少了大量的干胶产量。高死皮率抵消了多项栽培措施的增产效率，严重阻滞了我国天然橡胶生产能力的增长，并严重影响到我国橡胶树的胶乳产量，是我国天然橡胶产业面临的重大科学问题。现有技术中多通过外加康复营养剂的方式对橡胶树死皮进行防治，一方面增加了橡胶树种植的工作量，而且防治的效果也参差不齐，防治效果并不稳定，而利用基因工程手段进行橡胶树死皮的防控技术则鲜有报道。另外，如果能从分子水平进行抗死皮性能橡胶树品种的选育，选育出抗死皮性能较优的橡胶树品种进行培育，对于橡胶产业的发展具有积极的意义，而现有技术中对于抗死皮橡胶树品种分子选育技术更是鲜有报道。技术实现要素：为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种橡胶树谷氧还蛋白hbgrx，并进一步公开其在分子选育抗死皮橡胶树新品种及橡胶树死皮防控领域中的应用。为解决上述技术问题，本发明公开了一种橡胶树谷氧还蛋白hbgrx在分子选育抗死皮橡胶树品种领域中的应用，所述橡胶树谷氧还蛋白hbgrx具有如seqidno.2所示的氨基酸序列。具体的，编码所述橡胶树谷氧还蛋白hbgrx的基因，具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。本发明还公开了含有所述橡胶树谷氧还蛋白hbgrx基因的表达载体在分子选育抗死皮橡胶树品种领域中的应用。所述表达载体为橡胶树谷氧还蛋白hbgrx基因插入到质粒pcambia1302中形成的重组质粒pcambia1302-hbgrx-gfp。本发明还公开了所述橡胶树谷氧还蛋白hbgrx用于制备抗死皮品种选育的分子标记物的用途，所述橡胶树谷氧还蛋白hbgrx具有如seqidno.2所示的氨基酸序列。进一步的，编码所述橡胶树谷氧还蛋白hbgrx的基因，具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。本发明还公开了一种分子选育抗死皮橡胶树品种的方法，包括如下步骤：(1)选取不同品种的橡胶树，并割取各品种橡胶树的死皮树树皮；(2)提取各品种死皮树树皮的总rna，并经反转录得到cdna第一链；(3)以提取的cdna第一链为模板，设计hbgrx-qf和hbgrx-qr为荧光定量引物，以提取的橡胶树18srrna为内参基因，采用实时定量rt-pcr法分析hbgrx基因在上述不同品种死皮树树皮中的表达模式；其中，荧光定量引物序列为：hbgrx-qf：5’-cgtttcttccaattctgttgtcgtt-3’；hbgrx-qr：5’-caatgtgcttgccactgatg-3’；(4)根据测定的实时定量rt-pcr结果进行分析，筛选出高表达hbgrx基因的品种，即为所需的抗死皮橡胶树品种。本发明还公开了橡胶树谷氧还蛋白hbgrx在橡胶树死皮防控领域中的应用，所述橡胶树谷氧还蛋白hbgrx具有如seqidno.2所示的氨基酸序列。进一步的，编码所述橡胶树谷氧还蛋白hbgrx的基因，具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。本发明还公开了一种橡胶树死皮防控方法，包括如下步骤：(1)配制橡胶树死皮康复营养液喷施于橡胶树死皮树割面，用于使死皮树恢复产胶，并采集死皮树恢复产胶前、后割面树皮；(2)采集提取树皮的总rna，经反转录处理得到cdna第一链；(3)以得到的cdna第一链为模板，以hbgrx-qf和hbgrx-qr为荧光定量引物，以橡胶树18srrna为内参基因，采用实时定量rt-pcr方法分析hbgrx基因在死皮树恢复产胶前、后割面树皮中的表达情况；其中，荧光定量引物序列为：hbgrx-qf：5’-cgtttcttccaattctgttgtcgtt-3’；hbgrx-qr：5’-caatgtgcttgccactgatg-3’；(4)根据实时定量rt-pcr分析结果，监控hbgrx基因在死皮树恢复产胶后表达量的变化情况。本发明通过对橡胶树谷氧还蛋白hbgrx进行基因克隆，并对其生物学信息及表达性能进行分析研究，探明其在橡胶树死皮树中的表达表现出明显下调趋势，可见，grx作为一种活性氧清除酶，能有效清除乳管细胞活性氧的大量积累，其与橡胶树死皮的发生具有密切的相关性，可有效应用于橡胶树死皮防控领域，并为阐明橡胶树死皮发生机制奠定了强大的理论基础，更为橡胶树死皮防控技术的研发及通过分子选育培育抗死皮橡胶树新品种提供科学依据，可有效进行橡胶树抗死皮品种的选育之用。