一种银耳漆酶的分离提纯方法与流程

本发明涉及银耳漆酶技术领域，特别涉及一种银耳漆酶的分离提纯方法。

背景技术：

漆酶是一种来源广泛的多酚氧化酶，漆酶的分子结构中含多个铜原子，催化氧化反应的底物为多种芳香族化合物来，自然界中的多种植物、动物、细菌、真菌都可产漆酶，其中真菌是漆酶产酶的主要来源，并较之其他来源的漆酶，真菌漆酶表现出较高较稳定的氧化能力，漆酶因其可以催化范围丰富的底物而表现出在多领域具有应用潜能，漆酶具有独特的催化特性，作用底物较为广泛，被主要应用于造纸、环境生物修复、生物监测、食品工业等多个领域，并表现出在生物制浆、有毒化合物降解等多个领域的应用潜力，从上世纪中期开始，大量来自植物、细菌和真菌等不同来源的漆酶已经被研究人员进行了分离纯化，但是使用传统的方法进行漆酶分离提纯，所得到的漆酶纯度不高，回收率低，而且漆酶的分泌量低。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种银耳漆酶的分离提纯方法，可以有效解决背景技术中的问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种银耳漆酶的分离提纯方法，包括以下步骤：

步骤一，首先配置液态发酵培养液，在容积为5l的玻璃发酵罐中装入100g银耳菌棒，加入容积为4l的土豆培养基，按1∶200比例加入氮源和无机盐溶液进行混合，并直接向培养基中加入氨苄青霉素溶液，终浓度达到100mg/ml，在27℃的环境中进行静置培养，以6天为培养周期。

步骤二，根据步骤一，然后配置漆酶粗酶液，将银耳菌棒完全浸没在液态发酵培养液中，静置培养，即可得到漆酶粗酶液。

步骤三，根据步骤二，再将得到的漆酶粗酶液进行分离，将在玻璃发酵罐中液态发酵培养的粗酶液取1.5ml，置于10000r/min下离心10min，取上清液测定其酶活力，然后将培养基放置3min，将培养基从发酵罐中放出通过真空泵真空抽滤，去除菌渣等杂质，然后将滤液用冷冻离心机8000r离心10min，所得上清液即为漆酶粗酶液。

步骤四，根据步骤三，漆酶粗酶液提纯，首先进行硫酸铵沉淀，在4℃条件下，向一定量的漆酶粗酶液中加入硫酸铵溶液以分离主要的漆酶蛋白，除去部分杂质。用磷酸-柠檬酸缓冲液对沉淀下来的目的蛋白进行溶解，用含有0.45μm滤膜的抽滤系统对复溶粗酶进一步去除颗粒杂质，之后将进行过抽滤的粗酶液上样到预平过的sephadexg-25排阻层析柱进行脱盐处理。

步骤五，根据步骤四，然后进行层析脱盐，用20mmol/l磷酸-柠檬酸缓冲液进行洗脱，流速控制在10ml/min。

步骤六，根据步骤五，最后进行离子交换层析，将经过脱盐处理的有漆酶活性的部分进行q-sepharosefastflow离子交换层析，将不同的蛋白分离，并且通过以流速为10ml/min不断提高盐浓度进行梯度限行洗脱，将漆酶活性部分提取收集，采用透析的方法去除多余氯化钠，即可得到纯化后的漆酶酶液，并把纯化后的漆酶酶液放入4℃冰箱保存备用。

