本发明属于生物化工及分离提纯技术领域，具体涉及一种从发酵液中获得吡咯喹啉醌二钠盐的分离纯化方法。
背景技术：
吡咯喹啉醌(pqq)的化学名是4,5-二氢-4,5-二氧化-1-氢吡咯(2,3f)醌-2,7,9-三羧酸，结构式如下：
pqq是参与氧化还原反应的辅因子，作为许多酶的辅酶，如脱氢酶、氧化酶、水合酶和脱羧酶。pqq含有能直接参与氧化还原反应的邻醌类结构，以上酶蛋白可以催化非磷酸化的底物发生氧化反应，如醇类、醛类和醛糖类。此外，pqq还被认为是继吡啶和核黄素之后的第三类参与氧化还原反应的辅因子。20世纪60年代，人们发现了一类新的能氧化多种一级醇，并以甲基吩嗪硫酸甲酯为最初受氢体的脱氢酶，它们不依赖于已知脱氢酶辅酶或辅基。直到1979年durine才分离得到这个辅酶，随后salisbury通过x射线衍射技术阐明了这种辅酶的结构并命名为吡咯喹啉醌。
pqq广泛存在于原核细胞与真核组织中，例如肺炎克雷伯氏菌、扭脱甲基杆菌、绿脓杆菌、变色多孔菌和漆树等。有趣的是，一些肠道微生物，例如大肠杆菌，不能合成pqq，却能生产以pqq为辅因子的辅蛋白。这种辅酶与假扭脱甲基杆菌、变色多孔菌、绿脓杆菌、不动杆菌属葡萄糖脱氢酶辅酶相同。pqq作为一种具有多种生理功能的生物活性物质，在炎症、溶血性贫血、传输神经兴奋失调、肝病和骨质疏松症等疾病的治疗方面具有很大的潜力，同时在食品、农业方面亦具有广泛的应用前景，值得高度关注。目前，pqq的生产成本仍高居不下，其中一个主要原因在于pqq分离提纯技术还有待发展。
pqq可以通过化学合成法或生物合成法制备得到，其中化学合成法一般以酪氨酸分子作为碳和氮的骨架，通过一个dopaquinone的中间体，经一系列反应得到吡咯并喹啉醌，由于工艺复杂，异构体难以分离、生产成本高等诸多弊端而不常采用。目前，pqq主要采用生物合成法制备获得，主要是利用某些细菌自身能合成pqq的功能，通过发酵提纯的方法获得。pqq广泛存在于革兰阴性菌中，但合成量却有所不同，有些菌只产生痕量pqq供正常的生理代谢需求，如恶臭假单胞菌；还有些菌却能产生过量的pqq，并分泌到胞外。迄今发现的能产生过量pqq的野生菌包括无色杆菌属(achromobacter)、交替单胞菌属(alteromonas)、弯杆菌属(ancylobacter)、生丝微菌属(hy-phomicrobium)、甲烷单胞菌属(methanomonas)、甲基菌属(methy-lobacillus)、甲基单胞菌属(methylomonas)、嗜甲基菌属(methy-lophilus)、甲基杆菌属(methylobacterium)、微环菌属(microcy-clus)、枝动菌属(mycoplana)、假单胞菌属(pseudomonas)、精朊杆菌属(protaminobacter)、原单胞菌属(protomonas)、硫杆菌属(thiobacillus)及黄色杆菌属(xanthobacter)等。采用微生物发酵的方法生产pqq，使用的原始菌种pqq产量在0.07-7mg/l，发酵时间为2-5天左右。因此，与化学合成法相比，人们认为生物学合成方法更具产业化意义。根据报道，目前未经优化或基因改造菌株的pqq较高产量为448-695mg/l，在发酵产物浓度较低的情况下，如何高效的提取分离发酵产物也是提高pqq产量的方法。