附图说明为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，图1为hbgrx蛋白与其他植物grx蛋白的序列比对；其中，ricinuscommunis(rcgrx，xp002524673.1，蓖麻)，manihotesculenta(megrx，xp021594601.1，木薯)，jatrophacurcas(jcgrx，np001295635.1，麻疯树)，populustrichocarpa(ptgrx，xp002298529.2，毛果杨)，arabidopsisthaliana(atgrx，np198853.1，拟南芥)，triticumaestivum(tagrx，aap80853.1，小麦)，vitisvinifera(vvgrx，xp002276266.1，葡萄)，完全相同或部分保守的氨基酸分别用黑色或灰色阴影显示，硫氧还蛋白超家族保守结构域，gsh结合位点和活性位点分别用直线、星号以及箭头表示；图2为本发明所述橡胶树hbgrx蛋白与其他植物grx蛋白的系统进化树分析；其中，蛋白及相应的登录号如下：manihotesculenta(megrx，xp021594601.1，木薯)，ricinuscommunis(rcgrx，xp002524673.1，蓖麻)，populustrichocarpa(ptgrx，xp002298529.2，毛果杨)，prunusmume(pmgrx，xp008230572.1，梅)，arabidopsisthaliana(atgrx，np198853.1，拟南芥)，jatrophacurcas(jcgrx，np001295635.1，麻疯树)，theobromacacao(tcgrx，xp007031532.1，可可)，juglansregia(jrgrx，xp018842397.1，胡桃)，solanumpennellii(spgrx，xp015077482.1，番茄)，nicotianaattenuate(nagrx，xp019224739.1，烟草)，morusnotabilis(mngrx，xp024029530.1，川桑)，vitisvinifera(vvgrx，xp002276266.1，葡萄)，triticumaestivum(tagrx，aap80853.1，小麦)，elaeisguineensis(eggrx，xp010940165.1，油棕)，zeamays(zmgrx，np001158948.1，玉米)，oryzasativa(osgrx，xp015626005.1，水稻)；图3为本发明hbgrx蛋白的亚细胞定位结果；图4为本发明hbgrx基因在不同组织中的表达分析结果；图5为hbgrx基因在不同死皮程度植株树皮(a)和胶乳(b)中的表达模式；图6为hbgrx基因在机械伤害、双氧水和不同激素处理后胶乳中的表达分析，其中，wounding(机械伤害)，h2o2(双氧水)，et(乙烯利)，meja(茉莉酸甲酯)，aba(脱落酸)，sa(水杨酸)，2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸)，ga3(赤霉素)，6-ba(细胞分裂素)，iaa(吲哚乙酸)；图7为hbgrx基因在橡胶树不同品种死皮树中的表达模式。具体实施方式实验材料选择及处理取橡胶树不同组织，包括叶片、叶柄、嫰枝木质部、树皮、胶乳、雄花和雌花进行研究。上述实验材料均来源于海南省儋州市中国热带农业科学院试验场5队，品系为无性系热研7-33-97，2006年定植，2013年开割，割制为s/2、d/3。橡胶树不同死皮程度植株树皮和胶乳材料来源于海南省儋州市中国热带农业科学院试验场6队10号林段，1992年定植，品种为热研7-33-97，割制为s/2、d/3。在林段中选取树围、长势基本一致的健康树和不同死皮程度植株作为实验材料。健康树标记为死皮程度0，死皮长度小于割线总长度的1/4标记为死皮程度1、死皮长度在割线总长度的1/4～1/2标记为死皮程度2、死皮长度大于割线总长度的1/2标记为死皮程度3，分别采集树皮和胶乳作为实验材料。机械伤害、h2o2和激素处理所使用的实验材料为上述试验场5队橡胶树无性系热研7-33-97。机械伤害处理参照tangetal.等(tangetal.，2010)的方法进行。