本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种羰基还原酶ebsdr8突变体及其构建方法和应用。
背景技术：
手性醇是手性碳上连有羟基的旋光性化合物。羟基能够被转换为多种其他功能基团的性质使手性醇成为最重要的手性砌块之一，因此，具有光学活性的手性醇被广泛用于合成手性药物、精细化学品和农用化学品等。潜手性酮的不对称还原是制备光学活性手性醇的重要方法，理论上能将底物酮100％转化为单一对映体的手性醇，具有很高的工业应用价值。其中，生物催化潜手性酮不对称还原合成手性醇因具有理论产率高、选择性好、副产物少和反应条件温和等优点而成为手性醇绿色合成的优选途径。
在具有催化不对称还原潜手性酮活性的酶中，短链脱氢酶由于其催化底物谱广、热稳定性好以及有机溶剂耐受性强等特点而备受关注。短链脱氢酶催化潜手性酮还原制备高光学纯度手性醇已有诸多报道。目前，已有实验筛选得到一株能够以anti-prelog立体选择性催化潜手性酮还原的菌株短稳杆菌zjuy-1401(empedobacterbreciszjuy-1401)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctccno:m2014520(专利公开号cn1-5316250a)；并从其基因组中挖掘并克隆表达了遵循anti-prelog规则高立体选择性还原潜手性酮的短链脱氢酶ebsdr8(专利公开号cn105238768a)。但是该短链脱氢酶在催化脂肪族潜手性二酮(如2,3丁二酮，2,4-戊二酮)活性较低，因此有必要通过相关技术提高该酶在催化脂肪族潜手性二酮上的效率以充分发掘其应用价值。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种羰基还原酶ebsdr8突变体及其构建方法和应用，提高羰基还原酶ebsdr8的催化活性。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
本发明提供一种羰基还原酶ebsdr8突变体，在羰基还原酶ebsdr8的如seqidno.2所示的氨基酸序列中具有97位丙氨酸或160位赖氨酸中的单点突变或两点组合突变，其中，97位丙氨酸突变为亮氨酸，具有如seqidno.4所示氨基酸序列；160位赖氨酸突变为谷氨酸，具有如seqidno.6所示氨基酸序列。
进一步地，在羰基还原酶ebsdr8的如seqidno.2所示的氨基酸系列中具有两点组合突变，其中，97位丙氨酸突变为亮氨酸，160位赖氨酸突变为谷氨酸，具有如seqidno.8所示氨基酸序列。
本发明还提供一种羰基还原酶ebsdr8突变体的构建方法，包括以下步骤：(1)确定羰基还原酶ebsdr8突变位点为如seqidno.2所示氨基酸序列的97为丙氨酸、169为赖氨酸，设计突变引物，进行突变pcr；(2)将pcr后的重组表达载体进行dpni酶切处理并转化至宿主微生物中，获得基因工程菌；(3)将步骤(2)中获得的基因工程菌接种至培养基中培养，在异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷的诱导下，表达重组羰基还原酶突变体。
进一步地，所述步骤(1)的所述突变引物为：
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进一步地，所述步骤(1)中的突变pcr的反应条件为：在98℃条件下预变性1min；再进入温度循环98℃、10s，55℃、10s，72℃、7min，循环20次后冷却至4℃。
进一步地，所述步骤(3)的具体实施步骤如下：(a)：将含所述羰基还原酶ebsdr8突变体编码基因的所述重组基因工程菌接种至含50μg/ml卡那霉素的斜面培养基，在37℃培养8～16h，获得斜面菌体；(b)：将所述斜面菌体接种至种子培养基，在37℃培养8～10h，获得种子液；(c)：将所述种子液以体积浓度10％的接种量接种至无菌发酵罐中，37℃发酵培养至od600达到0.5～0.7时，将终浓度为0.1～10mm异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷添加到所述无菌发酵罐中于26℃下诱导培养。
本发明还提供一种羰基还原酶ebsdr8突变体在脂肪族潜手性二酮还原中的应用，脂肪族潜手性二酮为底物，以nadh或nadph为辅酶，20～50℃下于ph5.5～10.5的缓冲液构成的转化反应体系中反应，反应完全后，将反应液分离纯化得到相应产物。
进一步地，所述转化反应体系中，所述脂肪族潜手性二酮的初始浓度为10～1000mmol/l。
进一步地，所述转化反应体系中所述羰基还原酶ebsdr8突变体的浓度为10～500g/l。
进一步地，所述转化反应体系中还包括二甲亚砜、异丙醇、甲醇中的一种或多种有机溶剂。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明中提供的羰基还原酶ebsdr8突变体及羰基还原酶ebsdr8突变体的构建方法中的使羰基还原酶ebsdr8活性较高的突变位点，从而使羰基还原酶ebsdr8具有更高的催化活性，在催化脂肪族潜手性二酮时转化率达60％～99.9％，产率70％～98％，光学纯度大于99％，具有很好的应用开发前景。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
本发明提供一种羰基还原酶ebsdr8突变体，该羰基还原酶ebsdr8具有如seqidno.2所示的氨基酸序列，具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。羰基还原酶ebsdr8突变体是在seqidno.2所示羰基还原酶ebsdr8氨基酸序列基础上含有如下几个位点的单点突变或多点组合突变：97位丙氨酸、128位谷氨酰胺、160位赖氨酸、197位天冬酰胺，但是128位谷氨酰胺和197位天冬酰胺处突变体的催化效果较差。