但是目前现有技术中并没有工艺操作简单、成本低廉，产品回收率和纯度均高的从微生物发酵液中获取pqq的方法。目前常规的pqq提取分离方法为：pqq发酵液→亲水性离子交换剂吸附→低盐溶液洗涤→高盐溶液洗脱→调ph≈2→反相吸附柱(0.75cm3)→70％甲醇洗脱→真空干燥。但该方法仅适合于少量发酵液制备pqq，且仍处在实验室小规模试制阶段，制备的pqq产品价格极其昂贵，高昂的成本极大的限制了pqq的开发应用。
专利文献cn1334084a公开了一种吡咯并喹啉醌的纯化方法，具体操作为，将发酵液上清经煮沸，离心过滤后吸附于fplc-q柱上，并经盐梯度洗脱，收集活性峰就能获得的吡咯喹啉醌，经检测此方法获得的pqq纯度在90％以上，得率为56％。此纯化方法的缺陷在于，离心过滤虽然简便快捷，但很有可能破坏发酵液中的发酵菌，而且需要收集活性峰，不同的实验人员有不同的操作，使得产物的杂质含量不稳定，有时差异很大。因此，此工艺不符合工业批量生产的要求。
专利文献cn105294687a公开了一种离子对双水相萃取分离吡咯喹啉醌的方法，该方法包括：制备含有吡咯喹啉醌的混合液，采用离子对双水相萃取体系对含有吡咯喹啉醌的混合液进行萃取，分离上层，得到富含吡咯喹啉醌的有机层，将富含吡咯喹啉醌的有机层上阴离子交换树脂，依次用双蒸水、稀酸冲洗，收集稀酸部位，冷冻干燥，纯化，得到吡咯喹啉醌。此发明采用四丁基氢氧化铵作为离子对试剂，与pqq结合在一起，使pqq选择性的分配在有机相中，而其他水溶性杂质分配到水相中，从而达到分离纯化pqq的目的。通常情况下，发酵液中除了含有要提取的发酵产物外还含有培养基，微生物以及微生物产生的一些次级代谢产物，仅用有机相和水相就能将pqq与其他物质分离显然是不可行的。因此，此方法仅适合于含有吡咯喹啉醌成分且成分相对简单的混合液，而不适用于含有吡咯喹啉醌的成分复杂的发酵液。
专利文献cn106188042a公开了一种采用分子印迹固相萃取法分离纯化发酵液中吡咯喹啉醌的方法，该方法主要利用吡咯喹啉醌分子印迹聚合物从富含吡咯喹啉醌发酵液中分离纯化得到吡咯喹啉醌。此发明以二氧化硅为基材，吡咯喹啉醌为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，采用热聚合技术制备得到吡咯喹啉醌分子印迹聚合物。吡咯喹啉醌分子印迹聚合物具有较好的特异、选择吸附目标物吡咯喹啉醌的性能，但是以该聚合物为固相萃取填料对目标产物吡咯喹啉醌进行固相萃取的效率取决于制备聚合物时加入的吡咯喹啉醌的量，投入成本较高，而且后续洗脱非常困难，会耗费大量的人力物力。总体而言，此发明所采用的印迹聚合物不适用于大批量的工业生产。
专利文献cn104892597a公开了一种络合萃取法分离纯化发酵液中的吡咯喹啉醌，它的步骤如下：(1)将菌种发酵，得到发酵液；(2)发酵液经高速离心，将上清液在双溶质萃取体系进行络合萃取，其中三辛胺为络合剂，正己烷为稀释剂，得到富含吡咯喹啉醌的上层液；(3)将富含吡咯喹啉醌的上层液用氨水反萃，氨水层减压浓缩后，冷冻干燥，得到吡咯喹啉醌粗品；(4)将吡咯喹啉醌粗品用超纯水溶解，用hcl将ph调至3～4后，加入乙醇，在20～25℃下搅拌5～6h，然后静置12-24h，得到吡咯喹啉醌。此发明先用三辛胺使其与吡咯喹啉醌络合，再解络合，虽然原理看似正确，但是在吡咯喹啉醌进行上述化学反应时对其本身的稳定性也造成了一定的威胁，而且在络合和反萃的过程中，向体系中又引入了新物质，对提取高纯度的吡咯喹啉醌产生阻碍。