分别采用h2o2和不同激素，包括脱落酸(aba)、水杨酸(sa)、细胞分裂素(6-ba)、赤霉素(ga3)、生长素(2-4-d)、吲哚乙酸(iaa)、乙烯利(et)和茉莉酸甲酯(meja)处理植株0h、6h、12h、24h、48h后进行胶乳样品的采集。另取不同品种的橡胶树，包括热研7-33-97、热垦523、热研8-79和pr107，均来源于海南省儋州市中国热带农业科学院试验场金富队，4个品种均定植于2006年，2013年开割，且均采用相同割制(s/2d/3)割胶。采集不同品种死皮树(死皮程度3)树皮作为实验材料。实施例1总rna提取与cdna第一链合成巴西橡胶树胶乳总rna的提取参照tang等(tangetal.，2007)的方法(tangc.,qij.,lih.,zhangc.,wangy.,2007.aconvenientandefficientprotocolforisolatinghigh-qualityrnafromlatexofheveabrasiliensis(pararubbertree).j.biochem.biophys.methods70(5),749-754.)。除胶乳外其它材料的总rna提取使用tiangen公司的植物总rna提取试剂盒，操作方法参照试剂盒说明书。cdna第一链合成使用fementas公司逆转录试剂盒(revertaidfirststrandcdnasynthesiskit)，按照公司操作说明进行。实施例2hbgrx基因的生物信息学分析在前期研究中，已经从蛋白质组学水平鉴定了一个在死皮树中表达明显下调(同健康树相比)的橡胶树谷氧还蛋白hbgrx(其登录号abz88803.1/eu295478.1)，其氨基酸序列如seqidno.2所示，编码所述橡胶树谷氧还蛋白hbgrx的基因序列如seqidno.1所示。应用expasy在线工具proparam(http://www.expasy.org/tools)分析hbgrx蛋白的各种氨基酸含量，理论分子量和等电点等理化参数；运用ncbi的cdd(conserveddomaindatabase)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)预测蛋白质的保守结构域；利用signalp4.1server(http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp/)预测蛋白质的信号肽；利用tmhmmserverv.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/)预测蛋白质的跨膜结构；采用sopma(https://npsa-prabi.ibcp.fr)进行二级结构分析；对序列进行blast比对分析，选择与hbgrx同源的其他植物grx氨基酸序列，利用dnaman(v5.10)软件进行多重序列比对。运用primer5.0软件对hbgrx基因进行相关引物设计(见下表1所示)，以反转录后的胶乳cdna为模板，hbgrx-f/r为引物克隆hbgrx基因orf全长。pcr反应条件为：98℃预变性2min；98℃变性20s，59℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳回收后连接pmd-18t载体并转化大肠杆菌感受态细胞bl21，通过菌落pcr鉴定后，挑取阳性单克隆送往公司测序。表1引物序列表引物名称引物序列(5’→3’)用途hbgrx-fatggcgatgaccaaggccaagorf克隆hbgrx-rtttaagcagaagccttagcaagagctccorf克隆1302-hbgrx-fctcccatggatggcgatgaccaaggccaag亚细胞定位1302-hbgrx-rcgcactagtttaagcagaagccttagcaagagctcc亚细胞定位hbgrx-qfcgtttcttccaattctgttgtcgtt荧光定量rt-pcr分析hbgrx-qrcaatgtgcttgccactgatg荧光定量rt-pcr分析hb18srrna-qfgctcgaagacgatcagatacc荧光定量rt-pcr分析hb18srrna-qrttcagccttgcgaccatac荧光定量rt-pcr分析下划线表示限制性酶切位点以上述反转录得到的胶乳cdna为模板进行pcr扩增，获得hbgrx基因的完整开放阅读框(orf)，orf大小为324bp，编码由107个氨基酸组成的蛋白质，其预测蛋白分子量为11.3kd，等电点(pi)为6.71。