进一步地，所述步骤二银耳菌棒完全浸没在液态发酵培养液中，静置培养的时间为1天-7天。

进一步地，所述步骤二将银耳菌棒完全浸没在液态发酵培养液中，静置培养的温度为20℃-33℃。

进一步地，所述步骤一液态发酵培养液初始ph为2.0-6.0。

进一步地，所述步骤四、步骤五和步骤六，银耳漆酶粗酶液进行催化氧化反应时的温度为25℃-65℃。

进一步地，所述步骤四、步骤五和步骤六，银耳漆酶粗酶液进行催化氧化反应时最适ph为2.0-5.5。

进一步地，所述步骤四和步骤五，磷酸-柠檬酸缓冲液的ph为3.0-10.0，浓度为20mmol/l。

进一步地，所述步骤四，硫酸铵溶液的饱和度为10％-60％。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：该种发明设计合理，使用方便，非常适合银耳漆酶的分离提纯方法，将银耳菌棒完全浸没在液态发酵培养液中4天，可以提高漆酶的分泌量，银耳菌渣菌棒经过液态发酵产得的漆酶粗酶液进行分离纯化，分别通过硫酸铵分级沉淀法去除杂蛋白、sephadexg-25层析脱盐、q-sepharosefastflow离子交换层析后，得到纯的漆酶，测定纯化倍数28.27，回收率达到28％，通过sds-page凝胶电泳测得银耳漆酶分子量约为63.4kda，有效提高了漆酶纯度，而且增加了漆酶的回收率，简单方便，适合广泛推广。

附图说明

图1为本发明银耳漆酶液态发酵产酶曲线示意图。

图2为本发明温度对银耳漆酶的影响曲线示意图。

图3为本发明ph对银耳漆酶的影响曲线示意图。

图4为本发明硫酸铵分级沉淀的曲线示意图。

图5为本发明温度对银耳漆酶酶活性的影响曲线示意图。

具体实施方式

为使本实用发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

实施例1：

一种银耳漆酶的分离提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，首先配置液态发酵培养液，在容积为5l的玻璃发酵罐中装入100g银耳菌棒，加入容积为4l的土豆培养基，按1∶200比例加入氮源和无机盐溶液进行混合，并直接向培养基中加入氨苄青霉素溶液，终浓度达到100mg/ml，在27℃的环境中进行静置培养，以6天为培养周期。

步骤二，根据步骤一，然后配置漆酶粗酶液，将银耳菌棒完全浸没在液态发酵培养液中，静置培养4天，培养液温度为27℃，即可得到漆酶粗酶液。

步骤三，根据步骤二，再将得到的漆酶粗酶液进行分离，将在玻璃发酵罐中液态发酵培养的粗酶液取1.5ml，置于10000r/min下离心10min，取上清液测定其酶活力，然后将培养基放置3min，将培养基从发酵罐中放出通过真空泵真空抽滤，去除菌渣等杂质，然后将滤液用冷冻离心机8000r离心10min，所得上清液即为漆酶粗酶液。

步骤四，根据步骤三，漆酶粗酶液提纯，首先进行硫酸铵沉淀，在4℃条件下，向一定量的漆酶粗酶液中加入硫酸铵溶液以分离主要的漆酶蛋白，除去部分杂质。用磷酸-柠檬酸缓冲液对沉淀下来的目的蛋白进行溶解，用含有0.45μm滤膜的抽滤系统对复溶粗酶进一步去除颗粒杂质，之后将进行过抽滤的粗酶液上样到预平过的sephadexg-25排阻层析柱进行脱盐处理。

步骤五，根据步骤四，然后进行层析脱盐，用20mmol/l磷酸-柠檬酸缓冲液进行洗脱，流速控制在10ml/min。

步骤六，根据步骤五，最后进行离子交换层析，将经过脱盐处理的有漆酶活性的部分进行q-sepharosefastflow离子交换层析，将不同的蛋白分离，并且通过以流速为10ml/min不断提高盐浓度进行梯度限行洗脱，将漆酶活性部分提取收集，采用透析的方法去除多余氯化钠，即可得到纯化后的漆酶酶液，并把纯化后的漆酶酶液放入4℃冰箱保存备用。

由实施例1可得，如图1-2所示漆酶产量随着时间延长，先上升后不断下降，第2天漆酶的分泌速率达到最大，上升到第4天产量达到峰值并稳定维持，第4天之后漆酶产量及酶活开始下降，从图中可以看出第4天是产酶高峰，酶活相对最高，但很快酶活就开始下降，本实验选取4天作为银耳菌渣菌棒的液态发酵周期，以在获得较高漆酶产量的同时，缩短发酵产酶的时间，银耳的合适产酶温度为27℃，接近于常温，实验室的室温也通常维持在27℃，因此优化选择27℃条件下进行液态发酵。