专利文献cn1329004a公开了一种提取pqq的方法，将pqq发酵液用亲水性阴离子交换剂吸附后，经洗涤、洗脱，真空浓缩干燥得到pqq粗品，再经重结晶，除去粗品中70％以上的盐份；接着上seppakc18柱反相吸附柱，用含5％吡啶的乙醇流过一倍柱体积，随之用70％甲醇溶液洗脱，使回收率提高约30％左右。降低成本30－40％。该技术对于现有的提取方法基本没什么改进，仅适合于少量发酵液制备pqq，实验室小规模制备时可行的，由于吸附柱成本较高，如果投入规模化生产中无疑会使pqq产品价格昂贵。
专利文献cn107056782a公开了一种甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌的分离纯化方法及其应用。方法包括如下步骤：(1)将发酵液先经大孔树脂富集，再依次经过缓冲液和水进行洗脱，收集洗脱液，得到富含吡咯喹啉醌的富集液；(2)将所述富含吡咯喹啉醌的富集液经亲水性硅胶填料纯化，得到吡咯喹啉醌母液；(3)使所述吡咯喹啉醌母液中的吡咯喹啉醌结晶析出，得到吡咯喹啉醌粗晶体；(4)采用碱溶酸沉法将所述吡咯喹啉醌粗晶体进行重结晶，得到吡咯喹啉醌。此发明将发酵液先经大孔树脂富集，洗脱后用亲水性硅胶填料纯化，再经结晶析出。此技术仍然没有改善提纯步骤复杂，生产成本较大的缺陷。
除了pqq的纯化分离，现有技术中应用较广的吡咯喹啉醌药用盐-吡咯喹啉醌二钠盐的分离纯化也受到越来越多的关注。
专利文献wo2015159236a1公开了吡咯喹啉醌二钠盐的多种晶型，但说明书中并没有涉及从发酵液中的提取步骤，因此也没有就提取分离做任何改进。专利文献wo2017050171a1公开了吡咯并喹啉醌钠盐的晶型及其制备方法，实施例中涉及由吡咯喹啉醌三钠盐向二钠盐转化的过程，全部技术方案也没有涉及吡咯喹啉醌钠盐的提取分离过程。专利文献cn102471336a公开了吡咯并喹啉醌的钠盐结晶的方法，具体的如，在水中使吡咯喹啉醌三钠盐溶解和/或悬浊，在该溶液和/或悬浊液中加入水溶性有机溶剂，使其达到10-90(v/v)％的浓度之后，将ph调整至2-5使其结晶，形成吡咯喹啉醌二钠盐。专利文献cn102942567a公开了吡咯喹啉醌二钠盐的两种晶型及制备方法，制备过程包括混悬结晶法、缓慢挥发法和反溶剂沉淀结晶法。专利文献cn103619842a公开了吡咯喹啉醌二钠盐的结晶及其制造方法，更多的是对吡咯喹啉醌二钠盐晶型的研究，没有分离提取的优化。
另外，cn201710360995.6提供了一种简单适合大规模生产的制造吡咯喹啉醌单钠盐晶体及其制备方法，所述吡咯喹啉醌单钠的制备方法包括溶解吡咯喹啉醌游离态或其碱金属盐，调节ph至2.0-3.0，加入低浓度盐进行盐析，以得到吡咯喹啉醌单钠盐高纯度结晶。cn201710497024.6提供一种简单适合大规模生产的吡咯喹啉醌二钠盐晶体及其制备方法，所述吡咯喹啉醌二钠盐晶体的制备方法包括将含有吡咯喹啉醌游离态或其碱金属盐的水溶液的ph调节至7.5-8.5，然后加入酸调节ph至3.0-4.0，通过脱盐、结晶、干燥得到吡咯喹啉醌二钠盐晶体。