在氨基酸组成方面，丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、赖氨酸(k)、亮氨酸(l)、甘氨酸(g)、丙氨酸(a)含量最高均为9.3％。色氨酸(w)和精氨酸(r)含量最低仅为0.9％。带负电荷残基(asp+glu)数和带正电荷残基(arg+lys)数都为11，该蛋白的不稳定系数(ii)为34.27，脂肪系数(ai)为81.12，平均亲水系数(gravy)为-0.111，表明该蛋白为亲水性蛋白。通过ncbicdd数据库预测分析显示，hbgrx蛋白为cpyc型谷氧还蛋白，活性位点为保守序列cpyc，并具有gsh结合位点，属于硫氧还蛋白超家族，该蛋白无信号肽和跨膜结构。二级结构中α-螺旋(α-helix)占47.66％，β-转角(β-turn)占7.48％，无规卷曲(randomcoil)占30.84％，扩展链(extendedstrand)占14.02％。采用dnaman软件对hbgrx蛋白与其他植物cpy(f)c型谷氧还蛋白进行氨基酸序列比对，结果见附图1所示。结果显示，橡胶树hbgrx蛋白序列与木薯megrx、蓖麻rcgrx、麻疯树jcgrx、杨树ptgrx、拟南芥atgrx、小麦tagrx和葡萄vvgrx的氨基酸序列相似性分别为84.11％、77.57％、75.23％、73.39％、71.17％、64.60％和68.42％，活性(催化)位点均为保守序列cpyc(cpfc)，并在蛋白序列上具有gsh结合位点，属于硫氧还蛋白超家族(thioredoxin-likesupperfamily)，这些结果进一步证明本实施例克隆的基因为橡胶树谷氧还蛋白基因。从ncbi数据库下载其他植物的grx蛋白序列，选取ncbi数据库中其他16条cpy(f)c型植物谷氧还蛋白与橡胶树hbgrx蛋白，利用软件mega6.0，选择neighbour-joining(nj)模型，进行1000次bootstrap统计学检验，构建包括hbgrx蛋白序列在内的植物grx蛋白系统进化树，结果见附图2所示。聚类结果显示，橡胶树hbgrx蛋白与大戟科植物木薯megrx、蓖麻rcgrx亲缘关系最近，与水稻、玉米亲缘关系较远，表明hbgrx与megrx和rcgrx在进化上更为保守。实施例3hbgrx蛋白的亚细胞定位根据目的基因hbgrx序列设计亚细胞定位的引物1302-hbgrx-f和1302-hbgrx-r(见表1所示)，以正常树胶乳cdna为模板进行pcr扩增，并对pcr产物和pcambia1302载体分别用限制性内切酶ncoi/spei进行双酶切，回收酶切产物后用t4-dna连接酶将目的片段和载体片段进行连接，从而得到植物表达载体pcambia1302-hbgrx-gfp，按照常规方法转化大肠杆菌bl21感受态细胞后，挑取单克隆扩大培养，经pcr和质粒双酶切验证后，进行测序分析，将测序正确的阳性克隆质粒(pcambia1302-hbgrx-gfp)以及空载体(pcambia1302-gfp)分别转入农杆菌eha105中，将转化成功的农杆菌用注射器注射至烟草叶片下表皮细胞中，培养2-5d，随后采用激光共聚焦显微镜(fluoviewtmfv1000)对侵染烟草叶片进行荧光检测。将构建的hbgrx基因的植物表达载体pcambia1302-hbgrx-gfp以及空载体(pcambia1302-gfp)分别转入农杆菌中，将转化成功的农杆菌注射至烟草下表皮细胞中，在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白信号在细胞内的分布，结果如图3所示。结果显示，pcambia1302-hbgrx-gfp的融合蛋白仅在细胞核中表达，表明hbgrx蛋白定位在细胞核上。实施例4实时荧光定量pcr分析根据hbgrx基因序列设计特异性荧光定量引物hbgrx-qf和hbgrx-qr，引物序列见表1。以不同样品反转录cdna稀释5倍后为模板,反应体系为20μl，包括1μlcdna模板、0.4μl正向引物、0.4μl反向引物、10μlsybrpremixextaqii(2×)，用ddh2o稀释到20μl。pcr反应程序为：94℃预变性30s；94℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s，45个循环。以橡胶树18srrna为内参基因(见表1)，每个样品设置3个重复。