实施例2：

一种银耳漆酶的分离提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，首先配置液态发酵培养液，在容积为5l的玻璃发酵罐中装入100g银耳菌棒，加入容积为4l的土豆培养基，按1∶200比例加入氮源和无机盐溶液进行混合，并直接向培养基中加入氨苄青霉素溶液，终浓度达到100mg/ml，在27℃的环境中进行静置培养，培养液的ph值为5.0，以6天为培养周期。

步骤二，然后配置漆酶粗酶液，将银耳菌棒完全浸没在液态发酵培养液中，静置培养，即可得到漆酶粗酶液。

步骤三，再将得到的漆酶粗酶液进行分离，将在玻璃发酵罐中液态发酵培养的粗酶液取1.5ml，置于10000r/min下离心10min，取上清液测定其酶活力，然后将培养基放置3min，将培养基从发酵罐中放出通过真空泵真空抽滤，去除菌渣等杂质，然后将滤液用冷冻离心机8000r离心10min，所得上清液即为漆酶粗酶液。

步骤四，漆酶粗酶液提纯，首先进行硫酸铵沉淀，在4℃条件下，向一定量的漆酶粗酶液中加入硫酸铵溶液以分离主要的漆酶蛋白，除去部分杂质。用磷酸-柠檬酸缓冲液对沉淀下来的目的蛋白进行溶解，用含有0.45μm滤膜的抽滤系统对复溶粗酶进一步去除颗粒杂质，之后将进行过抽滤的粗酶液上样到预平过的sephadexg-25排阻层析柱进行脱盐处理。

步骤五，然后进行层析脱盐，用20mmol/l磷酸-柠檬酸缓冲液进行洗脱，流速控制在10ml/min。

步骤六，最后进行离子交换层析，将经过脱盐处理的有漆酶活性的部分进行q-sepharosefastflow离子交换层析，将不同的蛋白分离，并且通过以流速为10ml/min不断提高盐浓度进行梯度限行洗脱，将漆酶活性部分提取收集，采用透析的方法去除多余氯化钠，即可得到纯化后的漆酶酶液，并把纯化后的漆酶酶液放入4℃冰箱保存备用。

由实施例1-2可得，如图3所示因此优化选择27℃条件下进行液态发酵，银耳的最佳产酶ph为5，及银耳在弱酸性环境中能够高效合成漆酶。

实施例3

一种银耳漆酶的分离提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，首先配置液态发酵培养液，在容积为5l的玻璃发酵罐中装入100g银耳菌棒，加入容积为4l的土豆培养基，按1∶200比例加入氮源和无机盐溶液进行混合，并直接向培养基中加入氨苄青霉素溶液，终浓度达到100mg/ml，在27℃的环境中进行静置培养，以6天为培养周期。

步骤二，然后配置漆酶粗酶液，将银耳菌棒完全浸没在液态发酵培养液中，静置培养，即可得到漆酶粗酶液。

步骤三，再将得到的漆酶粗酶液进行分离，将在玻璃发酵罐中液态发酵培养的粗酶液取1.5ml，置于10000r/min下离心10min，取上清液测定其酶活力，然后将培养基放置3min，将培养基从发酵罐中放出通过真空泵真空抽滤，去除菌渣等杂质，然后将滤液用冷冻离心机8000r离心10min，所得上清液即为漆酶粗酶液。

步骤四，漆酶粗酶液提纯，首先进行硫酸铵沉淀，在4℃条件下，向一定量的漆酶粗酶液中加入硫酸铵溶液以分离主要的漆酶蛋白，除去部分杂质。用饱和度为40％-60％的磷酸-柠檬酸缓冲液，ph值为6.0，对沉淀下来的目的蛋白进行溶解，用含有0.45μm滤膜的抽滤系统对复溶粗酶进一步去除颗粒杂质，之后将进行过抽滤的粗酶液上样到预平过的sephadexg-25排阻层析柱进行脱盐处理。