上述关于吡咯喹啉醌钠盐的现有技术均为从吡咯喹啉醌制备钠盐，没有涉及到从发酵液中进行高纯度分离提取的描述，因此，在面对成分复杂的发酵液时，现有技术难以从其中直接分离得到吡咯喹啉醌二钠盐。因此，基于发酵液原料，开发工艺操作相对简单、成本低廉，容易控制，产品收率和纯度较高的吡咯喹啉醌二钠盐的大规模提取分离技术具有重要的应用价值和市场价值。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于发酵原料的吡咯喹啉醌二钠盐的分离纯化方法，所述方法工艺简单，成本较低，产品回收率和纯度较高，适合工业化生产。
第一个方面，本发明技术方案主要步骤如下：
(1)吡咯喹啉醌发酵液第一次过滤，得到吡咯喹啉醌一次滤液；
(2)二次过滤，过滤得到除杂滤液；
(3)吸附除杂：在磁性高分子微球例如导电性磁性高分子微球存在下，提取分离吡咯喹啉醌溶液；
(4)一次盐析，获得吡咯喹啉醌二钠盐粗品；
(5)活性炭脱色，得到脱色滤液；
(6)二次盐析，获得吡咯喹啉醌三钠盐；
(7)调酸，结晶，得到吡咯喹啉醌二钠盐。
进一步地，本发明还包括将所得吡咯喹啉醌二钠盐重结晶以获得高纯度产物。
优选地，本发明所述磁性微球选自聚乙烯醇磁性微球。
本发明上述技术方案各主要流程及相应产品可概括如下：
发酵液→膜过滤→膜滤液→二次过滤→磁性分离→滤液→一次盐析→盐析粗品→粗品溶解→溶解液→脱色→脱色液→二次盐析→二次盐析粗品→二次盐析粗品溶解→调酸结晶→重结晶。
具体地，本发明技术方案详细步骤如下。
一种基于发酵原料液的吡咯喹啉醌二钠盐分离纯化方法，包括如下步骤：
(1)一次过滤：吡咯喹啉醌发酵液通过膜分离技术进行一次过滤，得到吡咯喹啉醌一次滤液。
该步骤中，所用膜可以为本领域常规的微滤膜或超滤膜，具体种类不限。
优选地，控制滤液中吡咯喹啉醌含量在95％以上即可，即控制产物过滤损失在5％以内，更优选3％以内。
(2)二次过滤：取上步得到的一次滤液，用酸调ph至4.0-4.3，除杂，搅拌1-1.5h后过滤，其中，滤膜预涂一层介孔二氧化硅，过滤得到除杂滤液。
该步骤中，所述滤膜选自本领域常规的超滤膜或纳滤膜。
优选地，将上述吡咯喹啉醌发酵液的滤液浓度调整为800-1000mg/l；所述酸可以为硫酸等无机酸。
优选地，过滤结束后用ph＝4.0-4.5的酸水洗涤滤饼，合并入滤液中。
进一步优选地，控制该步骤损失率低于3％。
由于单独的过滤操作往往不可避免地从发酵液中引入了各种小分子杂质，因此即使多次过滤，也不能进一步提高吡咯喹啉醌纯度，因此需要针对吡咯喹啉醌结构特点进一步选择更具有针对性的分离提纯手段。例如吸附分离提取。
(3)吡咯喹啉醌的提取：向上步得到的除杂滤液中滴加浓硫酸，使ph至2.4-3.0，加入聚乙烯醇磁性微球，聚乙烯醇上大量的醇羟基和吡咯喹啉醌发生吸附反应，1-3h后吡咯喹啉醌接枝于磁性微球上，用磁场分离磁性微球；将磁性微球分散在水中，调ph至10-11发生水解反应，1-2h后用磁场分离磁性微球，得到吡咯喹啉醌溶液。
与前两步过滤除杂不同，该步骤通过将吡咯喹啉醌依附于载体使其从溶液中吸附分离出来，从而将大部分的各种小分子杂质留在母液中。