采用2-δδct法计算基因相对表达量。数据处理与作图采用origin9.0软件，相对表达量结果为3次重复的平均值±sd。采用实时定量rt-pcr分析hbgrx基因在不同组织、不同死皮程度树皮和胶乳、机械伤害、h2o2和不同激素处理条件下表达模式。hbgrx基因在不同组织中的表达分析采用实时荧光定量rt-pcr技术对hbgrx基因在橡胶树不同组织中的表达模式进行分析(结果见图4所示)。结果显示，hbgrx基因的表达具有组织特异性。在不同组织中均有表达，其表达存在差异。hbgrx基因在雄花(maleflower)中的表达量最高，接下来依次是木质部xylem)、树皮(bark)、胶乳(latex)、雌花(femaleflower)、叶柄(petiole)，在叶片(leaf)中的表达量最低。hbgrx基因在不同死皮程度橡胶树树皮和胶乳中的表达分析根据荧光定量rt-pcr分析结果表明，同健康树相比，不同死皮程度植株树皮和胶乳中hbgrx基因的表达量均显著下降(p<0.05)。随着死皮程度的增加，hbgrx基因在树皮中的表达量呈显著下降的趋势(如图5中a所示)，而在胶乳中的表达量呈先下降后略微上升的趋势(如图5中b所示)，hbgrx基因在死皮程度1、2和3植株的胶乳中表达量无明显变化。hbgrx基因在不同处理后胶乳中的表达分析根据图6所示的荧光定量rt-pcr分析结果表明，机械伤害、h2o2和不同激素均能调控hbgrx基因的表达。hbgrx基因在伤害和双氧水(h2o2)处理后，均呈相同的表达趋势，即先下降后上升，然后再下降又上升的趋势(图6中a-b所示)。在乙烯(et)及茉莉酸甲脂(meja)处理后，表达量总体呈下降趋势，其中在et处理0-12h内，表达量呈显著下降趋势，在24-48h，表达量趋于稳定(图6中c-d所示)。在脱落酸(aba)和水杨酸(sa)处理后的表达趋势一致，均呈先上升后下降，然后再上升又下降的趋势(图6中e-f所示)。总的来看，hbgrx基因在植物激素2，4-d、ga3、6-ba和iaa处理后均呈先上调后下降的表达趋势(图6中g-j所示)。在2,4-d和ga3处理后，hbgrx基因表达量显著上升，6h时均达到最高值，随后表达量下降(图6中g-h所示)。6-ba处理后，hbgrx基因表达显著上调，在12h表达量达最大值，12h后表达显著下调，24-48h，表达量趋于稳定(图6中i所示)。iaa处理后，hbgrx基因表达量显著增加，直至处理24h时表达量达到最高值，随后显著下调表达(图6中j所示)。实施例5hbgrx基因在不同品种死皮树中的表达模式分析采用实时荧光定量rt-pcr技术对hbgrx基因在橡胶树不同品种死皮树中的表达模式进行分析。本实施例中，橡胶树不同品种包括热研7-33-97、热垦523、热研8-79和pr107，均来源于海南省儋州市中国热带农业科学院试验场金富队，4个品种均定植于2006年，2013年开割，且均采用相同割制(s/2d/3)割胶。采集不同品种死皮树(死皮程度3)树皮作为实验材料。同时，统计4个品种死皮率(死皮植株数占总株数的百分比)。采用实时荧光定量rt-pcr技术对hbgrx基因在橡胶树不同品种死皮树中的表达模式进行分析，具体步骤包括：(1)在海南省儋州市中国热带农业科学院试验场金富队，采集上述橡胶树品种的死皮树树皮作为实验材料，同时，统计4个品种死皮率(死皮植株数占总株数的百分比)见下表2所示；(2)采用常规方法提取各个树皮样品的总rna，并经过反转录得到cdna第一链；(3)以提取的cdna第一链为模板，设计hbgrx-qf和hbgrx-qr为荧光定量引物，并以橡胶树18srrna为内参基因，采用实时定量rt-pcr分析hbgrx基因在上述4个品种死皮树树皮中的表达模式；其中，荧光定量引物序列为：hbgrx-qf：5’-cgtttcttccaattctgttgtcgtt-3’；hbgrx-qr：5’-caatgtgcttgccactgatg-3’；(4)采用实时荧光定量rt-pcr技术对hbgrx基因在橡胶树不同品种死皮树中的表达模式的分析结果见图7所示。表2不同品种死皮率品种总株数死皮株数死皮率热研7-33-97873540.23％热垦523441431.82％热研8-791353525.93％pr107631422.22％结果显示，hbgrx基因在热研7-33-97死皮树中表达量最低，其次是热垦523和热研8-79，在pr107死皮树中的表达量最高，即表达量由低到高的顺序依次为：热研7-33-97<热垦523<热研8-79<pr107。