步骤五，然后进行层析脱盐，用20mmol/l磷酸-柠檬酸缓冲液进行洗脱，流速控制在10ml/min。

步骤六，最后进行离子交换层析，将经过脱盐处理的有漆酶活性的部分进行q-sepharosefastflow离子交换层析，将不同的蛋白分离，并且通过以流速为10ml/min不断提高盐浓度进行梯度限行洗脱，将漆酶活性部分提取收集，采用透析的方法去除多余氯化钠，即可得到纯化后的漆酶酶液，并把纯化后的漆酶酶液放入4℃冰箱保存备用。

由实施例3可得，如图4所示，在硫酸铵饱和度低于40％的范围内，上清液的漆酶酶活略有轻微下降但基本保持不变，说明此时漆酶还没有被完全析出，当硫酸铵饱和度达到60％时，上清液中漆酶酶活急剧下降至近乎为零，说明此时大部分漆酶已被析出，并确定硫酸铵的沉淀方法，用40％饱和度硫酸铵去除杂蛋白，收集40％-60％硫酸铵饱和度的沉淀，用少量20mmol/lph6.0的柠檬酸-磷酸缓冲液溶解沉淀，将复溶的粗酶用含有0.45μm滤膜的抽滤系统去除颗粒杂质，将粗酶液初步纯化。

实施例4：

一种银耳漆酶的分离提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，首先配置液态发酵培养液，在容积为5l的玻璃发酵罐中装入100g银耳菌棒，加入容积为4l的土豆培养基，按1∶200比例加入氮源和无机盐溶液进行混合，并直接向培养基中加入氨苄青霉素溶液，终浓度达到100mg/ml，在27℃的环境中进行静置培养，以6天为培养周期。

步骤二，然后配置漆酶粗酶液，将银耳菌棒完全浸没在液态发酵培养液中，静置培养，即可得到漆酶粗酶液。

步骤三，再将得到的漆酶粗酶液进行分离，将在玻璃发酵罐中液态发酵培养的粗酶液取1.5ml，置于10000r/min下离心10min，取上清液测定其酶活力，然后将培养基放置3min，将培养基从发酵罐中放出通过真空泵真空抽滤，去除菌渣等杂质，然后将滤液用冷冻离心机8000r离心10min，所得上清液即为漆酶粗酶液。

步骤四，漆酶粗酶液提纯，首先进行硫酸铵沉淀，在4℃条件下，向一定量的漆酶粗酶液中加入硫酸铵溶液以分离主要的漆酶蛋白，除去部分杂质。用磷酸-柠檬酸缓冲液对沉淀下来的目的蛋白进行溶解，用含有0.45μm滤膜的抽滤系统对复溶粗酶进一步去除颗粒杂质，之后将进行过抽滤的粗酶液上样到预平过的sephadexg-25排阻层析柱进行脱盐处理，此时银耳漆酶粗酶液进行催化氧化反应时的温度为60℃。

步骤五，然后进行层析脱盐，用20mmol/l磷酸-柠檬酸缓冲液进行洗脱，流速控制在10ml/min，此时银耳漆酶粗酶液进行催化氧化反应时的温度为60℃。

步骤六，最后进行离子交换层析，将经过脱盐处理的有漆酶活性的部分进行q-sepharosefastflow离子交换层析，将不同的蛋白分离，并且通过以流速为10ml/min不断提高盐浓度进行梯度限行洗脱，此时银耳漆酶粗酶液进行催化氧化反应时的温度为60℃，将漆酶活性部分提取收集，采用透析的方法去除多余氯化钠，即可得到纯化后的漆酶酶液，并把纯化后的漆酶酶液放入4℃冰箱保存备用。

由实施例4可得，如图5所示温度是影响漆酶催化反应速度的重要影响因素，当反应温度逐渐升高，酶的催化反应速度也会随之上升，当温度上升至一定值时，反应速度也达到峰值，这个温度就是酶的最适反应温度。通过对银耳漆酶的最是反应温度的测定，在30-50℃的温度范围内，漆酶酶活没有表现出明显波动，在60℃时，酶活明显上升并达到峰值，随着温度的继续上升，漆酶酶活开始逐渐下降，所以银耳漆酶的最适温度为60℃。

以上显示描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明在精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。