该步骤中，所述的吸附反应包括物理吸附和化学吸附双重吸附，其中物理吸附包括微球表面的大量羟基基团与吡咯喹啉醌分子上的氨基、酮基、羧基等表面基团之间形成的氢键等物理吸附作用，化学吸附包括羟基基团与吡咯喹啉醌分子上的三个羧基基团之间在强酸环境存在下发生的可逆性酯化反应形成酯键。
优选地，为保证吸附效率，吸附反应时间为2-3h，更优选2.5-3h。
该步骤中，所述吸附-水解可在分离后的母液中进一步重复进行若干次，以保证收率，降低损失。
(4)一次盐析：往吡咯喹啉醌溶液中加入无机钠盐或有机钠盐至盐浓度达到1.0-1.5mol/l，用硫酸调ph至2.8-3.8，使之成二钠盐形态析出，搅拌2-3h充分盐析后过滤，过滤结束用ph＝3.0-3.5的酸水洗涤滤饼。
其中，优选采用无机钠盐进行盐析。
在本发明一些实施例中，该步骤所得盐析粗品的色谱纯度可达94％以上，盐析收率可达到96％以上。
(5)活性炭脱色：将一次盐析粗品用纯化水溶解完全，加入溶液重量1-5wt％的活性碳脱色1-1.5h后过滤，得到脱色滤液。
其中，纯化水的用量为恰好溶解盐析粗品或稍微过量。
(6)二次盐析：往脱色滤液中加入无机钠盐或有机钠盐至盐浓度达到1.0-1.5mol/l，用酸调ph至5.0-6.0，使之成三钠盐形态析出，搅拌2-3h充分盐析后过滤，过滤结束用ph＝5.5-6.0的酸水洗涤滤饼。
优选地，用酸调ph至5.5-6.0。
该步骤中，二次盐析粗品的色谱纯度可达到98.5％以上。
(7)结晶：将二次盐析物用40-60％醇溶液溶解，用硫酸调ph至3.0-4.0，搅拌降温结晶8-12h后过滤，得到吡咯喹啉醌二钠盐湿品。
该步骤中，产物色谱纯度可达到纯度99％以上。
优选地，该步骤中，用硫酸调ph至3.0-3.8。
本发明上述方法中，还进一步地包括重结晶的步骤，以使得产物色谱纯度达到纯度99.5％以上。
优选的，所述步骤(2)中介孔二氧化硅的粒径为0.5-1um，介孔二氧化硅可以在过滤前预涂覆一次，也可以在过滤过程中涂覆，优选在使用前涂覆；用量为至少完全覆盖滤膜。
优选的，所述介孔二氧化硅涂层厚度为0.1-2mm。
优选的，所述步骤(2)还包括过滤结束后用ph＝4.0的酸水洗涤滤饼。
本发明所述方法中，步骤(2)中所述的酸为盐酸、硫酸、磷酸、草酸中的一种或两种以上的组合；优选的，所述酸为稀硫酸。
本发明所述方法中，步骤(4)和(6)中所述的无机钠盐选自：氯化钠、硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠；有机钠盐选自：醋酸钠、柠檬酸钠。
优选地，钠盐采用氯化钠。
第二个方面，本发明提供通过上述方法得到的吡咯喹啉醌二钠盐。
第三个方面，本发明提供所述吡咯喹啉醌二钠盐用于制备药物或保健品的用途。
本发明中，所述聚乙烯醇磁性微球同时兼具高分子聚乙烯醇的众多特性和磁性物质的磁响应性，可对外加磁场表现出强烈的磁响应性。聚乙烯醇(pva)具有许多良好的基本性质，毒性很低，无刺激性，pva溶于水且具有很低的表面张力，在制备载体微球中，既可作微球的致孔剂，也可作分散介质。同时聚乙烯醇可以看作是一种带有仲羟基的线型高分子聚合物，分子中的仲羟基具有较高的活性，除了能够与氨基等其他基团形成氢键吸附，还能够进行低醇类的典型化学反应，如酯化反应等。