优选地，如seqidno.2所示的氨基酸序列中具有97位丙氨酸或160位赖氨酸中的单点突变或两点组合突变，其中，97位丙氨酸突变为亮氨酸，具有如seqidno.4所示氨基酸序列；160位赖氨酸突变为谷氨酸，具有如seqidno.6所示氨基酸序列。
进一步地，在羰基还原酶ebsdr8的如seqidno.2所示的氨基酸系列中具有两点组合突变，组合突变具有更优的催化活性，其中，97位丙氨酸突变为亮氨酸，160位赖氨酸突变为谷氨酸，具有如seqidno.8所示氨基酸序列。
本发明还提供一种羰基还原酶ebsdr8突变体的构建方法，包括以下步骤：
步骤(1)：确定羰基还原酶ebsdr8突变位点为如seqidno.2所示氨基酸序列的97为丙氨酸、160为赖氨酸，设计突变引物，其中突变引物为：
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然后进行突变pcr，其中突变pcr的反应条件为：在98℃条件下预变性1min；再进入温度循环98℃、10s，55℃、10s，72℃、7min，循环20次后冷却至4℃。
具体地，羰基还原酶ebsdr8突变体的编码基因中，突变体a97l核苷酸序列如序列表中seqidno.3所示，其编码的氨基酸序列如序列表seqidno.4所示；突变体k160e核苷酸如序列表中seqidno.5所示，其编码的氨基酸序列如序列表seqidno.6所示；突变体a97l/k160e核苷酸序列如序列表中seqidno.7所示，其编码的氨基酸序列如序列表seqidno.8所示。
其中，本发明的羰基还原酶突变体基因的核苷酸序列的重组表达载体可通过本领域常规方法将羰基还原酶突变体核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pet-30a。
步骤(2)：将pcr后的重组表达载体进行dpni酶切处理并转化至宿主微生物中，获得基因工程菌。应当理解的是，表达重组羰基还原酶突变体的基因工程菌，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的羰基还原酶突变体基因可以有效表达，本发明不限于此。本发明优选大肠杆菌，更优选为大肠杆菌e.colibl21(de3)。
步骤(3)：将步骤(2)中获得的基因工程菌接种至培养基中培养，在异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷的诱导下，表达重组羰基还原酶突变体。具体地，将培养重组表达转化体，诱导获得重组羰基还原酶突变体蛋白。其中，所述的培养基重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本发明的羰基还原酶突变体蛋白的培养基，优选lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，ph7.2。应当理解的是，培养方法和培养条件只要使转化体能够生长并产生羰基还原酶突变体蛋白即可，本发明不限于此。优选下述方法：将重组大肠杆菌接种至含卡那霉素的lb培养基中培养，当培养液的光密度od600达到0.5～0.7时，在终浓度为0.1～1.0mm异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)的诱导下，即可高效表达重组羰基还原酶突变体蛋白。
其中，羰基还原酶突变体可以以游离酶、固定化酶以及重组游离细胞的形式催化合成光学活性手性醇。
进一步地，步骤(3)的具体实施步骤如下：
步骤(a)斜面培养：将含羰基还原酶ebsdr8突变体编码基因的重组基因工程菌接种至含50μg/ml卡那霉素的斜面培养基，在37℃培养8～16h，获得斜面菌体。其中，所述斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，1.5％琼脂，溶剂为去离子水，ph7.0。使用前加入50μg/ml卡那霉素。
步骤(b)种子培养：将斜面菌体接种至种子培养基，在37℃培养8～10h，获得种子液。其中，所述种子培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，50μg/ml卡那霉素，溶剂为去离子水，ph7.0。
步骤(c)发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量接种至无菌发酵罐中，37℃发酵培养至od600达到0.5～0.7时，将终浓度为0.1～10mm异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷添加到无菌发酵罐中于26℃下诱导培养。具体地，将种子液以体积浓度10％的接种量接种至无菌的装有18l发酵培养基的30l机械搅拌通风通用式发酵罐中，37℃发酵培养14h后将已灭菌的终浓度为15g/l乳糖分批添加到发酵罐中于26℃下诱导培养。待培养12～24h后od600达到100-150放罐收集湿菌体。所述发酵培养基终浓度组成为：蛋白胨15g/l，酵母粉12g/l，nacl10g/l，甘油15g/l，(nh4)2so45g/l，kh2po41.36g/l，k2hpo4·3h2o2.28g/l，mgso4·7h2o0.375g/l，溶剂为去离子水。
本发明还提供一种羰基还原酶ebsdr8突变体在脂肪族潜手性二酮还原中的应用，脂肪族潜手性二酮为底物(以2，4-戊二酮为例)，以nadh或nadph为辅酶，20～50℃下于ph5.5～10.5的缓冲液构成的转化反应体系中反应，反应完全后，将反应液分离纯化得到相应产物，