不同品种死皮率结果如表2所示，热研7-33-97死皮率最高为40.23％，其次是热垦523和热研8-79，死皮率分别为31.82％和25.93％，pr107的死皮率最低，为22.22％，即死皮率由高到低的顺序依次为：热研7-33-97>热垦523>热研8-79>pr107，这一结果说明，4个品种中，热研7-33-97是最易发生死皮的品种，pr107是最抗死皮的品种，而热垦523和热研8-79对死皮的抗性介于热研7-33-97和pr107之间，热垦523和热研8-79相比，后者较前者更抗死皮。综合图7和表2的结果可以看出，hbgrx基因在最抗死皮品种pr107死皮树中表达量最高，在最易死皮品种热研7-33-97死皮树中表达量最低，在中抗品种热垦523和热研8-79中表达量介于热研7-33-97和pr107之间。上述研究结果表明，hbgrx基因可以作为抗死皮品种选育培育的分子标记物。实施例6橡胶树的抗死皮防控处理本实施例所述橡胶树的抗死皮防控处理方法，包括如下步骤：(1)将橡胶树死皮康复营养液(按照中国专利201310554320.7中公开的橡胶树死皮康复营养液)喷施于上述不同品种的死皮树割面用于使死皮树恢复产胶，并采集死皮树恢复产胶前、后割面树皮；(2)按照前述方法提取树皮总rna，反转录得到cdna第一链；(3)以cdna第一链为模板，hbgrx-qf和hbgrx-qr为荧光定量引物；引物序列为：hbgrx-qf：5’-cgtttcttccaattctgttgtcgtt-3’；hbgrx-qr：5’-caatgtgcttgccactgatg-3’；以橡胶树18srrna为内参基因，采用实时定量rt-pcr分析hbgrx基因在死皮树恢复产胶前后割面树皮中的表达；(4)实时定量rt-pcr分析结果显示，hbgrx基因在死皮树恢复产胶后表达量上调，表明hbgrx基因受死皮康复营养液处理诱导表达，在死皮恢复过程中扮演重要角色。可见，本发明所述橡胶树谷氧还蛋白hbgrx在橡胶树死皮树中表达明显下调，可见，grx作为一种活性氧清除酶，与橡胶树死皮发生密切相关，对橡胶树抗死皮品种的分子选育以及死皮防控技术具有重要的意义。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。序列表<110>中国热带农业科学院橡胶研究所<120>橡胶树谷氧还蛋白hbgrx在橡胶树抗死皮品种选育领域中的应用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>324<212>dna<213>hbgrx<400>1atggcgatgaccaaggccaaggagctcgtttcttccaattctgttgtcgttttcagcaag60acgtactgcccctattgcacgagcgtgaagaagcttttggatgaattgggagccaattat120aagaccgtggagttggatactgagggcgatggaagtcaggtacaatcagcattggcagag180tggactggacaacgatctgtgccgaatgttttcatcagtggcaagcacattggtggctgt240gacacaacaacaggcatgcataaggaaggaaagctaattcctctgctcactgaagctgga300gctcttgctaaggcttctgcttaa324<210>2<211>107<212>prt<213>hbgrx<400>2metalametthrlysalalysgluleuvalserserasnservalval151015valpheserlysthrtyrcysprotyrcysthrservallyslysleu202530leuaspgluleuglyalaasntyrlysthrvalgluleuaspthrglu354045glyaspglyserglnvalglnseralaleualaglutrpthrglygln505560argservalproasnvalpheileserglylyshisileglyglycys65707580aspthrthrthrglymethislysgluglylysleuileproleuleu859095thrglualaglyalaleualalysalaserala100105当前第1页12