聚乙烯醇磁性微球可源自商购产品或按照本领域的一般方法制备得到。
本发明中，聚乙烯醇磁性微球的制备方法包括如下步骤：
(1)fe3o4磁流体的制备：在50-60℃下，将一定量的fecl2溶液和fecl3溶液混合加入到三颈瓶中，在分散机搅拌的同时，滴加一定量的naoh溶液，并升温到80-90℃，搅拌，待反应完成后用磁场分离沉淀，蒸馏水反复洗涤至上清液中性，烘干得到黑色粉末状的fe3o4磁流体；
(2)聚乙烯醇磁性微球的制备：用蒸馏水将pva充分溶胀，在80-90℃下搅拌制成9-10％的pva水溶液，将适量的fe3o4磁流体倒入pva溶液中，搅拌混匀，用细胞粉碎机分散后倒入分散介质(油、吐温、正丁醇)中，在一定温度和搅拌条件下搅拌，再依次加入一定量的戊二醛、浓盐酸和海藻酸钠，反应完全后用磁场分离沉淀，依次用酒精和蒸馏水反复洗涤，最终得到聚乙烯醇磁性微球。
在本发明中，通过对发酵液进行常规一次过滤后进行再过滤，并在滤膜上预涂一层介孔二氧化硅，过滤过程中大量的胶体粒子吸附到介孔材料中，起到除杂的作用，同时使滤饼疏松，增大滤速；再向滤液中加入聚乙烯醇磁性微球，磁性微球表面的醇羟基与吡咯喹啉醌发生吸附反应接枝于磁性微球上，将磁性微球分离后在进行水解反应，得到含有吡咯喹啉醌的溶液；最后利用吡咯喹啉醌在不同的ph值条件下形成二钠盐和三钠盐两种形态，采用在不同ph值条件下进行两次盐析除杂的方法来提高吡咯喹啉醌二钠盐的色谱纯度和含量，达到产品质量要求，同时缩短工艺周期。
相比现有技术，本发明工艺操作简单，生产周期短，收率高(75％以上)，纯度高(99％以上)。还可以减少废水排放，降低环保废水处理费用，节省生产成本。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1
聚乙烯醇磁性微球的制备
fe3o4磁流体的制备：在50℃下，将0.5mol/l的fecl2溶液和0.5mol/l的fecl3溶液按1:2体积比加入到三颈瓶中，在分散机搅拌(14000r/min)的同时，滴加摩尔比例量的3mol/lnaoh溶液，并升温到80℃，搅拌40min，待反应完成后用磁场分离沉淀，蒸馏水反复洗涤至上清液中性，烘干得到黑色粉末状的fe3o4磁流体；
聚乙烯醇磁性微球的制备：用蒸馏水将pva充分溶胀，在90℃下搅拌制成9％的pva水溶液，将适量的fe3o4磁流体倒入pva溶液中，搅拌混匀，用细胞粉碎机分散20min后倒入分散介质(油：吐温：正丁醇＝2:1:5)中，在40℃下搅拌6h，再依次加入0.75ml25％的戊二醛、0.1ml的浓盐酸和0.6ml2％海藻酸钠，反应10min后用磁场分离沉淀，依次用50％的酒精和蒸馏水反复洗涤，最终得到聚乙烯醇磁性微球。
实施例2
吡咯喹啉醌二钠盐的制备
s1：将约21l吡咯喹啉醌发酵液通过陶瓷超滤膜分离进行第一次过滤，得到吡咯喹啉醌一次滤液，过滤收率为98.2％；
s2：取上步得到的一次滤液，调整吡咯喹啉醌浓度约为800-850mg/l，用硫酸调ph至4.3，搅拌1h后过滤，过滤之前先在滤膜上预涂覆一层介孔二氧化硅(粒径为600nm，厚度0.3mm)，过滤得到除杂滤液，色谱纯度为83.6％；