进一步地，转化反应体系中，脂肪族潜手性二酮的初始浓度为10～1000mmol/l。转化反应体系中羰基还原酶ebsdr8突变体菌体的质量用量以菌体湿重计的浓度为10～500g/l。转化反应体系中还包括二甲亚砜、异丙醇、甲醇中的一种或多种有机溶剂，优选的为异丙醇，反应体系中异丙醇的浓度为30％。
进一步，反应体系还可添加醇或糖作为辅底物，可以显著提高反应的活力和立体选择性。所述辅底物醇或糖的质量分数为反应体系总质量的1～15％。
进一步，所述转化反应液分离纯化方法为：反应结束后，用等体积的乙酸乙酯萃取，有机层即为含相应手性醇的粗品，将粗品提纯即获得相应手性醇。所述粗品提纯的方法为本领域公知技术，通常为有机溶剂萃取、色谱分离和吸附分离等。
本发明所提供的羰基还原酶ebsdr8突变体与野生型相比较，具有更优良的催化活性。突变体催化合成脂肪族手性二醇的浓度在100～300g/l，转化率达60％～99.9％，产率70％～98％，光学纯度大于99％，具有很好的应用开发前景。
具体实施方式如下：
实施例1：突变体的构建
以含有突变点的寡核苷酸片段为引物
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k160e-r：caacaccatgttccgcagaagtataagc)，进行pcr扩增反应。采用quickchangetm方法((stratagene,lajolla,ca)扩增含有羰基还原酶基因的pet-30a重组质粒。
其中，pcr程序：(1)在98℃下预变性1min；(2)98℃，10s；55℃，10s；72℃，7min进行温度循环，循环20次后冷却至4℃。pcr产物经清洗后，利用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶dpnⅰ进行消化以降解模板质粒。酶切反应体系及条件：17μl经清洗处理的pcr产物，2.0μl10×缓冲液，1.0μl限制性内切酶dpnⅰ，37℃保温1h。
将上述经酶切处理的pcr产物转化至大肠杆菌bl21(de3)中，得到相应的重组大肠杆菌，涂布与含卡那霉素的平板，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落pcr鉴定和测序验证，结果表明含有羰基还原酶突变体基因的重组表达载体成功转化至表达宿主e.colibl21(de3)中。最终获得突变体a97l、k160e和a97l/k160e。核苷酸序列测序结果分别如序列表中seqidno.3、seqidno.5和seqidno.7所示，相应编码蛋白质氨基酸序列如序列表中seqidno.4、seqidno.6和seqidno.8所示。
实施例2：羰基还原酶突变体的诱导表达
将实施例1中构建的工程菌接种至50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃，200rpm培养过夜，再以1％接种量(v/v)接种至含50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃，200rpm培养至菌体浓度od600至0.6左右，加入终浓度为0.1mm的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)，26℃诱导培养6h后，4℃、8000rpm离心10min收集菌体，-80℃储存备用。
实施例3：羰基还原酶突变体的发酵罐培养
将实施例1中构建的工程菌接种至50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃，200rpm培养过夜，再以2％接种量(v/v)接种至含50μg/ml卡那霉素的培养基中，37℃，200rpm培养，在对数中期时以10％接种量(v/v)接种至15l含50μg/ml卡那霉素的发酵培养基的发酵罐中，37℃，培养14h左右(对数中后期)，加入乳糖进行诱导20h后，利用管式离心机离心收集菌体备用。
实施例4：羰基还原酶ebsdr8及突变体a97l/k160e催化高浓度脂肪族潜手性二酮反应体系(10.0ml)：2g实施例3中的湿菌体细胞，底物分别为2,3-丁二酮、2,4-戊二酮、2,5-己二酮、3,7壬二酮等，3ml异丙醇，5.0mlna2hpo4-nah2po4缓冲液(100mm,ph7.5)。于37℃，200rpm条件下反应。重组大肠杆菌全细胞催化明显低于突变体a97l/k160e，底物浓度为300mm反应20hebsdr8重组细胞转化率为2％、10％、23％、0，且ee也不高；突变体a97l/k160e重组细胞产率分别为98％％、75％、97％、90％，且ee值高达99％；当底物浓度达到500mm时，该突变体全细胞仍能有效催化反应进行，反应24h后，转化率分别为95％、66％、90％、80％。特别的对于底物2.4-戊二酮当反应温度达到45℃时转化率更好。
实施例5：羰基还原酶突变体a97l/k160e放大反应体系转化高浓度2,4-戊二酮反应体系(40l)：12kg实施例3中的湿菌体细胞，加入300mm2,4-戊二酮，12l异丙醇，16lna2hpo4-nah2po4缓冲液(100mm，ph7.0)。于45℃，400rpm条件下反应，反应24h后，转化率达到83％，光学纯度>99％，适合于工业化生产。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
附录
序列表
<110>杭州馨海生物科技有限公司
<120>一种羰基还原酶ebsdr8突变体及其构建方法和应用
<130>杭州馨海生物科技有限公司
<141>2018-10-12
<150>2018105588427
<151>2018-06-01
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
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