s3：向上步得到的除杂滤液中滴加硫酸使ph至2.4，加入实施例1制备的聚乙烯醇磁性微球至3.5wt％，吸附反应3h后吡咯喹啉醌基本接枝于磁性微球上，用磁场分离磁性微球，母液待用；将磁性微球分散在水中，氢氧化钠调ph至11发生水解反应，2h后用磁场分离磁性微球；将磁性微球置于上述母液中重复吸附-水解操作至母液中基本不含吡咯喹啉醌(残留量低于总量1％)，合并得到吡咯喹啉醌溶液，测得吡咯喹啉醌溶液色谱纯度为91.2％；
s4：往上述吡咯喹啉醌溶液中加入氯化钠至氯化钠浓度达到1.5mol/l，用硫酸调ph至3.5，使之成二钠盐形态析出，搅拌3h充分盐析后过滤，过滤结束用ph＝3.0的酸水洗涤滤饼，一次盐析粗品的色谱纯度为94.7％，盐析收率约为96％；
s5：将上述一次盐析粗品用纯化水恰好溶解，加入溶液5％重量的活性碳脱色1h后过滤，得到脱色滤液，脱色滤液色谱纯度为96.3％，脱色收率约为97％；
s6：往脱色滤液中加入氯化钠至氯化钠浓度达到1.3mol/l，用硫酸调ph至6.0，使之成三钠盐形态析出，搅拌2h充分盐析后过滤，过滤结束用ph＝5.5的酸水洗涤滤饼，二次盐析粗品的色谱纯度为98.5％；
s7：室温下将二次盐析物用60％乙醇溶液恰好溶解，用硫酸调ph至3.5，搅拌降温结晶12h后过滤，得到棕红色的吡咯喹啉醌二钠盐产品，测得hplc纯度为99.0％；
最终吡咯喹啉醌二钠盐产品总收率为76.6％，产品的色谱纯度为99.0％，符合吡咯喹啉醌二钠盐产品工业标准质量要求。
实施例3
吡咯喹啉醌二钠盐的制备
s1：将吡咯喹啉醌发酵液通过陶瓷膜分离技术进行一次过滤，得到吡咯喹啉醌一次滤液，过滤收率为98％；
s2：取上步得到的一次滤液，用硫酸调ph至4.3，除杂，搅拌1h后过滤，过滤之前先在滤膜上预涂一层介孔二氧化硅(粒径为0.6-0.7um)，过滤过程中分批加入介孔二氧化硅，至过滤完成共加入3次(总用量同实施例1)，得到除杂滤液，色谱纯度为86.1％；
s3：向上步得到的除杂滤液中滴加硫酸，使ph至2.4，加入实施例1制备的聚乙烯醇磁性微球5wt％，吸附反应3h后吡咯喹啉醌接枝于磁性微球上，用磁场分离磁性微球；将磁性微球分散在水中，调ph至11发生水解反应，2h后用磁场分离磁性微球，将磁性微球置于上述母液中重复上吸附-水解操作至母液中基本不含吡咯喹啉醌，得到吡咯喹啉醌溶液，吡咯喹啉醌溶液色谱纯度为92.2％；
s4：往吡咯喹啉醌溶液中加入氯化钠至氯化钠浓度达到1.5mol/l，用硫酸调ph至3.8，使之成二钠盐形态析出，搅拌3h充分盐析后过滤，过滤结束用ph＝3.0的酸水洗涤滤饼，一次盐析粗品的色谱纯度为95.2％；
s5：室温下将一次盐析粗品用纯化水恰好溶解，加入5wt％重量的活性碳脱色1h后过滤，得到脱色滤液，脱色滤液色谱纯度为97.3％，脱色收率约为96％；
s6：往脱色滤液中加入氯化钠至氯化钠浓度达到1.3mol/l，用硫酸调ph至6.0，使之成三钠盐形态析出，搅拌2h充分盐析后过滤，过滤结束用ph＝5.5的酸水洗涤滤饼，二次盐析粗品的色谱纯度为98.9％；
s7：将二次盐析物用60％乙醇溶液溶解，用硫酸调ph至3.5，搅拌降温结晶12h后过滤，得到吡咯喹啉醌二钠盐，重结晶，干燥，得到产品纯度为99.6％；
最终吡咯喹啉醌二钠盐产品总收率为78.3％，产品的色谱纯度为99.6％，符合工业用品标准要求。
对比实施例1
吡咯喹啉醌二钠盐的制备
s1：将吡咯喹啉醌发酵液通过膜分离技术进行一次过滤，得到吡咯喹啉醌一次滤液，过滤收率为98％；
s2：取上步得到的一次滤液，用硫酸调ph至4.3，除杂，搅拌1h后过滤，过滤得到除杂滤液，色谱纯度为74.5％；
s3：往除杂滤液中加入氯化钠至氯化钠浓度达到1.5mol/l，用硫酸调ph至3.8，使之成二钠盐形态析出，搅拌3h充分盐析后过滤，过滤结束用ph＝3.0的酸水洗涤滤饼，一次盐析粗品的色谱纯度为82.1％；
s4：将一次盐析粗品用纯化水溶解，加入5％重量的活性碳脱色1h后过滤，得到脱色滤液，脱色滤液色谱纯度为85.3％；
s5：往脱色滤液中加入氯化钠至氯化钠浓度达到1.3mol/l，用硫酸调ph至6.0，使之成三钠盐形态析出，搅拌2h充分盐析后过滤，过滤结束用ph＝5.5的酸水洗涤滤饼，二次盐析粗品的色谱纯度为87.7％，盐析收率为91％；
s6：将二次盐析物用60％乙醇溶液溶解，用硫酸调ph至3.5，搅拌降温结晶12h后过滤，得到吡咯喹啉醌二钠盐的湿品，湿品纯度为92.3％；
最终吡咯喹啉醌二钠盐产品总收率为62.1％，产品的色谱纯度为92.3％。
对比实施例2
吡咯喹啉醌二钠盐的制备
s1：将吡咯喹啉醌发酵液通过膜分离技术进行一次过滤，得到吡咯喹啉醌一次滤液，过滤收率约为98％；
s2：取上步得到的一次滤液，用硫酸调ph至4.3，除杂，搅拌1h后过滤，过滤之前先在滤膜上预涂一层介孔二氧化硅(粒径为0.6-0.7um)，过滤得到除杂滤液，色谱纯度为83.3％；
s3：向上步得到的除杂滤液中滴加浓硫酸，使ph至2.4，加入实施例1制备的聚乙烯醇磁性微球，3h后吡咯喹啉醌接枝于磁性微球上，用磁场分离磁性微球；将磁性微球分散在水中，调ph至11发生水解反应，2h后用磁场分离磁性微球，得到吡咯喹啉醌溶液，吡咯喹啉醌溶液色谱纯度为90.1％；
s4：往吡咯喹啉醌溶液中加入氯化钠至氯化钠浓度达到1.5mol/l，用硫酸调ph至3.8，使之成二钠盐形态析出，搅拌3h充分盐析后过滤，过滤结束用ph＝3.0的酸水洗涤滤饼，此时吡咯喹啉醌二钠盐的色谱纯度为93.5％；
最终吡咯喹啉醌二钠盐产品总收率为74％，产品的色谱纯度为93.5％。
分析上述实施例可以看出，对一次滤液进行二次过滤时，在滤膜上预涂覆介孔二氧化硅能起到进一步除杂的效果，产品色谱纯度提升显著，如果过滤时间隔涂覆介孔二氧化硅，除杂效果更好，这可能是由于在滤饼中间形成间隔性二氧化硅层的原因。利用聚乙烯醇磁性微球与滤液中的吡咯喹啉醌发生吸附反应接枝，分离磁性微球，水解，释放吡咯喹啉醌是本发明中提纯吡咯喹啉醌的关键步骤，能显著的使得纯度有明显提高。再进行一次盐析形成吡咯喹啉醌二钠盐，但是此时的二钠盐纯度并不高，脱色处理后进行二次盐析，形成吡咯喹啉醌三钠盐，再通过控制溶液ph制备得到吡咯喹啉醌二钠盐，此时二钠盐的纯度很高，可达到99.5％以上，总体产品收率较高，符合产品质量要求，适合大规模工业生产。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。